Name: Identificação de complexos de proteínas em Escherichia coli Utilizando a purificação por afinidade sequencial Peptide em combinação com espectrometria de massa tandem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: Aprenda a identificar complexos de proteínas em Escherichia coli usando purificação por afinidade sequencial com espectrometria de massa. Este método permite isolar proteínas de baixa abundância e mapear interações proteicas.

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Este trabalho foi financiado por fundos da Fundação Canadense para Inovação, Canadá Genoma, do Instituto de Genômica de Ontário, o Ministério de Ontário, da Inovação e do Canadian Institutes of Health Research subvenção para JG e AE O E. Vermelha expressando coli DY330 foi um presente tipo de Donald L. Tribunal de Justiça (Instituto Nacional do Câncer, Frederick, MD).

1. Construção de Gene-específico SPA-marcação em E. Strain coli DY330 <ol><li> O plasmídeo pJL148 compreendendo a sequência de DNA SPA-tag e o cassete de canamicina marcador de resistência aos antibióticos (Kan R) são usadas como um modelo na reacção de polimerização em cadeia (PCR) 7. A 45 nt iniciador específico do gene para a frente, localizado imediatamente a montante do codão de paragem do gene alvo em enquadramento com um 27 (&#39;5&#39;-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3) iniciador tag pb específica para a frente, e a 45 nt de primer reverso específico do gene, localizado imediatamente a jusante do codão de paragem do gene alvo, em moldura com uma pe 27 (5&#39;-GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3 &#39;) tag primer reverso específico, são usados ​​para ampliar o SPA-tag e Kan R a partir da cassete de pJL148 utilizando as seguintes condições de ciclos de PCR: 94 ° C durante 5 min, 30 ciclos de 94 ° C durante 1 min, 55 ° C durante 1 min, 68 ° C durante 2 min 10 s, seguido de 68 ° C durante 10 min. Essas seqüências amplificadas servir a ums substratos para a maquinaria de recombinação ectópica introduzido λ-Red homólogas (ver abaixo). </li><li> O produto da PCR é purificado usando um kit de purificação Qiaquick PCR, para remover os sais que podem interferir com a electroporação. O produto purificado PCR é subsequentemente dirigida para integrar na extremidade 3 &#39;(, imediatamente a montante do codão de terminação nativo) de um gene específico em DY330 estirpe em que o λ-Red maquinaria de recombinação é expressa 10. </li><li> A estirpe λ DY330-Red expressar é crescida durante a noite em 2 ml de meio Luria-Bertani (LB) a 32 ° C mediante agitação a 180 rpm. 1 ml da cultura durante a noite é posteriormente inoculada em 70 ml de meio LB fresco no frasco de 500 ml. O inóculo é cultivada a 32 ° C mediante agitação a 180 rpm até que a DO600 atinge ~ 0.8. </li><li> A cultura é transferida para um novo balão de 250 ml, em que as células são induzidas através da incubação do balão num banho de água a 42 ° C agitando suavemente ao180 rpm durante 15 min. Imediatamente após a indução, o frasco é incubado num banho de lama de gelo e água durante pelo menos 30 min com agitação. </li><li> A cultura gelada é imediatamente transferida para um pré-refrigerada tubo de polipropileno de 50 ml e submetida a centrifugação a 3993 xg durante 6 min a 4 ° C. O sedimento de células foi ressuspenso em 50 ml de água gelada estéril e centrifugada mais uma vez em 3993 xg durante 6 min a 4 ° C. O sedimento de células foi então ressuspenso em 1 ml de água fria e transferido para um tubo de 1,5 ml Effendorf, e centrifugado à velocidade máxima durante 20 segundos a 4 ° C. Após dois ou três passos de lavagem com água gelada, o sedimento de células foi ressuspenso em 700 ul finalmente de água gelada estéril, resultando em células electro-competentes. </li><li> Através de electroporação, um ul do fragmento amplificado purificada é introduzida em 40 ul de células eletro-competentes. As células são electroporados em um GenePulser da Bio-Rad II, com os seguintes ajustes: 2,5 kV, 25 uF com pulsocontrolador de 200 Ω. Após a recombinação homóloga e de integração, os transformantes que recombinados com êxito a etiqueta / fita no cromossoma são seleccionados com base na resistência ao Kan (Figura 1A). Transformantes múltiplos são selecionados para Western blot para verificar a geração correta (ou seja, sinal positivo) de Spa-marcadas proteínas de fusão com o anticorpo anti-FLAG M2 que é seletiva contra os epítopos bandeira do SPA-tag. </li><li> Confirmado carboxi terminal de tensão de fusão SPA-tag é cultivado em larga escala para isolar complexos proteína solúvel a partir de células colhidas usando o protocolo de purificação SPA. A descrição das etapas envolvidas no procedimento de purificação por afinidade de etiquetas é mostrada na Figura 1B. </li></ol> 2. Cultura e Sonication <ol><li> Inocular 100 ul de uma E. SPA-tagged coli estoque de glicerol em 50 ml de caldo óptimo (TB) meio líquido suplementado com 50 ul de 25 ug / ml of Kan solução num balão cónico de 250 ml. Fazer crescer a cultura durante a noite a 32 ° C. Observação: Uma vez que a cassete de λ temperatura induzível Vermelho na estirpe DY330 está sob o controlo de um repressor sensível à temperatura 10, o SPA-tagged estirpe de E. coli é cultivada a 32 ° C. </li><li> Transferem-se 10 ml da cultura durante a noite em 990 ml de TB fresco suplementado com 25 ug / ml de Kan num frasco de 4 litros. A cultura é cultivada a 32 ° C com agitação constante a 250 rpm, durante 5 a 6 horas, até que a DO600 atinge a ~ 2-3. </li><li> Transferir a E. 1 litro coli cultura SPA-tag para limpar garrafas de centrifugação e centrifugar as células a 4 ° C em Beckman J6-HC centrífuga @ 3993 xg durante 15 min. </li><li> O sobrenadante é removido a partir dos frascos de centrifugação. Ressuspender o E. coli peletes de células com 25 ml de tampão de sonicação. Certifique-se de manter