Identificação de complexos de proteínas em

O objetivo deste experimento é identificar proteínas, interações proteicas e a composição de subunidades de complexos MultiPro nativos de *E. coli*. Isso é alcançado amplificando produtos lineares de PCR específicos para a sequência, codificando a marcação SPA e um marcador selecionável, que são integrados e expressos em quadro como fusões na extremidade carboxi terminal em um background ddy 3, 3 0 utilizando o sistema de recombinação bacteriana Fage lambda. Em um segundo passo, realiza-se uma purificação dupla etapa utilizando perlas de afinidade com cow modlin e Anti-Flag para recuperar eficientemente complexos proteicos de baixa abundância. Em seguida, as proteínas ligadas são eluídas com buffer de eluição de cow modlin ou CEB, digeridas com tripsina e processadas por espectrometria de massas para identificação proteica.

Os resultados obtidos mostram que várias subunidades da enzima RNA polimerase principal, incluindo os fatores de terminação da transcrição e de anti-determinação, co-purificaram eficientemente com a proteína da subunidade D da RNA polimerase marcada, indicando que os novos componentes associados podem ser eficientemente identificados usando esta abordagem. Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades com as duas rodadas de purificação por afinidade, nas quais o processamento cuidadoso dos lisados celulares com soluções de tampão apropriadas é absolutamente necessário para garantir o sucesso na recuperação eficiente de complexos com baixa e alta abundância a partir de culturas em larga escala. A demonstração dos procedimentos de purificação por afinidade e espectrometria de massas será realizada por Olga Kagan e HBO guo, dois técnicos do meu laboratório. Este protocolo inicia-se com o direcionamento de sequências amplificadas específicas à linhagem DDY três 30, na qual a maquinaria de recombinação Lambda red é expressa conforme descrito no protocolo escrito.

Em seguida, cultive a linhagem expressora do sistema de recombinação bacteriano fago Lambda durante a noite em dois mililitros de meio Luria bati ou meio LB a 32 graus Celsius, sob agitação a 180 RPM. No dia seguinte, inocular um mililitro da cultura de crescimento noturno em 70 mililitros de meio LB fresco em um frasco cônico de 500 mililitros. Incube o inóculo a 32 graus Celsius sob agitação a 180 RPM até que a DO600 atinja cerca de 0,8. Induza as células incubando o frasco em banho-maria a 42 graus Celsius, com agitação suave a 180 RPM, por 15 minutos.

Imediatamente após a indução, incubar o frasco em banho de gelo com água por pelo menos 30 minutos sob agitação. Após colher e lavar as células conforme descrito no procedimento escrito, ressuspenda o pellet celular em 700 microlitros de água estéril, fria e com gelo, resultando em células eletrocompetentes para eletroporação. Introduza um microlitro do amplicon purificado em 40 microlitros das células eletrocompetentes.

As células são eletroporadas após a recombinação homóloga e integração. Os transformantes que recombina­ram com sucesso o cassete de marcação na cromossomo são selecionados com base na resistência à canamicina; selecione múltiplos transformantes para o western blot a fim de verificar a geração correta das proteínas de fusão marcadas com SPA, utilizando o anticorpo Anti-Flag M2, que é específico contra os epítopos Flag da marcação SPA. Transfira 10 mililitros da cultura de crescimento noturno para 990 mililitros de meio TB fresco, suplementado com 25 microgramas por mililitro de canamicina, em um frasco de quatro litros.

Cultive a cultura a 32 graus Celsius com agitação constante a 250 RPM por cinco a seis horas, até que a DO 600 atinja entre dois e três. Transfira a cultura de um litro de E. coli com marcação SPA para frascos de centrífuga limpos e centrifugue as células a quatro graus Celsius e 3.993 × g por 15 minutos. Após ressuspender as células conforme descrito no protocolo escrito.

Transfira as amostras para um copo estéril de aço inoxidável colocado sobre gelo para sonicação. Mergulhe a sonda na amostra e realize a sonicação por três minutos. Após a sonicação, aguarde mais dois minutos para resfriar a amostra, evitando superaquecimento, após a centrifugação do lisado sonicado.

