Usando Seqüência de Detenção SECM como uma ferramenta para isolar Ribossomos Polipeptídeos encadernados

O objetivo geral deste procedimento é isolar complexos de cadeia nascente ligados ao ribossomo SEC TED 70 s ou RNCs produzidos durante a tradução em um sistema livre de células in vitro. Isso é feito introduzindo primeiro uma sequência de paralisação SEC M de 17 aminoácidos na extremidade terminal C do gene de interesse e clonando-a a jusante do promotor transcricional T sete. Em seguida, o mRNA é transcrito usando uma reação de transcrição in vitro e depois purificado.

Em seguida, o mRNA purificado é traduzido em um sistema de extrato de S 30 E coli com aminoácidos radioativos para marcar a proteína sintetizada ou o polipeptídeo nascente. Finalmente, os complexos de cadeia nascente ligados ao segundo ribossomo Mr.Ed são isolados por sacarose, gradiente, centrifugação e fracionamento. Em última análise, os resultados podem ser obtidos mostrando que as cadeias nascentes estão ligadas de forma estável ao ribossomo 70 s por análise de eletroforese em gel dos polipeptídeos marcados isolados das frações de gradiente.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como o uso de mRNA sem códon de estoque, é que ela garante com alta eficiência a ligação da cadeia polipeptídica nascente ao ribossomo de 70 s durante a tradução e subsequente etapa de centrifugação. Além disso, em contraste com a tecnologia sem cordão de parada, este método pode ser usado com eficiência quase igual durante o sistema in vitro e in vivo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do dobramento translacional de proteínas, como o quão cedo durante a tradução vários intermediários de dobramento translacional podem se formar e ainda ajudar a analisar sua estrutura usando estrutura direta ou indireta.

Abordagens de sondagem e determinação Esta técnica pode nos ajudar a decifrar o caminho do dobramento de proteínas no ribossomo. Neste protocolo, descrevemos o isolamento de cadeias nascentes cristalinas de 70 s de comprimento total de bibine gama B ligadas ao ribossomo. Mas essa técnica pode ser usada para o isolamento de várias doenças de praticamente qualquer proteína de interesse.

Esta estratégia também pode ser adotada para isolar cadeias polipeptídicas de natin truncadas da derme Es.Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades durante a etapa de centrifugação do gradiente de sacarose. No entanto, para a primeira experiência, isso não deve ser um problema. Decidimos utilizar a segunda sequência de stalling para isolar polipeptídeos nascentes cristalinos gama B ligados a 70 como ribossomo após tentativas iniciais menos bem-sucedidas que envolveram o uso de mRNA sem cordão de parada.

A técnica posterior não conseguiu garantir a estabilidade dos RNCs durante as etapas de centrifugação subsequentes com a mesma eficiência que a técnica que envolve o uso da sequência de parada SECM. A demonstração visual deste método é crítica, pois as etapas que envolvem a preparação do gradiente e a separação do RNC podem ser difíceis de aprender e requer certo nível de especialização para garantir resultados reprodutíveis Demonstrando a postura será um estudante de pós-graduação do meu laboratório Para realizar a transcrição e tradução in vitro. Comece com um gene de interesse que é clonado em qualquer plasmídeo baseado em T sete e / ou SP seis para gerar complexos de cadeia nascente de ribossomo ou RNCs.

Estenda o terminal C do polipeptídeo alvo adicionando a sequência indutora de parada de M para garantir que o fragmento polipeptídico seja expulso para fora do túnel ribossômico. Adicione um ligante rico em glicina sírio flexível entre a proteína e a sequência de parada SEC M para se preparar para a transcrição in vitro, enzima de restrição do usuário que cortará a jusante do quadro de leitura aberto para linearizar a eletroforese em gel AROS de execução de DNA molde para verificar a digestão completa da amostra. Depois de verificar a concentração ideal de DNA, use um kit de transcrição de alto rendimento de acordo com as instruções do fabricante para sintetizar o RNA mensageiro.