as garrafas de centrifugação em gelo em todos os momentos. </li><li> O sedimento ressuspenso étransferido para 50 ml de tubo Falcon de polipropileno e congelou-se utilizando azoto líquido. As células congeladas são armazenadas a -80 ° C para uso a longo prazo. </li><li> Antes de sonicação, descongelar as células congeladas, mantendo completamente os grânulos em gelo. As amostras descongeladas são transferidas para um copo de aço inoxidável estéril colocada em gelo durante sonicação. A sonda é submerso na amostra e sonicada durante 3 min. Um adicional de 2 minutos deixa-se arrefecer a amostra a partir de um sobreaquecimento. </li><li> O lisado celular sonicado é transferida para o tubo de centrifugação estéril pré-refrigerado, e submetido a centrifugação a 4 ° C em centrífuga Beckman utilizando um rotor JA-17 @ 35267 xg (16000 rpm) durante 15 minutos duas vezes. Nota: No caso da purificação de proteínas de membrana, o ligado celular é centrifugado sonicado apenas uma vez durante 15 minutos, porque não se sabe em que fracção são as proteínas da membrana, isto é, ou no sedimento ou na fracção sobrenadante. Assim, para evitar a perda excessiva de memproteínas branas, que gira as células durante 15 minutos a alta velocidade de centrifugação e o sobrenadante é subsequentemente processado para purificação (veja as etapas a seguir) em que 1% de detergente é usado para solubilizar as proteínas da membrana. </li><li> O sobrenadante do tubo de centrifugação é cuidadosamente transferido para um tubo de polipropileno de 50 ml Falcon e congelados usando azoto líquido. O extracto celular é armazenado congelado sonicado durante um período máximo de 6 meses à temperatura de -80 ° C para uso futuro. </li></ol> 3. A purificação por afinidade <ol><li> Antes de usar, 100 ul de anti-flag M2 pérolas são lavadas com 10 volumes de tampão de AFC (30 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% de detergente, e 0,1-0,5 mM TCEP [tris (2-carboxietil) fosfina - ácido clorídrico]), sem o detergente e o agente de redução de TCEP (tris (2-carboxietil) fosfina). </li><li> A congelados, extrato celular sonicado é descongelado colocando o tubo em água fria. O extracto celular descongelado é incubado com 3 ul de benzonase nuclease durante 30 min a 4 ° C. A esta mistura, adicionar detergente não iónico Triton X-100 (concentração final do detergente deverá ser de 0,1%) e 200 ul de suspensões anti-FLAG M2 pérolas de agarose. Nota: Para todas as purificações de proteínas solúveis, 0,1% de Triton X-100 é utilizado para minimizar a adsorção não específica, enquanto que para a purificação de uma proteína de membrana, diferentes suaves detergentes não-iónicos, tais como o C12E8 (dodecil éter Octaethylene glicol), DDM ( n-dodecil β-D-maltósido) e maltose-neopentil-glicol (MNG) pode ser utilizado a uma concentração de 1% de detergente para melhorar a solubilização. Uma vez que os detergentes diferentes têm diferentes eficiência de solubilização de proteínas de membrana, é recomendável realizar a purificação de proteínas independentes, utilizando mais de um detergente. </li><li> O conteúdo é misturado suavemente por rotação do tubo durante 3 horas a 4 ° C, utilizando um agitador LabQuake. Depois de 3 horas de rotação, o tubo é centrifugado a 1700 xg durante 6 min. O sobrenadante é então removed cuidadosamente, tanto quanto possível, sem perturbar o sedimento solto grânulo. </li><li> O sedimento foi ressuspenso no sobrenadante remanescente e, em seguida, transferido para um 0,8 4 cm x Bio-Rad polipropileno coluna prep. Certifique-se de remover os tampões de saída do fundo da coluna, para permitir que os eluatos a escorrer por fluxo de gravidade. Lava-se a coluna 5 vezes com o passo de clivagem TEV. </li><li> Depois de drenar os eluatos lavados, da saída de fundo da coluna é fechada. À mesma coluna, a clivagem é realizada por adição de ~ 5-10 ul (50 unidades) de protease de TEV e 400 ul de tampão 1X AFC na coluna. Assegurar a fechar o topo da coluna com um tampão. A coluna que contém os grânulos são rodadas suavemente durante a noite a 4 ° C durante a noite utilizando um agitador de LabQuake. </li><li> Retire a tampa na parte superior e o tampão de saída na parte inferior da coluna, e drenar os eluatos recuperados após clivagem TEV em uma coluna de fresco contendo 200 ul de suspensões de calmodulina-sepharose grânulos, que é lavado por 10volumes de tampão de ligação a calmodulina. </li><li> A parte superior e na parte inferior da coluna estão bem apertados, e o conteúdo da coluna são misturados suavemente por rotação durante 3 horas a 4 ° C, utilizando um agitador LabQuake. </li><li> Depois de 3 horas de rotação, o eluato é drenada através da tampa superior e a tampa inferior da coluna. A coluna é lavada quatro vezes com 200 ul de 1X tampão de ligação a calmodulina, seguido por uma lavagem rigorosa com 400 ul de tampão de lavagem a calmodulina. </li><li> A proteína ligada foi eluída em quatro fracções de 50 uL em um novo tubo Eppendorf utilizando 1X tampão de eluição calmodulina. A fracção eluida é distribuído em dois tubos Eppendorf limpo em volumes iguais. Ambos os tubos são em seguida secos usando um vácuo de velocidade. </li><li> O eluato secas a partir de um tubo é usado para a execução de um gel de coloração de prata, enquanto o outro é armazenado a -80 ° C, antes de utilizar a espectrometria de massa. </li></ol> 4. A coloração de prata <ol><li> Para a prata staining, metade do volume de 3X SDS (dodecilsulfato de sódio) é adicionado tampão de amostra de 50 ul do eluído seco. Depois de ferver a mistura durante 5 min, as amostras são carregadas num gel de poliacrilamida SDS. </li><li> Após o gel ter terminado a execução, é cuidadosamente colocado em solução de fixação (metanol a 50% e 10% de ácido acético) e agitada suavemente num agitador rotativo durante 20 min. O gel é então lavado com etanol a 20% durante 10 