Transfira cuidadosamente o sobrenatante S do tubo de centrifugação para um tubo cônico de polipropileno de 50 mililitros. Congele a amostra usando nitrogênio líquido e armazene o extrato celular sonicado congelado por um período máximo de seis meses a menos 80 graus Celsius para uso futuro. Para iniciar a purificação por afinidade do extrato celular sonicado congelado, coloque o tubo em água fria e incube o extrato celular de TH com três microlitros de benzo, uma nucleasse, por 30 minutos a quatro graus Celsius.

A esta mistura, adicione o detergente não iônico Triton X-100 e 200 microlitros de suspensão de Anti-Flag M2 Agro Beads. Misture suavemente o conteúdo girando o tubo durante três horas a quatro graus Celsius. Após três horas de rotação, centrifugue o tubo a 1.700 ×g durante seis minutos. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o máximo possível do sobrenadante sem perturbar o pellet solto.

Re-suspenda o pellet no SNA remanescente e, em seguida, transfira para uma coluna de preparo de polipropileno. Remova as tampas do orifício inferior da coluna para permitir que o eluato drene por gravidade. Em seguida, lave a coluna cinco vezes com 200 microlitros de tampão FC uma vez e prossiga com a clivagem com TEV conforme descrito no protocolo escrito.

Após a clivagem, feche firmemente ambas as extremidades da coluna. Misture suavemente o conteúdo da coluna por rotação durante a noite a quatro graus Celsius após rotação durante a noite. Drene o eluato removendo a tampa superior e a rolha inferior para a nova coluna.

Lave a coluna antiga com 400 microlitros de tampão de ligação Cal Modlin 1x e 150 microlitros de suspensão de perlas de ligação Cal Modlin. Elua a proteína ligada em quatro frações de 50 microlitros em um tubo eppendorf novo. Utilizando tampão de eluição Cal Modlin 1x.

Distribua a fração eluída em dois tubos eppendorf limpos em volumes iguais. Em seguida, seque o conteúdo dos dois tubos utilizando um evaporador a vácuo. O eluato seco de um tubo é usado para realizar um gel de coloração com prata conforme descrito no texto, enquanto o outro é armazenado a menos 80 graus Celsius.

Para uso futuro em espectrometria de massas na amostra seca, adicione 50 microlitros do tampão de digestão e 0,9 microlitro de ácido tris fosfínico hidrocloreto 100 milimolar, e incube a mistura por 45 minutos à temperatura ambiente para a etapa de redução. Em seguida, adicione um microlitro de iodoacetamida 500 milimolar e incube no escuro por mais 40 minutos para permitir a alquilação da amostra. Após a segunda rodada de incubação, adicione um micrograma de tripsina à mistura. Incube a amostra a 37 graus Celsius por cinco horas ou durante a noite à temperatura ambiente após a incubação.

Certifique-se de interromper a reação adicionando um microlitro de ácido acético. Em seguida, prepare a ponta Zip da Millipore, ponta de pipeta conforme descrito no texto para uma ligação eficiente do peptídeo à ponta. Misture a mistura de peptídeos 20 vezes e remova a mistura de peptídeos que aderiu à ponta, aspirando e dispensando a solução de lavagem.

Repita este procedimento duas vezes para uma ligação eficiente da mistura de peptídeos à ponta contendo o peptídeo ligado. Aspire 10 microlitros da solução de umedecimento e equilibração e transfira para um tubo eppendorf limpo. Repita este passo duas vezes.

Após secar as amostras eluídas em um evaporador a vácuo, as amostras podem ser analisadas imediatamente por espectrometria de massas ou armazenadas a menos 80 graus Celsius antes do uso. As microcolunas utilizadas neste procedimento são preenchidas com aproximadamente 10 centímetros de resina lunar C18 de três mícrons e são conectadas a uma fonte de ionização por nano eletrospray pro Zion que é posicionada em linha com o instrumento orbitrap. Uma bomba HPLC binária de fluxo nano pro Zion é usada para fornecer uma taxa de fluxo estável na ponta de aproximadamente 300 nanolitros por minuto durante as separações de peptídeos, a fim de obter a diluição de peptídeos, configurando um gradiente de tampão orgânico de acordo com a complexidade da amostra.

