Name: Usando Seqüência de Detenção SECM como uma ferramenta para isolar Ribossomos Polipeptídeos encadernados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Aprenda a isolar complexos de ribossomos com cadeias nascentes usando a sequência de detenção SecM em sistema E. coli. Este método permite estudar dinâmicas de tradução e elongação proteica com alta eficiência.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado pelo Programa Ciência das Fronteiras Humanas concessão RGP0024.

1. Preparação de ADN de modelo e transcrição in vitro <ol><li> O gene de interesse é clonado em qualquer e T7 / ou, por exemplo SP6 promotor baseado plasmídeo. Para obter RNC de interesse, C-terminal do polipéptido alvo é estendido por adição de sequência de captura indutor do SECM FXXXXWIXXXXGIRAGP 7. A fim de assegurar que o fragmento de polipéptido de interesse será extrudir para fora do túnel ribossomal, a parte C-terminal da proteína alvo deve ser ampliada de pelo menos 30 aminoácidos 12-14. Um linker flexível Glicina-Serina rica pode ser introduzido entre a proteína ea sequência de captura SECM para evitar quaisquer constrangimentos conformacionais possíveis. </li><li> Para transcrição in vitro, o DNA modelo deve ser linearizado com a enzima de restrição de corte a jusante da ORF. Uma das necessidades para verificar a linearização completa do DNA de plasmídeo, executando o produto da digestão de restrição em electroforese em gel de agarose. </li><li> O plasma linearizadaid é ainda utilizado para reacção de transcrição in vitro. Concentração diferente de ADN molde pode ser testado para identificar a concentração de DNA óptima necessária para transcrição in vitro. Geralmente com Kit Ambion da transcrição de alto rendimento MEGAscript (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY), 1 ug de DNA linearizado produz 40-60 ug de mRNA. Transcrição in vitro é efectuado de acordo com as instruções do fabricante (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY) . </li><li> Após transcrição in vitro, o mRNA é purificado por precipitação com cloreto de lítio de acordo com as instruções do fabricante (Kit Ambion da transcrição MEGAscript de alto rendimento Ambion, / Life Technologies, Grand Island, NY). </li><li> integridade do mRNA é ainda verificado por electroforese em acrilamida ou utilizando géis de agarose. </li></ol> 2. Tradução in vitro Para a tradução in vitro utilizando o RTS 100 E. coli HY Kit (5 Prime, Gaithersburg, MD) siga os passos abaixo: <ol><li> Prepare-se 100 ul de instrução in vitro fabricante reação tradução seguinte. Resumidamente, em água livre de nuclease adicionar 24 ul mistura de ácido amino menos metionina (1 mM), 10 unidades de inibidor da ribonuclease (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), 20 uCi de radioactivos [35 S] Biomedicals-metionina (MP, Solon, OH), 20 ul da mistura da reacção, 24 ul de tampão Reconstituição e 24 ul de E. coli lisado. </li><li> Incubar a reacção a 30 ° C durante 5 min de pré reacção a quente de tradução. Adicionar 1-2 ug de mRNA para a reacção de tradução e incubar a 30 ° C durante 10-15 min. </li><li> Parar a reacção através da colocação da reacção de tradução em gelo. </li></ol> 3. Isolamento de polipéptido nascente in vitro a partir de reacção de tradução <ol><li> Para isolar RNC, a reacção de tradução é colocado em camadas sobre 4,5 ml de gradiente 5-30% de sacarose em 20 mM pH HEPES-KOH 70,5, 15 mM de MgCl2, 100 mM de acetato de potássio, 1 mM de DTT e centrifugou-se utilizando Beckman SW55 Coulter-rotor Ti a 41.000 rpm, 4 ° C durante 2 horas. </li><li> Após a centrifugação, o gradiente de sacarose é fracionado para isolar diferentes populações ribossômico e associados cadeias nascentes. A separação é monitorizado utilizando o sistema de gradiente ISCO programável Densidade com gravação contínua a 254 nm usando um detector de ISCO UA-6 absorvância. </li><li> A fração (s) contendo ribossomos 70S são coletadas e analisadas mais, dependendo do objetivo do experimento. </li></ol> 4. Observação de proteína ligada ao ribossomo com SDS-PAGE Tris-tricina Para verificar, se a proteína SECM estendida permanece ligado aos ribossomas 70S, as fracções de gradiente foram recolhidas e tratadas como se segue: <ol><li> Proteína em cada fracção foi precipitado por adição de ácido tricloroacético (TCA) para uma concentração final de 10% e incubadas a 4 ° C overnight. </li><li> Após incubação durante a noite, as amostras foram centrifugadas a 14.000 X g