min. </li><li> O gel é lavado duas vezes fixo cuidadosamente com 500 ml de água destilada duas vezes, durante 10 minutos para assegurar fundo uniforme baixa. </li><li> O gel é então agitada suavemente em 500 ml de tiossulfato de sódio para 1 min, seguida de duas etapas de lavagem com água destilada durante 20 segundos. </li><li> A água é eliminada, e o gel é incubado em 200 ml de nitrato de prata a 0,1% durante 30 min. Após esse tempo, o nitrato de prata é removida e o gel foi lavado com água destilada durante 20 segundos para remover o excesso de nitrato de prata. </li><li> O gel é finalmente agitada à mão em 75 mlda solução de revelação. Quando a intensidade desejada é alcançada, a solução reveladora é descartado e 80 ml de ácido acético é adicionado para parar a reacção. Assegure-se incubar o gel em ácido acético durante um período mínimo de 20 min para a visualização adequada das bandas do gel. </li></ol> 5. Proteólise e Preparação de Amostras para Espectrometria de Massa <ol><li> Para a amostra seca, adicionar 50 ul de tampão de digestão do e 0,9 ul de 100 mM TCEP-HCl (tris (2-carboxietil) fosfina - ácido clorídrico) e incubar a mistura durante 45 min à temperatura ambiente para a fase de redução. Em seguida, 1 ml de 500 mM de iodoacetamida ea placa é incubada no escuro durante 40 min outro para permitir a alquilação de amostra. </li><li> Depois da segunda ronda de incubação, adicionar 1 mg de tripsina imobilizada à mistura e incubar quer a 37 ° C durante 5 horas ou durante a noite à temperatura ambiente. Assegurar a parar a reacção por adição de 1 ul de ácido acético. </li><li> Pré-molhado Millipo ore Zip Tip-ponta da pipeta de aspiração por 10 ul da solução de equilíbrio e de molhagem. Dispensar a solução para o lixo. Subsequentemente aspirar 10 ul de solução de lavagem e dispensar a solução para o lixo. Repetir este passo duas vezes. </li><li> Para a ligação eficiente da mistura de péptidos para a ponta, pipeta misturar a mistura de péptidos de 20 vezes. A mistura de péptidos que adere à ponta é lavado, aspirando e dispensando a solução de lavagem. Repetir este procedimento duas vezes para a ligação eficiente da mistura de péptidos para a ponta. </li><li> Com a ponta contendo o péptido ligado, aspirar 10 ul da solução de equilíbrio e de molhagem, e dispensar para um tubo eppendorf limpo. Repetir este passo duas vezes. Após a secagem das amostras eluídas em vácuo de velocidade, as amostras podem ser analisadas por espectrometria de massa imediatamente ou armazenados a -80 ° C antes da utilização. </li></ol> 6. Identificação de proteínas por LTQ Orbitrap Velos Espectrômetro de Massa Thcomponentes electrónicos polipeptídicas dos complexos isolados são identificadas usando um Orbitrap LTQ Velos híbrido espectrómetro de massa em tandem. O Orbitrap tem poder de resolução excepcional (&gt; 60.000 Máxima Meia Largura Total a, ou FWHM) e precisão de massa (&lt;2 ppm), que minimiza a MS / MS de amostragem irrelevantes contaminantes não-específicos de fundo detectada em purificações de controlo, enquanto que a elevada velocidade Velos ion trap componente pode detectar e péptidos fragmento baixa abundância utilizando tanto a transferência de electrões e os modos de dissociação induzida por colisão de dissociação. Partidas de confiança elevados entre MS resultante / MS espectros são mapeados para referência E. seqüências de proteína coli usando o algoritmo de pesquisa de banco de dados como Sequest e cada seqüência de correspondência avaliados durante um algoritmo de probabilidade como STATQUEST 11. O número de espectros total, singularidade sequência peptídica e contaminantes detectados no fundo comuns de controlo negativo (isto é. Mock) são considerados purificações para alcançar um baixo empírica falso-distaxa de redescoberta. Os passos seguintes são realizados para identificação de proteínas: <ol><li> As micro-colunas são embalados com ~ 10 cm de 3 m Luna C-18 e da resina são interligados com uma fonte de iões Proxeon nanoelectrospray que é colocado em linha com o instrumento Orbitrap. </li><li> Um fluxo Proxeon nano binário bomba HPLC é usada para fornecer uma taxa de fluxo estável ponta de ~ 300 nl min -1 durante as separações peptídicas. </li><li> Para alcançar eluição peptídeo, um gradiente de tampão orgânico é criado de acordo com a complexidade da amostra. Por exemplo, o gradiente que se segue é tipicamente configurado para E. Amostras de E. coli SPA: solvente B é aumentada de 2% a 6% em 1 min, a 24% em 38 min, a 100% em 4 min em seguida, mantida a 100% durante 1 min, em seguida, reduzida para 2% em 1 min, e final mantenha a 2% durante 15 min. A fase móvel tem um solvente de 95% por HPLC de gradiente de água e 5% de ACN com 0,1% de ácido fórmico, enquanto B tem 5% de solvente HPLC gradiente de água e 95% de ACN com 0,1% de ácido fórmico acid. A taxa de fluxo a ponta da agulha está definido para 300 nl min -1 durante 60 min. </li><li> Como os ciclos de espectrômetro de massa executado através de uma varredura completa em massa 60.000 resoluções, 10 concomitantes em tandem varreduras em massa de fragmentação são coletados para os íons precursores mais intensos. Exclusão dinâmica, seleção massal monoisotópico, e em tempo real de dados dependentes de características do instrumento de aquisição estão habilitados. </li><li> Os espectros são pesquisados ​​utilizando um algoritmo de busca de banco de dados, tais como Sequest contra um banco de dados de E. sequências de proteínas de E. coli, e o resultado é estatisticamente filtrada utilizando um algoritmo de probabilidade, como STAQUEST 11 para assegurar uma taxa de detecção baixa falso. Apenas os candidatos de confiança elevada (99% de probabilidade) são seleccionados, enquanto os jogos mostrando mais do que 10 ppm de massa de erro em comparação com a massa teórica de péptidos são eliminadas de consideração posterior. </li></ol>

