Identificação de complexos de proteínas em Escherichia coli Utilizando a purificação por afinidade sequencial Peptide em combinação com espectrometria de massa tandem

O objetivo deste experimento é identificar proteínas, interações proteicas e a composição de subunidades de complexos MultiPro nativos de e coli. Isso é obtido amplificando os produtos de PCR linear específicos da sequência, codificando a etiqueta SPA e um marcador selecionável, que são integrados e expressos no quadro como fusões de terminais carboxi em um fundo ddy 3, 3 0 usando bactérias Sistema de recombinação Fage lambda como uma segunda etapa A purificação de duas etapas é realizada usando modlin de vaca e grânulos de afinidade Anti-Flag para recuperar com eficiência complexos de proteínas de baixa abundância. Em seguida, as proteínas ligadas aludidas com modlin de vaca, tampão de eluição ou CEB são digeridas com tripsina e processadas com espectrometria de massa para identificação de proteínas.

Os resultados obtidos mostram que as várias subunidades da enzima RNA polimerase central, incluindo a terminação da transcrição, anti-fatores de determinação co-purificados eficientemente com a proteína da subunidade D da RNA polimerase marcada, indicando que os componentes recém-associados podem ser descobertos de forma eficiente usando esta abordagem. Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades com duas purificações de afinidade redonda, onde o processamento cuidadoso dos lisados celulares com soluções tampão apropriadas é absolutamente necessário para garantir o sucesso na recuperação eficiente de complexos de carga de baixa e alta abundância de culturas em grande escala Demonstrando os procedimentos de purificação de afinidade e espectrometria de massa estarão Olga Kagan e HBO guo dois técnicos em meu laboratório. Este protocolo começa com o direcionamento de sequências amplificadas específicas para a cepa DDY três 30 na qual a maquinaria de recombinação vermelha Lambda é expressa conforme descrito no protocolo escrito.

Em seguida, onde a bactéria farge o sistema de recombinação Lambda expressando tensão durante a noite em dois mililitros de Luria bati ou meio LB a 32 graus Celsius, agitando a 180 RPM no dia seguinte, inocular um mililitro da cultura noturna em 70 mililitros de meio LB fresco em um frasco cônico de 500 mililitros. Aumente o inóculo a 32 graus Celsius agitando a 180 RPM até que o OD 600 atinja cerca de 0,8. Induzir as células incubando o frasco em banho-maria a 42 graus Celsius, agitando suavemente a 180 RPM durante 15 minutos.

Imediatamente após a indução, incubar o balão num banho de lama com água gelada durante, pelo menos, 30 minutos, agitando. Depois de colher e lavar as células conforme descrito no procedimento escrito, Reese suspende o pellet celular em 700 microlitros de gelo, água fria e estéril, resultando em células eletrocompetentes por meio de eletroporação. Introduza um microlitro do amplicon purificado em 40 microlitros das células eletrocompetentes.

As células são eletroporadas após recombinação e integração homólogas. Os transformantes que recombinaram com sucesso o de barra de tag no cromossomo são selecionados com base na resistência à micina pode selecionar vários transformadores para western blotting para verificar a geração correta das proteínas de fusão marcadas com SPA com anticorpo Anti-Flag M dois que é seletivo contra os epítopos de bandeira da etiqueta SPA Transfira 10 mililitros da cultura noturna para 990 mililitros de tb fresca. Suplementado com 25 microgramas por mililitro de micina em lata em um frasco de quatro litros.

Cultive a cultura a 32 graus Celsius com agitação constante a 250 RPM por cinco a seis horas até que o OD 600 atinja entre dois a três. Transfira a cultura de um litro de e-coli SPA para frascos de centrifugação limpos e gire as células a quatro graus Celsius e 3.993 vezes G por 15 minutos. Após a suspensão das células conforme descrito no protocolo escrito.