durante 15 min a pelete a proteína. Após centrifugação o sobrenadante foi removido eo sedimento lavado duas vezes com acetona solução contendo: 1 mM de Tris-HCl pH 7,6 (04:01). Sedimento foi ainda mais ar seco e dissolvido em SDS-PAGE de tampão de carregamento. </li><li> A amostra tratada foi resolvido e analisadas por Tris-tricina SDS-PAGE. </li><li> Após a electroforese, os géis foram fixados, secou-se utilizando vácuo gel Dyer e submetido a autorradiografia. A distribuição de polipéptidos nascentes foram observadas utilizando phosphoimaging. </li></ol> 5. Os resultados representativos Apresentamos aqui uma experiência que descreve o isolamento do full-length bovina Gamma-B cristalina estavelmente ligado aos ribossomas 70S. A Figura 1 ilustra os passos envolvidos no isolamento de bovinos RNC Gamma-B cristalina. O C-terminal da crystallin Gamma-B foi estendida geral por 32 t de aminoácidosó assegurar que a extrusão de comprimento total de proteína para fora do túnel ribossomal, o que também inclui a sequência SECM stalling colocado no muito C-terminal do polipéptido de fusão. Após a tradução in vitro, os ribossomas 70S foram isolados por centrifugação de gradiente de sacarose (Figura 2.1). A fim de assegurar que a proteína permanece estavelmente ligado ao ribossoma, as fracções contendo 70S foram reunidas, tampão, dessalinizado trocados e submetido a uma rodada adicional de centrifugação em gradiente de sacarose (Figura 2.2). O resultado apresentado na Figura 2 sugere claramente que SECM pode eficientemente induzir a apreensão de translação das RNC Gamma-B cristalina. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4027/4027fig1.jpg" /> Figura 1. Explicação esquemático dos passos envolvidos no isolamento de RNC. Terminal C de bovino Gamma-B cristalina foi prolongada por 32 sequência de aminoácidos. Este estendidaC-terminais regiões também inclui sequência de captura SECM. Gamma-B cristalina com seqüência SECM foi clonado em pIVEX 2,3 (T7 based) plasmídeo. Para transcrição in vitro do DNA molde foi linearizado por Xbal. Modelo linearizado foi ainda utilizado para transcrição in vitro. A T7 no molde de ADN é reconhecido por T7 RNA polimerase que transcreve a jusante Gamma-B do gene crystallin localizados do promotor T7. mRNA foi purificado utilizando lítio método de precipitação de cloreto. O mRNA purificado foi então usado para tradução in vitro. Após a incubação, a reacção de tradução foi derramado por cima de gradiente 5-30% de sacarose e centrifugou-se em Beckman SW55 Coulter-rotor Ti a 41.000 rpm, 4 ° C durante 2 horas. <spuma class = &quot;pdflinebreak&quot;&gt; <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4027/4027fig2.jpg" /> Figura 2. Isolamento de bovinos Gamma-B cristalina RNCS estável ligado ao ribossomo 70S. MRNA mg 1 foi misturado em 100 l reação E. coli Sistema Extracto S30 como mencionado na secção protocolo com 20 uCi [35 S]-metionina e incubadas a 30 ° C durante 15 min. Após a incubação, a reacção de tradução foi derramado por cima de gradiente 5-30% de sacarose em 20 mM de HEPES-KOH, pH 7,5, 15 mM de MgCl2, 100 mM de acetato de potássio, 1 mM de DTT e centrifugou-se em Beckman SW55 Coulter-rotor Ti a 41.000 rpm, 4 ° C durante 2 horas. Após sedimentação velocidade, o gradiente foi descarregado eo ribossoma pró le foi obtido. Os dados foram registrados pelo programa PeakTrak (gradiente de densidade ISCO sistema de fracionamento gradiente). As fracções foram recolhidas, a proteína foi precipitada TCA e resolvidos em t 16,5%, 6% C Tris-Tricine gel PAGE 15. O gel foi seco e exposto para autorradiografia. Após a exposição do gel foi digitalizado utilizando imagens do scanner Typhoon 9410. Figura 2.1 mostra que o full-length Gamma-B cristalina está presente em frações 70S dos ribossomas. Assim, SECM sequência stalling permite o isolamento dos estáveis ​​bovina RNC Gamma-B cristalina. Os dados da Figura 2.2 indicam claramente que os isolados RNC são realmente estável. No experimento actual das fracções 70S após a primeira ronda de centrifugação em gradiente de sacarose foram reunidas e da sacarose foi removido utilizando Amicon Ultra-4 unitário centrífuga de filtro (Millipore), seguido por tampão de troca em solução contendo 20 mM de HEPES-KOH, pH 7,5, 15 mM MgCl2, 100 mM de acetato de potássio, 1 mM de DTT. Esta amostra foi submetido a uma rodada adicional de centrifugação através de gradiente 5-30% de sacarose e fraccionado. Cada fracção foi tratado e analisados ​​como na Figura 2.1.

