Imagem celular usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total

Comece com uma configuração de microscópio de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) com uma câmara de imagem coberta contendo uma lamínula de vidro com células de neuroblastoma humano aderidas em um tampão.

Essas células expressam fluoróforos específicos das membranas das vesículas sinápticas.

No modo de epifluorescência, selecione uma célula para imagem.

No modo TIRF, através da objetiva, direcione um laser para a amostra, aparecendo como um ponto na tampa.

Ajuste o ângulo para exceder o ângulo crítico na interface entre a lamínula de vidro de alto índice de refração e a amostra de índice de refração mais baixo, causando reflexão interna total (TIR), vista como uma linha fina.

O TIR gera uma onda evanescente que excita os fluoróforos na membrana mais próxima.

A fluorescência emitida é coletada pela objetiva e capturada por uma câmera.

Ajuste fino para obter uma imagem de alto contraste da membrana celular perto da lamínula.

Otimize as configurações de aquisição para minimizar o fotobranqueamento e definir a frequência de amostragem.

Comece a imagem TIRF para visualizar vesículas sinápticas fundidas.

No modo de epifluorescência, concentre-se na lamínula e escolha as células transfectadas colocadas no centro da câmara. Sob o controle do software, mude para a iluminação do gramado no modo ao vivo. Para definir a configuração do gramado, verifique a posição da viga que emerge da objetiva na cobertura da amostra. Quando o feixe é posicionado no centro da lente objetiva, um ponto é visível no centro da cobertura da amostra de grama e a célula é visualizada no modo de epifluorescência.

Para alcançar o ângulo crítico, mova o ponto focado na direção Y usando o parafuso de ajuste de ângulo no controle deslizante de grama. Quando o feixe converge no plano da amostra em um ângulo maior que o ângulo crítico, a mancha desaparece e uma linha reta, fina e focada é evidente no meio da cobertura da amostra. Para ajustar o ângulo do gramado, use uma amostra de célula.

Assista à imagem de fluorescência no vídeo. Nesta fase, uma imagem semelhante à epifluorescência ainda é visível. Mova suavemente o parafuso até que a condição do gramado seja alcançada. Aqui, apenas um plano óptico da célula está em foco, resultando em uma imagem plana com alto contraste.

Para realizar imagens de amostra, defina o experimento de lapso de tempo de canal único. Os tempos de exposição apropriados estão entre 40 e 80 milissegundos. Adquira imagens com frequência de amostragem de 1 ou 2 Hertz.