Use precipitação de cloreto de lítio para purificar o mRNA. Em seguida, execute uma amostra em um gel de acrilamida ou aros para verificar sua pureza. Para tradução in vitro.

Usando um sistema de e coli em água livre de nuclease, adicione uma mistura de aminoácidos de um milimolar menos metionina, 10 unidades de inibidor de ribonuclease 20, micro curies de 35 s de metionina, 20 microlitros de mistura de reação, 24 microlitros de tampão de reconstituição e 24 microlitros de e coli. Lisado. Pré-aqueça a reação incubando-a a 30 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, adicione um a dois microgramas de mRNA e incube por mais 10 a 15 minutos a 30 graus Celsius.

Pare a reação colocando-o no gelo para isolar complexos de cadeia nascente ligados ao ribossomo de 70 s ou ncs. Coloque a reação de translação em cima de 4,5 mililitros de um gradiente de sacarose de cinco a 30% em montes de 20 milimolares. Hidróxido de potássio pH 7,5 15 milimolares de magnésio, 100 milimolares de acetato de potássio e uma centrífuga milimolar DTT a 41.000 RPM por duas horas a quatro graus Celsius após a centrifugação, fracionar o gradiente de sacarose usando um sistema de gradiente de densidade programável e um detector de absorbância ajustado em 254 nanômetros.

Colete as frações contendo ribossomos de 70 s para análise posterior para determinar se a proteína estendida SEC M permanece ligada ao ribossomo de 70 s. Precipitar a proteína em cada fração gradiente adicionando ácido tricloroacético. Incubar as amostras durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte, centrifugar as amostras a 14.000 vezes G por 15 minutos para granular a proteína, lavar as pastilhas em uma proporção de quatro para um de acetona para um milimolar tris, HCL pH 7,6.

Seque os pellets ao ar livre e, em seguida, ressuspenda-os no buffer de carregamento de página do SDS. Resolva as amostras por tris Trice SDS page, depois fixe e seque os géis e submeta-os a auto-radiografia e imagem fosfográfica como mostrado aqui. Após a tradução in vitro, os ribossomos 70 S foram isolados por sacarose, gradiente, centrifugação e fracionamento para garantir que a proteína cristalina gama B permaneça ligada de forma estável ao ribossomo.

As frações contendo 70 s foram agrupadas, tampão dessalinizado, trocadas e submetidas a uma rodada adicional de centrifugação com gradiente de sacarose. Os resultados apresentados aqui sugerem que o SEC M pode induzir eficientemente a parada translacional dos RNCs cristalinos gama B. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em um dia útil, com exceção da análise de eletroforese em gel da cadeia nascente, que geralmente envolve uma etapa de precipitação de TCA durante a noite.

Ao tentar este procedimento, é obviamente fundamental evitar a contaminação por RNAs em qualquer etapa. A contaminação por RNS pode afetar a eficiência translacional do extrato e levar à liberação de polipeptídeo nascente do 70º ribossomo. Seguindo este procedimento, pode-se obter NAST e polipeptídeos de lanxess predeterminados ligados de forma estável ao 70º ribossomo, dependendo do objetivo final.

Esses complexos podem ser usados para vários fins, como determinação da confirmação das cadeias nascentes ligadas ao ribossomo usando abordagens diretas e indiretas como RMN ou fre, ou fator de teste e ligação de ligante após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia estrutural e dobramento de proteínas explorarem a confirmação de proteínas de comprimento total ligadas ao ribossomo, bem como intermediários de dobramento translacional cot. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar e isolar o polipeptídeo nascente, ligado de forma estável ao ribossomo 70 s, que pode ser usado para responder a várias perguntas no campo do dobramento translacional de proteínas.

Não se esqueça que trabalhar com isótopos radioativos e ácidos aminados marcados, como, por exemplo, A 35 metionina requer cuidados especiais e deve sempre ser levado em consideração ao realizar este procedimento.