<ol><li>Fedorov, A. N., Baldwin, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cotranslational protein folding.</a> J. Biol. Chem. 272, 32715-32718 (1997).</li>
<li>Hardesty, B., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+a+nascent+peptide+on+the+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Nucleic+Acid+Res.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Folding of a nascent peptide on the ribosome.</a> Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66, 41-66 (2001).</li>
<li>Kramer, G., Boehringer, D., Ban, N., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+as+a+platform+for+co-translational+processing%2C+folding+and+targeting+of+newly+synthesized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The ribosome as a platform for co-translational processing, folding and targeting of newly synthesized proteins.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 589-597 (2009).</li>
<li>Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pause+for+thought+along+the+co-translational+folding+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">A pause for thought along the co-translational folding pathway.</a> Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).</li>
<li>Cabrita, L. D., Dobson, C. M., Christodoulou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding+on+the+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein folding on the ribosome.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 20, 33-45 (2010).</li>
<li>Oliver, D., Norman, J., Sarker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Escherichia+coli+secA+by+cellular+protein+secretion+proficiency+requires+an+intact+gene+X+signal+sequence+and+an+active+translocon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Regulation of Escherichia coli secA by cellular protein secretion proficiency requires an intact gene X signal sequence and an active translocon.</a> J. Bacteriol. 180, 5240-5242 (1998).</li>
<li>Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosomal+exit+tunnel+functions+as+a+discriminating+gate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate.</a> Cell. 108, 629-636 (2002).</li>
<li>Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+monitor%2C+SecM%2C+undergoes+self-translation+arrest+in+the+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Secretion monitor, SecM, undergoes self-translation arrest in the cytosol.</a> Mol. Cell. 7, 185-192 Forthcoming.</li>
<li>Muto, H., Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+but+non+polypeptide+prolyl-tRNA+functions+in+the+A+site+for+SecM-mediated+ribosomal+stall%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded but non polypeptide prolyl-tRNA functions in the A site for SecM-mediated ribosomal stall.</a> Mol. Cell. 22, 545-552 (2006).</li>
<li>Cabrita, L. D., Hsu, S. T., Launay, H., Dobson, C. M., Christodoulou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+ribosome-nascent+chain+complexes+produced+in+vivo+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Probing ribosome-nascent chain complexes produced in vivo by NMR spectroscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22239-22244 (2009).</li>
<li>Eichmann, C., Preissler, S., Riek, R., Deuerling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+structure+acquisition+of+nascent+polypeptides+monitored+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Cotranslational structure acquisition of nascent polypeptides monitored by NMR spectroscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 9111-9116 (2010).</li>
<li>Kolb, V. A., Makeyev, E. V., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+activity+of+the+ribosome-bound+nascent+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Enzymatic activity of the ribosome-bound nascent polypeptide.</a> FEBS Lett. 378, 166-170 (1996).</li>
<li>Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+atomic+structure+of+the+large+ribosomal+subunit+at+2.4+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution.</a> Science. 289, 905-920 (2000).</li>
<li>Voss, N. R., Gerstein, M., Steitz, T. A., Moore, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+geometry+of+the+ribosomal+polypeptide+exit+tunnel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The geometry of the ribosomal polypeptide exit tunnel.</a> J. Mol. Biol. 360, 893-906 (2006).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricine-sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+proteins+in+the+range+from+1+to+100+kDa%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).</li>
<li>Komar, A. A., Kommer, A., Krasheninnikov, I. A., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+folding+of+globin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cotranslational folding of globin.</a> J. Biol. Chem. 272, 10646-10651 (1997).</li>
<li>Keiler, K. C., Waller, P. R., Sauer, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+a+peptide+tagging+system+in+degradation+of+proteins+synthesized+from+damaged+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA.</a> Science. 271, 990-993 (1996).</li>
<li>Evans, M. S., Ugrinov, K. G., Frese, M. A., Clark, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+stalled+ribosome+nascent+chain+complexes+produced+in+vivo+or+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Homogeneous stalled ribosome nascent chain complexes produced in vivo or in vitro.</a> Nat. Methods. 2, 757-762 (2005).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Para obter resultados reprodutíveis, a qualidade ea concentração dos componentes utilizados para transcrição in vitro e tradução são críticos. Usámos comercialmente disponível in vitro transcrição e extractos de tradução e dão resultados reprodutíveis e eficientes, se manuseados com cuidado. Qualidade de ARNm pode afectar a tradução, por isso, é de extrema importância para testar a integridade do mRNA antes de o utilizar para tradução in vitro. Tempo de incubação para tra...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome de reagente / Kit </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 Kit de Transcrição de alto rendimento </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> RTS 100 E.coli HY Kit </td><td> 5 Prime </td><td> 2401100 </td></tr><tr><td> Inibidor da ribonuclease </td><td> Invitrogen </td><td> 15518012 </td></tr><tr><td> Trans [35 S]-Label </td><td> Biomedicals MP </td><td> 0151006 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-4 unitário Centrífuga filtro </td><td> Millipore </td><td> UFC801008 </td></tr><tr><td> Armazenamento de fósforo autoradiografia </td><td> GE Healthcare </td><td> Typhoon 9410 imager modo variável </td></tr><tr><td> Densidade Sistemas de Fracionamento Gradiente </td><td> Teledyne Isco, Inc. </td><td> ISCO Sistema Gradiente programável Densidade </td></tr><tr><td> Sacarose Gradiente Centrifugation </td><td> Beckman Coulter </td><td> Optima L-90 K ultracentrífuga Preparativo </td></tr></tbody></table>

