Выделение Рибосома связанных стадии становления Полипептиды В пробирке, Чтобы определить Поступательное сайтов Пауза Наряду мРНК

Общая цель этой процедуры заключается в идентификации и локализации основных сайтов трансляционной паузы для мРНК, транслируемой в системе бесклеточной трансляции. Это достигается путем предварительного клонирования интересующего гена под контролем промотора транскрипции T 7. Затем мРНК транскрибируется и очищается.

Затем в присутствии мРНК и радиоактивных аминокислот проводится трансляция in vitro для мечения синтезированного белка и зарождающихся полипептидов. Наконец, полисомы выделяют с помощью центрифугирования со скоростью осаждения, а изолированные зарождающиеся цепи разрешают гель-электрофорезом. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают зарождающиеся полипептиды различной длины с помощью страницы Tristine SDS и авторадиографии, что указывает на наличие сайтов паузы вдоль интересующей мРНК.

Основное преимущество этой методики среди наших существующих методов, таких как микрококальный анализ защиты ядер, заключается в том, что она чрезвычайно проста, быстра и эффективна, а также позволяет определить и идентифицировать основные сайты трансляции вдоль любой МНК в данной системе клеточного риска. Этот метод может помочь ответить на некоторые ключевые вопросы в области трансляции и трансляционного сворачивания белка, такие как факторы здоровья, такие как использование колбочек, обилие ТНК и/или вторичная структура мРНК, которые могут влиять на кинетику трансляции. Этот метод может еще больше помочь нам понять взаимосвязь между кинетикой трансляции и ключевыми этапами в пути сворачивания белка трансляции кода.

Применение этого метода распространяется на понимание процесса сворачивания белка in vivo, который, как считается, происходит сотрансляционно во время трансляции на рибосоме, хотя настоящее исследование включает бесклеточную трансляцию кристаллического гамма-би с использованием коммерчески доступного клеточного экстракта. Этот метод также может быть применен для идентификации трансляционного IDE в потенциально любом белке с использованием трансляционного компетентного экстракта, полученного из любого клеточного источника. Как правило, люди, не знакомые с этим методом, будут испытывать трудности на двух ключевых этапах протокола.

Первый из них заключается в установлении общего времени, необходимого для запуска реакции трансляции, что обеспечит сохранение связи большинства зарождающихся полипептидов с рибосомой. И второй – это поиск подходящей справедливой системы для разрешения большинства зарождающихся полипептидов, выбор справедливой системы зависит от размера исследуемого белка. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы решили посмотреть на кинетику трансляционных молекул глобина еще в середине восьмидесятых годов в связи с предложенной моделью трансляционного сворачивания глобина COT.

Неоднородность трансляции глобина была впервые замечена PRO и Морисом в 1974 году при использовании окклюзионной хроматографии CLO глобина NAS и цепей. Тем не менее, их анализ не обладал желаемой точностью Pro, и более того, наблюдались четыре основных узла трансляции во время трансляции глобина. Впоследствии проведенный нами анализ позволил выявить около 10 дополнительных энергетических сайтов и построить детальную модель сворачивания трансляционного глобина. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как описанная здесь методика предполагает выделение полисомы и анализ зарождающегося полипептида с использованием геля-страницы Tri S Ds.

Оба эти шага имеют решающее значение для получения высококачественных и воспроизводимых результатов. Демонстрировать прогель будет аспирант из лаборатории Myelo Sujata For in vitro транскрипция матричной РНК. Начните с представляющего интерес гена, который был клонирован под промотором T 7 и/или SP 6 с использованием соответствующего фермента линеариза, матрицы ДНК ниже стоп-кодона и/или MR NA 3 основного конечного субъекта.

Образец рестрикционного расщепления для проведения электрофореза в геле для проверки того, что ДНК полностью линеаризована. После определения оптимальной концентрации матрицы ДНК используйте набор для транскрипции матричной РНК in vitro в соответствии с инструкциями производителя. Затем используйте осаждение хлорида лития для очистки мРНК.