<ol><li>Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+network+containing+conserved+and+essential+protein+complexes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli.</a> Nature. 433, 531-537 (2005).</li>
<li>Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+functional+atlas+of+Escherichia+coli+encompassing+previously+uncharacterized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins.</a> PLoS Biol. 7, e1000096(2009).</li>
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<li>Polanowska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+immunoaffinity+purification+of+protein+complexes+from+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Tandem immunoaffinity purification of protein complexes from Caenorhabditis elegans.</a> Biotechniques. 36, 778-782 (2004).</li>
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<li>de Berardinis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complete+collection+of+single-gene+deletion+mutants+of+Acinetobacter+baylyi+ADP1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1.</a> Mol. Syst. Biol. 4, 174(2008).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+peptide+affinity+purification+system+for+the+systematic+isolation+and+identification+of+protein+complexes+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli.</a> Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Um aspecto chave da abordagem baseada em STDA SPA descrito aqui, é que a marcação é feita dentro do contexto natural cromossómica, assegurando desse modo a regulação do gene normal é mantida (isto é. Isca promotor nativo conservado, portanto os níveis de expressão não é perturbada) e estavelmente nativo associado complexos de proteínas são recuperadas em quase endógenos níveis. Problemas de polaridade operão também são evitados mediante a inclusão de um promotor de orientada para o exterior do marcador seleccio...