usando seqüência de detenção secm como uma ferramenta para isolar ribossomos polipeptídeos encadernados

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

A pesquisa extensiva tem forneceram evidências que sugerem que a proteína amplos dobrando na célula é um processo de co-translacional 1-5. No entanto, o caminho exato que cadeia polipeptídica segue durante a co-traducional dobrar para atingir sua forma funcional ainda é um enigma. A fim de compreender este processo e para determinar a conformação exacta dos intermediários de co-translacionais de dobragem, é essencial ao desenvolvimento de técnicas que permitem o isolamento de RNC que transportam cadeias nascentes de tamanhos pré-determinados para permitir a sua posterior análise estrutural. SECM (monitor secreção) é um aminoácido 170 E. coli proteína que regula a expressão do jusante SecA ATPase (condução secreção) no operão SECM-seca 6. Nakatogawa e Ito originalmente descobriu que uma sequência de aminoácidos 17 de comprimento (150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166) na região C-terminal da proteína SECM são necessários e suficientes paracausar bloqueamento dos alongamento SECM em Gly165, produzindo assim peptidil-glicil-tRNA estavelmente ligado ao ribossoma P-site 7-9. Mais importante, verificou-se que esta sequência de aminoácidos 17 de comprimento pode ser fundido com o terminal C de virtualmente qualquer proteína de comprimento completo e / ou truncado, permitindo assim a produção de RNC que transportam cadeias nascentes de tamanhos pré-determinados 7. Assim, quando fundidos ou inserida na proteína alvo, SECM sequência stalling produz prisão do alongamento da cadeia polipeptídica e gera RNC estáveis ​​tanto in vivo em E. células de Escherichia e in vitro num sistema isento de células. Centrifugação em gradiente de sacarose é ainda utilizado para isolar RNC. Os RNC isolados podem ser utilizados para analisar as características estruturais e funcionais dos intermediários de co-translacionais dobráveis. Recentemente, esta técnica tem sido usada com sucesso para obter insights sobre a estrutura de vários ribossomas ligados a cadeias nascentes 10,11. Aqui nós descrevemos o isolamento de bovinos Gamma-B cristalina RNCS fundido a SECM e gerado em um sistema de tradução in vitro.

Descrevemos aqui uma técnica que é rotineiramente usado para isolar estavelmente ligados ribossomo complexos da cadeia nascente (RNC). Esta técnica aproveita a descoberta de que um jovem de 17 aminoácidos longo SECM &quot;seqüência de prisão&quot; pode parar de alongamento de tradução em uma procariótica (<em&gt; E. coli</em&gt;) Do sistema, quando inseridos em (ou fundido com o terminal C) de virtualmente qualquer proteína.

Usando Seqüência de Detenção SECM como uma ferramenta para isolar Ribossomos Polipeptídeos encadernados

Pesquisas extensas forneceram amplas evidências sugerindo que o enovelamento de proteínas na célula é um processo cotraducional1-5. No entanto, a via exata...