Transfira as amostras para um copo estéril de aço inoxidável colocado no gelo para sonicação. Mergulhe a sonda na amostra e sonice durante três minutos. Após a sonicação, deixe dois minutos adicionais para resfriar a amostra do superaquecimento após a centrifugação do lisado de sonicato.

Transferir cuidadosamente o sobrenadante S do tubo de centrifugação para um tubo de polipropileno de 50 ml. Congelar a amostra com azoto líquido e armazenar o extracto de células congeladas sonicadas durante um período máximo de seis meses a 80 graus Celsius negativos para utilização futura. Para iniciar a purificação de afinidade para o extrato de células sonicadas congeladas, colocando o tubo em água fria, incube o extrato de células TH com três microlitros de benzo, uma nuclease por 30 minutos de quatro graus Celsius.

A esta mistura, adicione o detergente não iônico Triton X 100 e suspensões de 200 microlitros de Anti-Flag M duas esferas agro. Misture suavemente o conteúdo girando o tubo por três horas a quatro graus Celsius após três horas de rotação, centrifugue o tubo a 1.700 vezes G por seis minutos. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o máximo possível do saciado, sem perturbar o pellet de velocidade solta.

Suspenda novamente o pellet no SNA restante e transfira para uma coluna de preparação de polipropileno. Remova os plugues de saída inferiores da coluna para permitir que o eluído seja drenado por gravidade. Fluir. Em seguida, lave a coluna cinco vezes com 200 microlitros de uma vez um tampão FC e prossiga para Cleve com TEV conforme descrito no protocolo escrito.

Seguindo a clivagem rapidamente na parte superior e inferior da coluna firmemente. Misture delicadamente o conteúdo da coluna girando durante a noite a quatro graus Celsius após a rotação durante a noite. Drene o eluído removendo a tampa superior e o plugue inferior para a nova coluna.

Lave a coluna antiga com 400 microlitros de um tampão de encadernação cal cal e suspensão de 150 microlitros de contas de ligação Cal Modlin. Eluir a proteína ligada em quatro frações de 50 microlitros em um tubo de eend orph fresco. Usando um tampão de eluição de Modlin x cal.

Distribuir a fracção eluída em dois tubos limpos e em volumes iguais. Em seguida, seque o conteúdo de ambos os tubos usando um aspirador de velocidade. O eluato seco de um tubo é usado para passar um gel de coloração de prata, conforme descrito no texto, enquanto o outro é armazenado a 80 graus Celsius negativos.

Para uso futuro em espectrometria de massa na amostra seca, adicione 50 microlitros do tampão de digestão e 0,9 microlitros de ácido clorídrico tris fosfina 100 milimolares incube a mistura por 45 minutos em temperatura ambiente para a etapa de redução Em seguida, adicione um microlitro da acetamida IDO 500 milimolar e incube no escuro por mais 40 minutos. Para permitir a alquilação da amostra Após a segunda rodada de incubação, adicione um micrograma de viagens à mistura. Incubar a amostra a 37 graus Celsius por cinco horas ou durante a noite em temperatura ambiente após a incubação.

Certifique-se de interromper a reação adicionando um microlitro de ácido acético. Em seguida, prepare a ponta do zíper Millipore, a ponta da pipeta conforme descrito no texto para uma ligação eficiente do peptídeo ao tubo da ponteira. Misture a mistura de peptídeos 20 vezes, lave a mistura de peptídeos que fez na ponta, aspirando e dispensando a solução de lavagem.

Repita este procedimento duas vezes para uma ligação eficiente da mistura de peptídeos à ponta com a ponta contendo o peptídeo ligado. Aspirar 10 microlitros da solução de umedecimento e equilíbrio e dispensar em um tubo de eend orph limpo. Repita esta etapa duas vezes.