Para esta amostra de SPA de E. coli, a fase móvel solvente A contém 95% de água para gradiente HPLC e 5% de acetonitrila com 0,1% de ácido fórmico, enquanto o solvente B contém 5% de água para gradiente HPLC e 95% de acetonitrila com 0,1% de ácido fórmico. Após a espectrometria de massas, pesquise os espectros utilizando um algoritmo de busca em banco de dados, como o Seaquest, contra um banco de dados de sequências proteicas de E. coli. Filtre estatisticamente os resultados utilizando um algoritmo de probabilidade, como o StarQuest, para garantir uma baixa taxa de descoberta falsa. Tanto o fator sigma da RNA polimerase marcado com SPA quanto a proteína YakLA, de função desconhecida, co-purificaram especificamente com a enzima RNA polimerase central, incluindo as subunidades alfa, beta e beta linha, bem como o fator de reciclagem da RNA polimerase. Em contraste com o fator sigma da RNA polimerase marcado, YakL ligou-se adicionalmente a um fator essencial de antiterminação da transcrição, sugerindo uma função especializada na transcrição.

Vários outros proteínas menores que co-purificaram foram detectados por LCMS e não eram aparentes no gel, incluindo a subunidade ômega da RNA polimerase e fatores de terminação e determinação da transcrição, USA e NUSD. Por outro lado, em um experimento independente, a maquinaria de mobilização de enxofre marcada, S-U-F-B-S-U-F-C e SUFD, co-purificou entre si, indicando participação conjunta na biossíntese de clusters ferro-enxofre como um único complexo de sustentação. Este exemplo representativo destaca o fato de que complexos bacterianos MultiPro previamente bem estudados e altamente anotados, que participam de processos biológicos essenciais, frequentemente possuem componentes associados novos que podem ser eficientemente identificados.

Usando essa abordagem, o baixo número de cópias da proteína SUFB pode ter resultado em uma intensidade de sinal fraca em relação à intensidade forte observada nos experimentos de imunoprecipitação de SUFC e SUFD para definir a composição de complexos proteicos estáveis de múltiplas unidades. Pontuações de copurificação foram atribuídas às interações de alta confiança levando em consideração a singularidade das relações entre isca e presa, isca e isca, e presa e presa. Em seguida, utilizando procedimentos de agrupamento em grafos, como o algoritmo de agrupamento markoff, agrupamentos discretos de proteínas são identificados a partir da rede probabilística de interações proteína-proteína particionada.

Redes de interação putativas podem ser visualizadas usando o Cytoscape. A combinação de dados de proteômica com evidências adicionais de associação funcional inferidas por métodos de genômica pode ser utilizada para investigar novos papéis mecanicistas de proteínas de E. coli previamente anotadas. Aqui, sub-redes de complexos proteicos e módulos funcionais que participam como vizinhanças funcionais mais amplas foram definidas em E. coli.

O principal agrupamento hierárquico de Graham mostra os padrões de previsões funcionais e anotações existentes para os genes órfãos funcionais e caracterizados de *E. coli*; as cores amarela e azul representam funções existentes e inferidas, respectivamente, enquanto as intensidades dos tons refletem os escores de confiança. Os processos biológicos associados a vários vizinhados são indicados à direita; os detalhes mostram os componentes individuais de um vizinhado representativo com base nos escores de similaridade da rede integrada de interações físicas e funcionais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como complexos proteicos estáveis de *E. coli* podem ser isolados utilizando a abordagem de purificação por afinidade acoplada à espectrometria de massas.

Em princípio, esta técnica pode ser aplicada para caracterizar complexos de proteínas de membrana ou complexos proteicos de qualquer outra espécie pela sua recombinação como possível.