<table><tbody><tr><td colspan="4">I. Antibióticos</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Bioshop</td><td>#KAN201</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Bioshop</td><td>#AMP201</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">2. Meio de caldo fantástico</forte></td></tr><tr><td>Bio-Triptona</td><td>Bioshop</td><td>#TRP 402</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Bioshop</td><td>#YEX 555</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Bioshop</td><td>#GLY 002</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Bioshop</td><td>#PPM 302</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Bioshop</td><td>#PPM 303</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">3. Cepa bacteriana e plasmídeo</td></tr><tr><td>DY330</td><td></td><td>Yu et al. (2000)10</td><td></td></tr><tr><td>pJL148</td><td></td><td>Zeghouf et al. (2004)7</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">4. Reagentes de PCR e Eletroforese</td></tr><tr><td>Taq DNA polimerase</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>10 X tampão PCR</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTPs</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>25 mM MgCl2</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td># AGA002</td><td></td></tr><tr><td>Carregando corante</td><td>NEB</td><td>#B7021S</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de etídio</td><td>Bioshop</td><td># ETB444</td><td></td></tr><tr><td>10X TBE tampão</td><td>Thermo Scientific</td><td>#28355</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Bioshop</td><td>#TRS001</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Bioshop</td><td>#BOR001</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA (pH 8,0)</td><td>Sigma</td><td># E6768</td><td></td></tr><tr><td>DNA</td><td>ladder NEB</td><td>#N3232L</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">5. Kits de isolamento e limpeza de plasmídeos</td></tr><tr><td>Plasmid Midi kit</td><td>Qiagen</td><td>#12143</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR kit de purificação</td><td>Qiagen</td><td>#28104</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">6. Equipamentos de PCR e Transformação</td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>BioRad</td><td>iCycler</td><td></td></tr><tr><td>Eletroforese em gel de agarose</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>GenePulser II</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta de eletroporação de 0,2 cm</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>42 &deg; Agitador em banho-maria</td><td></td><td>C Innova 3100</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Beckman Coulter TJ-25</td><td>Beckman Coulter</td><td>TS-5.1-500</td><td></td></tr><tr><td>32 &deg; C Shaker</td><td>New Brunswick Scientific, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 &deg; C grande Shaker</td><td>New Brunswick Scientific, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 &deg; Incubadora de placa C</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">7. Eletroforese e Western blotting< / forte ></td></tr> <tr><td>monômero de acrilamida, N, N '- metilenobis-acrilamida</td><td>Bio-Rad</td> <td># 161-0125</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amônio</td><td>Bioshop</td> <td># AMP001</td><td></td></tr><tr><td>n-butanol</td><td>Sigma</td> <td># B7906</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bioshop</td><td>#TEM001</td><td></td></tr><tr><td>Whatman No. 1 papel de filtro</td><td>Fischer Scientific</td> <td># 09-806A</td><td></td></tr> Mini dispositivo <tr><td>de transferência de gel iBlot</td><td></td> Bio-Rad # 165-3301 <td></td> de 3 células Invitrogen#IB1001 <td></td></tr><tr><td>membranas de nitrocelulose</td><td>Bio-Rad</td> <td># 162-0115</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal Anti-Flag M2</td><td>Sigma</td><td>#F3165</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase de rábano</td><td>Amersham</td><td>#NA931V</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Pré-corado <td></td></tr><tr><td> padrões de peso molecular de proteína</td><td>Bio-Rad</td><td>#161-0363</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de quimioluminescência</td><td>PIERCE</td><td>#1856136</td><td></td></tr><tr><td>Filme de autorradiografia</td><td>Clonex Corp</td><td>#CLEC810</td><td></td></tr><tr><td>Papel absorvente Quick Draw</td><td>Sigma</td><td>#P7796</td><td></td></tr><tr><td>C2 agitador de balanço</td><td>da plataforma New Brunswick Scientific, EUA</td><td></td><td></td></tr><<tr>td colspan="4"><forte>8. Equipamentos e reagentes de sonicação</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson Ultrasonic</td><td>#23395</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bioshop</td><td>#SOD001</td><td></td></tr><tr><td>Inibidores de protease</td><td>Roche</td><td>#800-363-5887</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mM TCEP-HCl</td><td>Thermo Scientific</td><td>#20490</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">9. Reagentes e equipamentos de purificação Affinity</td></tr><tr><td>0.8 x 4 cm Coluna de polipropileno Bio-Rad</td><td></td>#<td>732-6008</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease de benzonase</td><td>Novagen</td><td>#70746</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2 grânulos de agarose</td><td>Sigma</td><td>#A2220</td><td></td></tr><tr><td>Grânulos de calmodulina-sepharose</td><td>GE Healthcare</td><td>#17-0529-01</td><td></td></tr><tr><td>TEV protease</td><td>Invitrogen</td><td>#12575-015</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>#T9284</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>#C2661</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>#E3889</td><td></td></tr><tr><td>LabQuake Shaker</td><td>Thermolyne</td><td>#59558<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">10. Reagentes de Coloração de Prata</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Bioshop</td><td>#MET302</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Bioshop</td><td>t#ACE222</td><td></td></tr><tr><td>Tiossulfato de sódio</td><td>Sigma</td><td>#S-7143</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de prata</td><td>Fischer Scientific</td><td>#S181-100</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Bioshop</td><td>#FOR201</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato</td> <td>de sódioBioshop</td><td>#SOC512</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">11. Reagentes e equipamentos para identificação de proteínas </ouro></td></tr><tr><td>fortetripsina, grau de espectrometria de massa</td><td>Promega</td><td># V5280</td><td></td></tr><tr><td>50 mM NH4HCO3</td><td>Bioshop</td><td>#AMC555</td><td></td></tr><tr><td>1 mM CaCl2</td><td>Bioshop</td><td>#CCL302</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Sigma</td><td>#A998-4</td><td></td></tr><tr><td>Fórmica ácido</td><td>Sigma</td><td>#F0507</td><td></td></tr><tr><td>HPLC grau de água</td><td>Sigma</td> <td># 95304</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamida</td><td>Sigma</td> <td># 16125</td><td></td></tr><tr><td>Millipore Zip-Tip</td><td>Millipore</td> <td># ZTC18M960</td><td></td></tr> <tr><td>~ 10 cm de 3 &mu; m Resina Luna-C18</td><td>Phenomenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proxeon nano HPLC bomba</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Velos espectrômetro</td><td></td> de massa <td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">12. Material de laboratório</forte></td></tr> <tr><td>frascos cónicos de 4 litros</td><td>VWR</td><td>#89000-372</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno de 50 ml Tubos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de microcentrífuga de 1,5 ml</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flaks cónicos de 250 ml</td><td>VWR</td><td>#29140-045</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultura estéreis de 15 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>#366052</td><td></td></tr><tr><td>Frascos criogénicos</td><td>VWR</td><td>#479-3221-80</td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C freezer</td><td>Fisher Scientific</td><td>#13-990-14</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de vácuo de velocidade</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Buffers and Solutions 1. 1 litro Terrific Broth (TB) media 11 g Bio-Tryptone 22 g de Extrato de Levedura 2% Glicerol 50 ml de estoque de sal de potássio solução 2. Solução estoque de sal de potássio 1,5 M K2HPO4 0,35 M KH2PO4 3. Tampão de sonicação 20 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 0,2 mM EDTA 10% de glicerol Antes de usar, adicione o inibidor de protease (PI) e 0,1-0,5 mM TCEP 4. Tampão AFC 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 0,1% detergente Antes de usar, adicione PI e 0,1-0,5 mM TCEP 5. Tampão de clivagem TEV 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 0,2 mM EDTA 0,1% detergente Antes de usar, adicione PI e 0,1-0,5 mM TCEP 6. Tampão de ligação de calmodulina 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0,1% detergente Antes de usar, adicione PI e 0,1-0,5 mM TCEP 7. Tampão de lavagem de calmodulina 30 mM Tris-HCl pH 7,9 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0,1-0,5 mM TCEP 8. Tampão de eluição de calmodulina 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 100 mM NaCl 10 mM EGTA 0,1-0,5 mM TCEP 9. Solução reveladora (1L) 37% Formaldeído 30 g de carbonato de sódio 1000 ml de água destilada 10. Tampão de digestão 50 mM NH4HCO3 1 mM CaCl2 11. Solução de umedecimento e equilíbrio 70% acetonitrila (ACN) em ácido fórmico a 0,1% 12. Solução de lavagem 100% H2O em ácido fórmico a 0,1%</td></tr></tbody></table>