O objetivo geral deste procedimento é isolar complexos de ribossomos ligados a cadeias nascentes, ou RNCs, associados ao SEC TED 70 s produzidos durante a tradução em um sistema livre de células in vitro. Isso é realizado primeiramente introduzindo uma sequência de estagnação do SEC M com 17 aminoácidos no extremo C-terminal do gene de interesse e clonando-a a jusante do promotor transcricional T sete. Em seguida, o mRNA é transcrito utilizando uma reação de transcrição in vitro e então purificado.Em seguida, o mRNA purificado é traduzido em um sistema de extrato S 30 de E. coli com aminoácidos radioativos para marcar a proteína sintetizada ou a cadeia polipeptídica nascente. Por fim, os segundos complexos de cadeia nascente ligados ao ribossomo Mr.Ed são isolados por gradiente de sacarose, centrifugação e fracionamento. Em última análise, os resultados podem demonstrar que as cadeias nascentes estão estavelmente ligadas ao ribossomo 70 S mediante análise por eletroforese em gel dos polipeptídeos marcados isolados das frações do gradiente.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o uso de mRNA sem códon de parada, é que ela garante com alta eficiência a ligação da cadeia polipeptídica nascente ao ribossomo 70 S durante a tradução e a etapa subsequente de centrifugação. Além disso, em contraste com a tecnologia de ausência de códon de parada, este método pode ser usado com eficiência quase igual tanto em sistemas in vitro quanto in vivo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo do dobramento proteico traducional, como a formação de intermediários de dobramento traducional nos estágios iniciais da tradução e auxiliar ainda na análise de suas estruturas por meio de estruturas diretas ou indiretas.Abordagens de investigação e determinação Esta técnica pode nos ajudar a decifrar a via de dobramento proteico no ribossomo. Neste protocolo, descrevemos o isolamento de cadeias nascentes completas de gama B cristalina ligadas a ribossomos 70 s. No entanto, esta técnica pode ser utilizada para o isolamento de diversas doenças de praticamente qualquer proteína de interesse.Essa estratégia também pode ser adotada para isolar cadeias polipeptídicas truncadas de natin na derme. Em geral, indivíduos novos nesse método podem ter dificuldades durante a etapa de centrifugação em gradiente de sacarose. No entanto, para quem tem experiência, isso não deverá ser um problema. Decidimos utilizar uma segunda sequência de estacionamento para isolar polipeptídeos nascentes de cristalina gama B ligados ao ribossomo 70S após tentativas iniciais, menos bem-sucedidas, que envolveram o uso de mRNA sem códon de parada.A técnica posterior não conseguiu garantir a estabilidade dos CRCs durante as etapas subsequentes de centrifugação com a mesma eficiência do método que envolve o uso da sequência de parada SECM. A demonstração visual deste método é fundamental, pois as etapas que envolvem a preparação do gradiente e a separação dos CRCs podem ser difíceis de aprender, exigindo certo nível de experiência para assegurar resultados reprodutíveis. A demonstração do procedimento será realizada por um estudante de pós-graduação do meu laboratório, para realizar transcrição e tradução in vitro. Inicie com um gene de interesse clonado em qualquer plasmídeo baseado em T7 e/ou SP6 para gerar complexos ribossomo-cadeia nascente ou CRCs.Estenda a extremidade C do polipeptídeo alvo adicionando a sequência indutora de parada de M para garantir que o fragmento do polipeptídeo seja extrudido para fora do túnel ribossômico. Adicione um ligador flexível rico em glicina e serina entre a proteína e a sequência de parada SEC M para preparar a transcrição in vitro; utilize uma enzima de restrição que corte a jusante da moldura de leitura aberta para linearizar o DNA molde e realize eletroforese em gel AROS para verificar a digestão completa da amostra. Após confirmar a concentração ideal de DNA, utilize um kit de transcrição de alto rendimento de acordo com as instruções do fabricante para sintetizar o RNA mensageiro.Utilize a precipitação com cloreto de lítio para purificar o mRNA. Em seguida, analise