Затем используйте акриламид или гель Арос, чтобы проверить его чистоту. Приготовьте реакцию трансляции in vitro объемом 100 микролитров в воде, свободной от нуклеаз, добавив смесь аминокислот в один миллимоляр за вычетом метионина, 10 единиц ингибитора РНК, 20 микрокюри радиоактивного метионина 35 с и лизат ретикулоцитов кролика. Далее прогрейте реакцию, инкубировав ее при температуре 30 градусов Цельсия в течение пяти минут.

Затем добавьте два микрограмма мРНК и инкубируйте при температуре 30 градусов Цельсия в течение пяти минут, чтобы остановить реакцию, поместите ее на лед, чтобы выделить зарождающиеся полипептиды, связанные с рибосомами. Нанесите слой реакции трансляции поверх 4,5 миллилитров 30%-ного глицеринового интереса HCL pH 7,6 с хлоридом калия и хлоридом магния с помощью роторной центрифуги TLA 110 при 100 000 G в течение одного часа при градусах Цельсия. Далее осторожно удаляют надосадочную жидкость, затем ресуспендируют полисомальную гранулу, содержащую зарождающиеся полипептиды в небольшом объеме в один миллимолярный трис, буфер HCL pH 7,6, содержащий 0,5 миллиграмм на миллилитр рибонуклеазы А и инкубируют в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия.

Чтобы усилить гидролиз пептида, свяжите TRNA Esther, добавьте в реакцию гидроксид натрия в конечной концентрации 10 миллимоляров и инкубируйте его еще 30 минут. Устраните зарождающиеся полипептиды на странице tris tri SDS, затем закрепите и высушите гели. Подвергнуть гели авторентгенографии с последующей фосфовизуализацией для обнаружения зарождающихся полипептидов.

Измененное движение рибосом, вызванное изменениями в пуле TRNA, должно привести к изменениям в распределении размеров зарождающихся полипептидов, накапливающихся во время трансляции, а также их относительных интенсивностей, которые отражают продолжительность паузы здесь. Зарождающиеся полипептиды для кристаллического белка гамма-В были выделены и разрешены с помощью страницы Tristine SDS. Неодинаковые длины и интенсивности полипептидов в системах RRL и e. coli указывают на то, что движение рибосом вдоль мРНК в этих двух системах следует разной кинетике трансляции.

Например, обратите внимание на заметную полосу в 17,7 килодальтон в лизате кишечной палочки, отсутствующую в системе лизата ретикулоцитов кролика. Кристаллическая гамма B содержит тандемные кодоны аргинина, которые часто встречаются в системах млекопитающих, но известны как чрезвычайно редкие и медленно транслируются в кишечную палочку, что позволяет предположить, что эта полоса вызвана рибосомой. Остановимся на этих тандемных редких кодонах, как показано здесь.

При отсутствии мРНК полос не наблюдается, а лечение пур-мицином удаляет большую часть зарождающихся цепей из полисом. Кроме того, длительное лечение пур-мицином удаляет все зарождающиеся цепи, подтверждая, что наблюдаемые полипептидные продукты являются рибосомами, ассоциированными с зарождающимися цепями, а не совместными с полисомами MRP. Продолжительность процедуры в основном зависит от длительности этапа центрифугирования и этапа электрофореза зарождающегося пептидного геля.

При попытке выполнить эту процедуру важно остановить реакцию на трансляцию сразу после инкубации. Чтобы избежать высвобождения зарождающегося полипептида из рибосомы, очевидно, крайне важно избегать РНК на любом этапе. Контаминация РНК может повлиять на эффективность трансляции экстракта и привести к высвобождению зарождающегося полипептида из рибосомы После этой процедуры.

Другие цели, такие как, например, влияние белков, связывающих мРНК, на эффективность движения рибосом по данному сообщению, также могут быть проверены после его разработки. Этот метод проложил путь исследователям в области сворачивания белка к изучению роли позирования трансляции из-за наличия редких кодов в сворачивании трансляционного белка. Этот метод ранее использовался для проверки роли каонных замен в движении рибосом, на сообщении и трансляционном сворачивании белка.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как идентифицировать сайты трансляционной силы, представленные мРНК, путем выделения зарождающегося полипептида, связанного с рибосомой. Не стоит забывать, что работа с радиоактивными изотопами и мечеными минорными кислотами, такими как, например, метионин А 35, требует особых мер предосторожности и всегда должна учитываться при выполнении этой процедуры.