identificação de complexos de proteínas em<em&gt; escherichia coli</em&gt; utilizando a purificação por afinidade sequencial peptide em combinação com espectrometria de massa tandem

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Uma vez que a maioria dos processos celulares são mediadas por montagens macromoleculares, a identificação sistemática de interacções proteína-proteína (PPI) e à identificação da composição de subunidades de vários complexos de proteína pode fornecer informações sobre a função do gene e aumentar a compreensão dos sistemas biológicos 1 e 2. Interacções físicas podem ser mapeados com alta confiança isolamento vialarge escala e caracterização de complexos de proteínas endógenas sob condições fisiológicas quase baseados em purificação de afinidade de proteínas cromossomicamente etiquetados em combinação com espectrometria de massa (STDA). Esta abordagem tem sido aplicada com sucesso em organismos evolutivamente diversas, incluindo levedura, moscas, vermes, células de mamíferos e bactérias 1-6. Em particular, têm gerado um carboxi-terminal Affinity Peptide seqüencial (SPA) sistema de marcação dupla para afinidade com purificação de complexos de proteínas nativas cultivadas coli gram-negativas coli, usando genetically-tratáveis ​​hospedeiras estirpes laboratoriais que estão bem adaptados para as investigações do genoma da biologia fundamental e processos conservadas de procariotas 1, 2, 7. O nosso sistema de SPA-marcação é análogo ao método de purificação por afinidade em tandem desenvolvido originalmente para levedura 8, 9, e é composto por uma ligação peptídica a calmodulina (CBP), seguido do local de clivagem para a protease altamente específico do tabaco vírus etch (TEV) e três cópias do epitopo FLAG (FLAG 3X), permitindo dois ciclos consecutivos de enriquecimento por afinidade. Após a amplificação da cassete, a sequência específica de produtos lineares de PCR que codificam o SPA-tag e um marcador de selecção são integradas e expressas em quadro como carboxi-terminais fusões em um fundo DY330 que é induzida a expressar transitoriamente um altamente eficiente sistema de recombinação heteróloga bacteriófago lambda 10. Purificação de dupla etapa subsequente utilizando calmodulina e grânulos anti-FLAG de afinidade permite a altamente selectivoe recuperação eficiente de até complexos de baixa abundância de proteínas de grande escala culturas. Espectrometria de massa é, então, usado para identificar as estavelmente co purificação de proteínas com uma sensibilidade elevada (limites de detecção baixos de nanogramas). Aqui, descrevemos detalhadas passo-a-passo os procedimentos que comumente utilizam para purificação de proteínas sistemática de marcação, e espectrometria de massa com base em análise de complexos de proteínas solúveis de E. coli, que podem ser expandidos e potencialmente adaptada para outras espécies bacterianas, incluindo certos agentes patogénicos oportunistas que são passíveis de recombineering. As interações físicas resultantes muitas vezes pode revelar interessantes componentes inesperados e conexões sugerindo novas ligações mecanicistas. Integração dos dados do PPI com alternativas de associação de dados moleculares, como genéticos (gene-gene) interações e genômica de contexto (GC) previsões podem facilitar a elucidação da organização global molecular de proteínas multi-complexos dentro bicaminhos fisiológicos. As redes geradas por E. coli pode ser usado para obter insights sobre a arquitetura funcional de produtos de genes ortólogos em outros micróbios para que anotações funcionais actualmente não existem.