uma amostra em um gel de acrilamida ou aros para verificar sua pureza. Para tradução in vitro.Usando um sistema de e coli em água livre de nucleases, adicione uma mistura de aminoácidos de um milimolar, exceto metionina, 10 unidades de inibidor de ribonuclease, 20 microcuries de 35 s metionina, 20 microlitros de mistura de reação, 24 microlitros de tampão de reconstituição e 24 microlitros de lisado de e coli. Pré-aqueça a reação incubando-a a 30 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, adicione um a dois microgramas de mRNA e incube por mais 10 a 15 minutos a 30 graus Celsius.Interrompa a reação colocando-a no gelo para isolar os complexos de cadeia nascente ligados ao ribossomo 70 S ou ncs. Coloque a reação de tradução sobre 4,5 mililitros de um gradiente de sacarose de 5 a 30% em 20 milimolar de HEPES, hidróxido de potássio pH 7,5, 15 milimolar de magnésio, 100 milimolar de acetato de potássio e 1 milimolar de DTT. Centrifugue a 41.000 RPM durante duas horas a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, fracione o gradiente de sacarose utilizando um sistema programável de gradiente de densidade e um detector de absorbância ajustado a 254 nanômetros.Colete as fra&ccedil;&otilde;es contendo ribossomos 70 s para an&aacute;lise adicional, a fim de determinar se a prote&iacute;na estendida SEC M permanece ligada ao ribossomo 70 s. Precipite a prote&iacute;na em cada fra&ccedil;&atilde;o do gradiente adicionando &aacute;cido tricloroac&eacute;tico. Incube as amostras durante a noite a quatro graus Celsius; no dia seguinte, centrifugue as amostras a 14.000 &times; g durante 15 minutos para obter o pellet proteico, e lave os pellets em uma propor&ccedil;&atilde;o de quatro para um de acetona para tris 1 milimolar, HCl pH 7,6.Seque os pellets ao ar, depois re-suspenda-os em tamp&atilde;o de carga para SDS-PAGE. Separe as amostras por SDS-PAGE em sistema Tris-Tricine, ent&atilde;o fixe e seque os geis e submeta-os &agrave; auto-radiografia e imagem de fosfo como mostrado aqui. Ap&oacute;s a tradu&ccedil;&atilde;o in vitro, os ribossomos 70 S foram isolados por gradiente de sacarose, centrifuga&ccedil;&atilde;o e fracionamento para garantir que a prote&iacute;na gama B cristalina permane&ccedil;a estavelmente ligada ao ribossomo.As frações contendo 70 s foram reunidas, desalinizadas com troca de tampão e submetidas a uma rodada adicional de centrifugação em gradiente de sacarose. Os resultados apresentados aqui sugerem que o SEC M pode induzir eficientemente a parada traducional dos RNCs da cristalina gama B. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em um único dia de trabalho, com exceção da análise por eletroforese em gel da cadeia nascente, que geralmente envolve uma etapa de precipitação com TCA durante a noite.Ao realizar este procedimento, é obviamente fundamental evitar a contaminação por RNAs em todas as etapas. A contaminação por RNS pode afetar a eficiência traducional do extrato e levar à liberação do polipeptídeo em formação do ribossomo 70S. Após seguir este procedimento, pode-se obter NAST e polipeptídeos de lanxess predeterminado estavelmente ligados ao ribossomo 70S, dependendo do objetivo final.Esses complexos podem ser utilizados para diversas finalidades, como a determinação da confirmação de cadeias nascentes ligadas ao ribossomo por meio de abordagens diretas e indiretas, como RNM ou FRE, ou o teste de ligação de fatores e ligantes após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de biologia estrutural e dobramento de proteínas explorarem a confirmação de proteínas completas ligadas ao ribossomo, bem como intermediários de dobramento co-translationais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar e isolar polipeptídeos nascentes, estavelmente ligados ao ribossomo 70 S, os quais podem ser utilizados posteriormente para responder diversas questões no campo do dobramento proteico translacional.Não se esqueça de que trabalhar com isótopos radioativos e aminoácidos marcados, como, por exemplo, metionina A 35, exige precauções especiais e deve sempre ser levado em consideração ao realizar este procedimento.

