Количественные иммунофлюоресценции для измерения глобального локализованный перевод

Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы визуализировать и количественно оценить секпартментализированные события трансляции, происходящие на начальных этапах клеточной адгезии. Этот метод имеет широкое применение. Используйте его всякий раз, когда может быть проведен анализ быстрой специфической реакции на трансляцию, например, при анализе миграции клеток, адгезии или раннего ответа на лекарственные препараты.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что она проста, быстра и экономична. Для этого требуется только пуромицин, антитела, направленные против пуромицина, и стандартная система визуализации с помощью конфокального сканирования. Для начала делают суспензию из клеток МРК-5.

Используют трипсинизацию с последующим центрифугированием, удалением надосадочной жидкости, затем ресуспендированием в DMEM с десятипроцентным FBS, при концентрации 40 тысяч клеток на миллилитр. Инкубируйте суспензию с мягким вращением в течение 20 минут для полной диссоциации очаговых адгезионных комплексов. Это очень важно.

Затем в две 35-миллиметровые чашки со стеклянным дном добавьте две миллилитровые аликвотные суспензии и инкубируйте их, чтобы обеспечить клеточную адгезию и образование SiC. Через 40 минут обработайте циклогексимидом одну тарелку, и верните ее в инкубатор. Эта пластина будет функционировать как отрицательный контроль.

Через 55 минут нанесите пуромицин на обе пластины в заданной концентрации, и выдержите пластины еще пять минут. После одного часа посева и пяти минут пуромицина в кооперации дважды промойте каждую пластину двумя миллилитрами ледяного PBS. Затем зафиксируйте клетки одним миллилитром четырехпроцентного формальдегида в PBS на 15 минут при комнатной температуре.

После фиксации клетки трижды промыть PBS, затем пермеабелизировать клетки с помощью 500 микролитров 0,5-процентного тритона X-100 в PBS в течение 20 минут при комнатной температуре. Далее трижды промойте пластины PBS, а затем внесите 500 микролитров однопроцентного BSA в PBS. Продолжайте инкубацию при комнатной температуре еще 20 минут.

Чтобы удалить избыток БСА, промойте клетки три раза 0,1% Tween-20 в PBS. Теперь инкубируйте клетки с 300 микролитрами антител против пуромицина. Удалите несвязанное антитело с помощью трех промывок с 0,1% Tween-20.

Далее нанесите триста микролитров смеси двух флуорофор-конъюгированных вторичных антител для визуализации пуромиколированных полипептидов и де-фактем. Инкубируйте клетки в течение часа при комнатной температуре в темноте. Через час трижды промойте пластины для удаления несвязанных антител и затем нанесите триста микролитров 0,1-процентного раствора Твин-20, дополненного DAPI.

Дайте DAPI побыть в камерах в течение пяти минут при комнатной температуре. Наконец, промойте клетки еще четыре раза, закончив промывкой в чистом PBS. Затем храните клетки в двух миллилитрах PBS для визуализации.

Используя любую коммерчески доступную систему конфокальной визуализации, сначала определите подходящие настройки, которые максимизируют динамический диапазон для количественной оценки. Фокус на количественной оценке может быть достигнут только в том случае, если избежать насыщения пикового размера и правильно отрегулировать концентрацию. Настройка может быть достигнута путем тщательной регулировки преимущества мощности лазера и смещений.

Во-первых, отрегулируйте коэффициент масштабирования и количество пикселей, чтобы оптимизировать размер пикселя. Делайте это в соответствии с теоремой Найквиста. Затем уменьшите скорость сканирования и используйте усреднение для улучшения соотношения сигнал/шум.

Затем вручную определите подходящие верхнюю и нижнюю фокальные плоскости по оси Z и установите StepSize, рассчитав осевое разрешение и разделив это расстояние на 2,3. Типичный результат составляет от 20 до 25 слоев изображения. После настройки получите конфокальное изображение всей отдельной ячейки с помощью 60-кратного масляного иммерсионного объектива Plan Apo с числовой апертурой 1,42.

Чтобы количественно оценить и проанализировать сигналы фюрофора, сначала откройте изображение, соответствующее интересующему слою плоскости z на изображении J. Затем, используя инструмент рисования, проведите линию через ячейку, где требуется количественная оценка. Далее измените дуновение линии, дважды кликнув по прямой. Значения интенсивности будут усредняться по ширине линии, поэтому используйте более тонкую линию, чтобы избежать перекрытия сигналов от разных структур.

Затем профилируйте плотность сигнала вдоль линии. Теперь повторим процесс сбора плотности сигнала по той же линии в канале, которая соответствует фюрофору. Значения всегда будут упорядочены в соответствии с ориентацией линии.

Теперь скопируйте данные профиля и вставьте их в таблицу для анализа. Повторите этот процесс сбора данных с каждого интересующего вас изображения в Z-плоскости, прежде чем приступать к статистическому анализу. В качестве альтернативы, вместо сбора сигнала вдоль оси, сигнал может быть собран из области изображения.

Сначала используйте функцию геометрической формы для выбора области интереса. Затем отрегулируйте пороговый уровень, чтобы избежать фона. На гистограмме интенсивности пикселей переместите ползунок, чтобы настроить, какие пиксели будут включены в количественную оценку.

Установите порог для удаления всех красных пикселей за пределами ячейки. Теперь определите параметры измерения, необходимые для измерения интересующего сигнала, а не фонового сигнала. Переключите параметр ограничения на пороговое значение и интегрированную плотность.

Далее используйте команду measure. Откроется новое окно со средними значениями серого и количеством пикселей в выбранной области. Теперь повторите процесс, применив тот же порог для определения интенсивности сигнала во всей ячейке.

Затем используйте эти данные для вычисления отношения сигнала в выбранной области к сигналу всей ячейки. Для точного измерения событий трансляции с помощью включения пурмицина сначала оценивались оптимальные условия для осевого измерения. Сравнивали спектр концентраций с пяти- или десятиминутным лечением.

Приемлемая концентрация пуромицина для клеток MRC-5 и HeLa была немного выше, чем необходимая для клеток Huh-7. Клетки, обработанные в течение десяти минут высокими концентрациями пуромицина, генерировали в основном более мелкие пуромиколированные полипептиды. Более мелкие полипептиды обезвреживаются быстрее и нежелательны

Таким образом, более короткое время инкубации было признано более желательным. Лечение циклогексимидом является эффективным и важным средством негативного контроля. В клетках MRC-5 после обработки циклогексимидом был обнаружен только слабый сигнал пуромицина.

С помощью количественного определения осевого сигнала можно оценить общую локализацию пуромиколированных полипептидов, соответствующих вновь синтезированным белкам, на различных уровнях в клетке. Количественное распределение сигнала по всей клетке также было возможным. Для любого метода было важно количественно оценить сигнал для каждой плоскости Z в стеке изображений, чтобы точно оценить события трансляции во всей ячейке.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как оценить событие трансляции в субклеточном компартменте. После освоения этой техники ее можно выполнить в течение дня, если она выполнена правильно. Когда кто-то задумывается об этой процедуре, важно помнить, что важна концентрация пуромицина и время его инкубации.

Чтобы ограничить диффузию, предпочтительнее ограничить время инкубации. Также важно понимать, что качество получения изображения имеет решающее значение для получения хороших результатов. Не забывайте, что работа с формальдегидом может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как работа в химическом вытяжке.