Após as proteínas isca marcadas, expressas em níveis endógenos, serem purificadas por afinidade a partir de culturas em fase logarítmica, as amostras foram submetidas à eletroforese em gel com coloração por prata para visualizar os componentes individuais das polipeptídios dos complexos estáveis isolados. Também submetemos uma segunda fração das amostras proteicas purificadas por afinidade à espectrometria de massa tandem sem gel (LCMS) para identificar as sequências polipeptídicas correspondentes. A eficácia deste proce...

A purificação por afinidade das proteínas marcadas em combinação com espectrometria de massa (STDA) é um método poderoso para o mapeamento sistemático de redes de interacção de proteínas e para a investigação do mecanismo de base de processos biológicos. Aqui, descrevemos um otimizado seqüencial peptídeo afinidade (SPA) APMS procedimento desenvolvido para a bactéria<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Que pode ser usado para isolar e caracterizar estáveis ​​múltiplos complexos proteína-à homogeneidade a partir de perto mesmo números de cópias baixos por célula.

Identificação de complexos de proteínas em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Utilizando a purificação por afinidade sequencial Peptide em combinação com espectrometria de massa tandem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

O objetivo deste experimento é identificar proteínas, interações proteicas e a composição de subunidades de complexos MultiPro nativos de *E. coli*. Isso é alcançado amplificando produtos lineares de PCR específicos para a sequência, codificando a marcação SPA e um marcador selecionável, que são integrados e expressos em quadro como fusões na extremidade carboxi terminal em um background ddy 3, 3 0 utilizando o sistema de recombinação bacteriana Fage lambda. Em um segundo passo, realiza-se uma purificação dupla etapa utilizando perlas de afinidade com cow modlin e Anti-Flag para recuperar eficientemente complexos proteicos de baixa abundância. Em seguida, as proteínas ligadas são eluídas com buffer de eluição de cow modlin ou CEB, digeridas com tripsina e processadas por espectrometria de massas para identificação proteica.Os resultados obtidos mostram que várias subunidades da enzima RNA polimerase principal, incluindo os fatores de terminação da transcrição e de anti-determinação, co-purificaram eficientemente com a proteína da subunidade D da RNA polimerase marcada, indicando que os novos componentes associados podem ser eficientemente identificados usando esta abordagem. Geralm

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui nós descrevemos uma nova técnica proteômica quantitativa para a identificação de complexos de proteína em Saccharomyces cerevisiae. Neste estudo, nós utilizamos o método SILAC juntamente com purificação de afinidade seguido por espectrometria de massa para identificar com alta especificidade dos parceiros de ligação de uma proteína ER, Scs2p.