Após a secagem das amostras eluídas em vácuo de velocidade, as amostras podem ser analisadas imediatamente por espectrometria de massa ou armazenadas a menos 80 graus Celsius antes do uso. As microcolunas usadas neste procedimento são embaladas com aproximadamente 10 centímetros de resina C 18 lunar de três mícrons e são conectadas a uma fonte de íons nano eletrospray pro Zion que é colocada em linha com o instrumento orbitrap. Uma bomba de HPLC binária de fluxo nano pro Zion é usada para fornecer uma taxa de fluxo de ponta estável de aproximadamente 300 nanolitros por minuto durante as separações de peptídeos para obter a diluição do peptídeo, configurar um gradiente tampão orgânico de acordo com a complexidade da amostra.

Para esta amostra de SPA de e coli, o solvente de fase móvel A tem 95% de água de gradiente de HPLC e 5% de aceto nitrilo com 0,1% de ácido fórmico, enquanto o solvente B tem 5% de água de gradiente de HPLC e 95% de aceto nitrilo com 0,1% de ácido fórmico após pesquisa de espectrometria de massa nos espectros usando um algoritmo de pesquisa de banco de dados, como seaquest, em um banco de dados de sequências de proteínas de e coli. Filtre estatisticamente o resultado usando um algoritmo de probabilidade, como star quest, para garantir uma baixa taxa de descoberta falsa, tanto o fator sigma da RNA polimerase marcada com SPA quanto a proteína yak LA de função desconhecida copurificada especificamente com a enzima RNA polimerase central, incluindo subunidades alfa beta e beta primo, bem como o fator de reciclagem de RNA polimerase. Em contraste com o fator sigma da RNA polimerase marcada, yak L liga-se adicionalmente a um fator essencial de terminação de transcrição anti-determinação, sugerindo uma função especializada na transcrição.

Várias outras proteínas copurificadoras menores também foram detectadas por LCMS que não eram aparentes no gel, incluindo a subunidade Omega da RNA polimerase e fatores de transcrição, terminação e determinação e EUA e NUSD. Por outro lado, em um experimento independente marcado mobilização de maquinário de enxofre, S-U-F-B-S-U-F-C e SUFD copurificaram um com o outro, indicando participação conjunta na biossíntese de aglomerados de enxofre de ferro como um único complexo de andaimes. Este exemplo representativo destaca o fato de que complexos MultiPro bacterianos altamente anotados anteriormente bem estudados que participam de processos biológicos essenciais geralmente têm novos componentes associados que podem ser identificados com eficiência.

Usando essa abordagem, o baixo número de cópias da proteína SUFB pode ter resultado em intensidade de sinal fraca em relação à forte intensidade observada nos experimentos de pull down SUFC e SUFD para definir a composição de complexos de proteínas multi-unidades estáveis, pontuações de copurificação foram atribuídas a interações de alta confiança, levando em consideração a singularidade da presa da isca, relações de isca e presa. Em seguida, usando procedimentos de agrupamento de grafos, como o algoritmo de agrupamento de markoff. Clusters discretos de proteínas são identificados a partir da rede PPI probabilística particionada.

Redes de interação putativas podem ser visualizadas usando o cyto scape. A combinação de dados proteômicos com evidências adicionais de associação funcional inferidas por métodos genômicos pode ser usada para investigar novos papéis mecanicistas de proteínas e coli previamente anotadas. Aqui, sub-redes de complexos de proteínas e módulos funcionais que participam como vizinhanças funcionais mais amplas foram definidas em e coli.

O cluster hierárquico principal Graham mostra os padrões de previsões funcionais e anotações existentes para os genes funcionalmente órfãos e caracterizados de e coli, as cores amarela e azul representam funções existentes e inferidas, respectivamente, enquanto as intensidades de sombra refletem os escores de confiança. Os processos biológicos associados a vários bairros são indicados à direita, as inserções mostram os componentes individuais de um bairro representativo com base nos escores de similaridade da rede de interação física e funcional integrada. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como os complexos de proteínas estáveis da estia Coli podem ser isolados usando a purificação de afinidade acoplada à abordagem de espectrometria de massa.

Em princípio, esta técnica pode ser aplicada para caracterizar complexos proteicos de membrana ou complexos proteicos de qualquer outra espécie para sua recombinação possível.