using-secm-arrest-sequence-as-tool-to-isolate-ribosome-bound

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este artigo descreve um protocolo para a extração de traduzir os ribossomos das células eucarióticas. Uma vez extraído, ribossomos são separados em monosomes e polirribossomos por fracionamento gradiente de sacarose para permitir diferentes populações ribossomal a ser analisado. Como tal, este método é o padrão ouro para examinar a regulamentação da tradução.

Análise de Perfil eucarióticas Polyribosome

Um grande impedimento para análises bioquímicas dos ribossomos contendo nascente peptidil-tRNAs foi a presença de ribossomos outros nas mesmas amostras, os ribossomos não estão envolvidos na tradução da seqüência de mRNA específico que está sendo analisado. Nós desenvolvemos uma metodologia simples para purificar, exclusivamente, os ribossomos que contém a nascente peptidil-tRNA de interesse.

Isolamento de Ribossomos Traduzindo Contendo peptidil-tRNAs para análises funcionais e estruturais

Uma técnica para identificar locais de pausa de translação sobre mRNA é descrito. Este procedimento é baseado no isolamento de polipéptidos nascentes que se acumulam nos ribossomas durante in vitro tradução de um ARNm alvo, seguido de análise de tamanho das cadeias nascentes utilizando uma electroforese em gel de desnaturação.