Identificação de complexos de proteínas com proteômica quantitativa em S. cerevisiae

Tandem purificação por afinidade é uma abordagem robusta para a identificação de parceiros de ligação às proteínas. Como prova de conceito, este método foi aplicado ao bem caracterizado eIF4E factor de iniciação da tradução para o co-precipitado os factores de células hospedeiras envolvido na iniciação da tradução. Este método é facilmente adaptado a qualquer proteína celular ou virai.

Identificação de parceiros de proteína Interagir utilizando Tandem purificação por afinidade

Este vídeo demonstra a purificação de afinidade em tandem - uma técnica para purificar complexos de proteínas de células eucarióticas para estudar a interação proteína-proteína. O complexo contém duas proteínas marcadas com diferentes tags de epítopos. Após a purificação do complexo usando duas resinas com afinidade pelas duas marcas diferentes de maneira sequencial, a presença de ambas as proteínas no eluidor confirma a interação entre as duas.

Ensaio de purificação de afinidade em tandem para estudar interações proteína-proteína

Aqui descrevemos protocolos para romper as células de mamíferos por moagem em estado sólido a uma temperatura criogénica, produzem um extracto celular a partir do pó de células resultante, e isolar complexos proteína de interesse por captura de afinidade sobre esferas paramagnéticas escala mícron acoplado com anticorpo.

Proteína de captura por afinidade complexos a partir de células de mamíferos Cryomilled

Descrevemos aqui um método novo, robusto e eficiente de purificação por afinidade em tandem (TAP) para a expressão, isolamento e caracterização de complexos proteicos de células eucarióticas. Este protocolo pode ser utilizado para a caracterização bioquímica de complexos discretos, bem como a identificação de novos interagentes e modificações pós-traducionais que regulam sua função.

A purificação de afinidade em tandem de complexos de proteínas a partir de células eucarióticas

Aqui apresenta-se os protocolos para a purificação por afinidade de complexos de proteínas e a sua separação por PAGE nativa azul, seguido pelo perfil correlação protea utilizando espectrometria de massa quantitativo livre etiqueta. Este método é útil para resolver interactoma em complexos de proteínas distintas.

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

Apresentamos um protocolo para dosar com precisão as proteínas com rotulagem isobárica, fracionamento extensivo, ferramentas de bioinformática e etapas de controle de qualidade em combinação com cromatografia líquida interfaceada com um espectrômetro de massa de alta resolução.

Proteome profunda de criação de perfil por isobárica rotulagem extensa cromatografia líquida, espectrometria de massa e quantificação assistida por Software

Interações da proteína-proteína e proteína-metabólito são cruciais para todas as funções celulares. Aqui, descrevemos um protocolo que permite a análise paralela dessas interações com uma proteína de escolha. Nosso protocolo foi otimizado para culturas de células de plantas e combina a purificação da afinidade com espectrometria de massa base de proteína e deteção do metabólito.

2 em 1: uma etapa de purificação da afinidade para a análise paralela de proteína-proteína e proteína-metabólito complexos

Aqui nós apresentamos um protocolo para monitorar a montagem e desmontagem da toxina antraz usando interferometria biolayer (BLI). Na sequência de montagem/desmontagem na superfície biosensor, os grandes complexos de proteínas são liberados da superfície para visualização e identificação dos componentes dos complexos usando microscopia eletrônica e espectrometria de massa, respectivamente.

Analisando a dinâmica da proteína montada sobre e libertado da interferometria Biolayer Biosensor usando espectrometria de massa e de microscopia eletrônica

Apresentamos um método para a purificação, detecção e identificação de peptídeos diGly que se originam de proteínas ubiquitinadas de amostras biológicas complexas. O método apresentado é reprodutível, robusto e supera os métodos publicados em relação ao nível de profundidade da análise ubiquitinome.

Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa

Aqui apresentamos um protocolo para a identificação rápida de proteínas produzidas por bactérias patogênicas genomicamente sequenciadas usando espectrometria de massa maldi-TOF-TOF e análise proteômica de cima para baixo com software desenvolvido internamente. Íons proteicos metastáveis fragmentom por causa do efeito ácido aspartic e essa especificidade é explorada para identificação de proteínas.

Identificação de Proteínas de Imunidade Antibacteriana em Escherichia coli usando MALDI-TOF-TOF-MS/MS e Análise Proteômica De Cima Para Baixo

Aprenda a identificar complexos de proteínas em Escherichia coli usando purificação por afinidade sequencial com espectrometria de massa. Este método permite isolar proteínas de baixa abundância e mapear interações proteicas.

Identificação de complexos de proteínas em Escherichia coli Utilizando a purificação por afinidade sequencial Peptide em combinação com espectrometria de massa tandem (Vídeo) | JoVE Journal

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