Isolamento de Ribossomos ligados a polipeptídeos nascentes<em&gt; In vitro</em&gt; Identificar Sites Pausa translacionais Junto mRNA

A purificação por afinidade das proteínas marcadas em combinação com espectrometria de massa (STDA) é um método poderoso para o mapeamento sistemático de redes de interacção de proteínas e para a investigação do mecanismo de base de processos biológicos. Aqui, descrevemos um otimizado seqüencial peptídeo afinidade (SPA) APMS procedimento desenvolvido para a...

Identificação de complexos de proteínas em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Utilizando a purificação por afinidade sequencial Peptide em combinação com espectrometria de massa tandem

Este protocolo ilustra modificações essenciais da polyribosome fraccionamento, a fim de estudar o translatome in vivo de amostras do SNC. Ele permite que a avaliação global de tradução e transcrição regulação através do isolamento e comparação de RNA total para ribossomo frações de RNA ligado.

In vivo Interrogatório de Sistema Nervoso Central Translatome por Polyribosome Fracionamento

Ribossomas desempenham um papel central na síntese de proteínas. Polyribosome (polysome) fracionamento por centrifugação em gradiente de densidade de sacarose permite a determinação direta da eficiência de tradução de mRNAs individuais em uma escala de todo o genoma. Além disso, este método pode ser usado para a análise bioquímica de ribossomas e factores associados--polissomas como acompanhantes e moléculas de sinalização.

Polysome Fracionamento e Análise de mamíferos Translatomes em uma escala genômica

Um procedimento de isolamento de RNA em tandem (viagem) para recuperação de complexos mRNA-proteínas endogenamente formado é descrito. Especificamente, complexos de RNA-proteína são quitosana na vivo, polyadenylated RNAs são isolados de extratos com grânulos de oligo (descolamento) e particulares mRNAs são capturados com modificados oligonucleotides antisentidos do RNA. Proteínas vinculadas a mRNAs são detectadas pela análise de immunoblot.

Um procedimento de isolamento de RNA em Tandem do Oligonucleotide-baseado para recuperar complexos mRNA-proteínas eucariotas

Aqui descrevemos os estágios de coleta e preparação da amostra para RIBO-seq em bactérias. O sequenciamento das bibliotecas preparadas de acordo com essas diretrizes resulta em dados suficientes para análise bioinformática abrangente. O protocolo que apresentamos é simples, utiliza equipamentos de laboratório padrão e leva sete dias desde a lise até a obtenção de bibliotecas.

RIBO-seq em Bactérias: um Protocolo de Coleta de Amostras e Preparação de Bibliotecas para Sequenciamento NGS

Este protocolo descreve como gerar um perfil de polissomo sem usar fabricantes automatizados de gradientes ou sistemas de fracionamento de gradiente.

Perfil de polissomas sem fabricantes de gradientes ou sistemas de fracionamento

As interações co-translacionais desempenham um papel crucial nas modificações da cadeia nascente, na segmentação, na dobra e nas vias de montagem. Aqui, descrevemos o Perfil Ribossomo Seletivo, um método para in vivo, análise direta dessas interações no modelo eucariote Saccharomyces cerevisiae.

Identificação Global de Redes de Interação Co-Translacional por Perfil Seletivo Ribosome

A Biotinilação Iluminada Restrita por Localização específica (ALIBi) é um método optogeneticamente ativado inovador desenvolvido para marcar e purificar populações subcelulares de ribossomos para sequenciamento a jusante e análise proteômica.

Isolamento de Subpopulações Subcelulares de Ribossomo Baseado em Biotinilação Iluminada Aprimorada por Localização Específica de Etiquetas Peptídicas Recombinantes

Aprenda a isolar complexos de ribossomos com cadeias nascentes usando a sequência de detenção SecM em sistema E. coli. Este método permite estudar dinâmicas de tradução e elongação proteica com alta eficiência.

Usando Seqüência de Detenção SECM como uma ferramenta para isolar Ribossomos Polipeptídeos encadernados

Explorar mais vídeos