Name: Uma plataforma microfluídica para a isolação de alta taxa de transferência de célula única e Cultura (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Aprenda a fabricar e operar um chip microfluídico para isolamento e cultura de célula única com alta eficiência. Este método minimiza danos celulares e aplica-se a estudos de heterogeneidade e diagnóstico de câncer.

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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do National Health Research Institutes (03-A1 BNMP11-014).

Nota: Os desenhos fotomáscara para a fabricação de dispositivos microfluídicos foram desenhadas usando um software de desenho assistido por computador (CAD). Os desenhos foram então utilizados para fabricar máscaras de crómio usando um serviço comercial. Os dispositivos PDMS foram feitas usando técnicas de litografia suave 11. 1. Fabricação de Mestre Moldes por litografia <ol><li> Antes do processo de fotolitografia 12, utilizar as bolachas de silício de 4 polegadas como um substrato e desidratar as bolachas em um forno convencional a 120 ° C durante 10 min. </li><li> Limpar as bolachas de silício desidratados usando oxigénio tratamento com plasma a 100 watts durante 30 segundos em um aspirador de plasma. </li><li> Pré-aqueça duas placas a 65 ° C e 95 ° C, respectivamente, para o seguinte processo de cozimento. </li><li> Brasão de 5 g de fotorresiste negativo (PR) sobre as pastilhas de silício limpo por um revestidor de rotação; de centrifugação a 1.200 rpm (SU-8 de 50) durante 30 segundos para produzir a camada de microcanais. </li><li> Coloque o PRrevestidos bolacha numa placa de aquecimento pré-aquecido a 65 ° C durante 12 min e transferi-lo para uma outra placa de aquecimento pré-aquecido a 95 ° C durante 33 min (para os padrões de 100 um de espessura) para executar um processo de cozer macio. </li><li> Após o cozimento, coloque a pastilha de silício PR revestido sobre o titular de um alinhador semi-automatizado máscara e alinhá-lo a um photomask transparência 25.400 dpi de resolução. </li><li> Expor a bolacha de silício revestido de RP à luz UV (365 nm) a uma dose de 500 mJ / cm 2 para criar o padrão de PR na bolacha de silício. </li><li> Remova o wafer do alinhador e colocá-lo numa placa de aquecimento para pós-cozimento a 95 ° C por 12 min. </li><li> Mergulhe as bolachas em SU-8 desenvolvedor de soluções (acetato de éter propilenoglicol monometílico, PGMEA) para lavar PR não reticulada de 12 min e secar delicadamente com azoto para expor as marcas de alinhamento. </li><li> Mais uma vez, revestimento 5 g de fotorresiste negativo sobre as bolachas por um revestidor de rotação; rotação de 700 rpm (SU-8 100) durante 30 segundos e 1.200 rpm (SU-8 10) por 30 s para 300 &amp;# 181; m padrão de espessura e 27 mm padrão de espessura, respectivamente, para fazer a camada de micropoços. </li><li> Coloque a bolacha PR revestido numa placa de aquecimento a 65 ° C durante 4 minutos e a 95 ° C durante 8 minutos (para 27 uM camada de captura de poços profundos); e a 65 ° C durante 40 min e a 95 ° C durante 110 minutos (para 300 uM camada cultura poços profundos). </li><li> Após arrefecimento, colocar a pastilha de silício revestido PR no alinhador máscara equipado com luz UV. </li><li> Expor a bolacha de silício revestido de PR para a luz UV (365 nm) a uma dose de 250 mJ / cm 2 (27 uM para padrão de espessura) e 700 mJ / cm 2 (por 300 um de espessura padrão). </li><li> Coza as bolachas a 95 ° C durante 5 min (27 uM padrão de espessura) e 30 min (300 um de espessura padrão), respectivamente. </li><li> Lavar o PR não reticulado pela PGMEA durante 6 minutos (27 uM padrão de espessura) e 25 min (300 um de espessura padrão), respectivamente, e em seguida secá-los com azoto gasoso. </li><li> Medir a altura do padrão apresenta emo wafer com uma profilometer de varredura a laser, colocando a bolacha sobre o xy-estágio de um profilometer de varredura a laser. <ol><li> Ajuste o plano focal para mostrar claramente o padrão apresenta na bolacha usando o modo de observação &quot;visão da câmera&quot; sob uma lente objetiva de 20X. </li><li> Mude o modo de observação de &quot;visão da câmera&quot; para &quot;visão laser&quot;, e definir as posições superior e inferior dos recursos. </li><li> Defina o modo de medição, área, qualidade, e z-pitch até transparente (em cima), 1 linha (1.024 x 1), de alta precisão e 0,5 mm, respectivamente, e, em seguida, pressione a parte inferior start para iniciar a medição. </li></ol></li></ol> 2. Preparação de dispositivos PDMS para isolamento de células Individual <ol><li> Antes de fundição PDMS, silanizar os moldes mestres com trichlorosilane para criar uma superfície hidrofóbica, o que torna mais fácil descolar as réplicas PDMS dos moldes mestre. <ol><li> Coloque os moldes de mestre e um barco ponderação contendo200 ul de triclorossilano num secador, e aplicar vácuo (-85 kPa) durante 15 min. </li><li> Pare o vácuo e, em seguida, deixar os moldes mestres no exsicador para silanizar os moldes mestres à temperatura ambiente durante pelo menos 1 h. </li><li> Retire os moldes mestres do exsicador e coloque cada molde mestre em um 10 centímetros placa de Petri. </li></ol></li><li> Misturar uma quantidade total de polímero de PDMS kit de 17,6 g contendo uma base e um agente de cura a uma razão de 10: 1, e em seguida, despejar o PDMS no molde mestre na placa de Petri. </li><li> Colocar a placa de Petri num exsicador e aplicar vácuo (-85 kPa) durante 1 h para remover as bolhas de ar nas PDMS. </li><li> Remova a placa de Petri do exsicador e colocá-lo num forno convencional a 65 ° C durante 3-6 horas para curar o PDMS. </li><li> Retirar as réplicas PDMS curado a partir dos moldes mestres e dois furos como uma entrada e uma saída nas duas extremidades do microcanal no array PDMS réplica captura poços por um perfurador com diâmetro interior de 0.75 mm para o canal de fluidos (Figura 2A). </li><li> Use fita para limpar a superfície das réplicas de PDMS, e, em seguida, colocar o PDMS réplicas em um produto de limpeza de plasma por tratamento com plasma de oxigénio breve (100 watts durante 14 seg). </li><li> Remover o PDMS réplicas da máquina de plasma de oxigénio. </li><li> Alinhar uma réplica superior (contendo os micropoços de captura) e um PDMS inferior (contendo os micropoços de cultura) com a mão sob um microscópio estereoscópico e trazê-los em contato. </li><li> Coloque as réplicas PDMS alinhados num forno a 65 ° C durante 24 horas para conseguir a ligação permanente entre as réplicas PDMS para formar o dispositivo final. </li><li> Embeber o dispositivo PDMS em uma desionizada (DI) -água recipiente cheio e colocar o recipiente em um exsicador sob vácuo (-85 kPa) durante 15 min para remover o ar a partir do microcanal do dispositivo de PDMS. </li><li> Coloque o dispositivo PDMS cheio de água desionizada em um capuz de cultura de tecidos e utilizam a luz UV (comprimento de onda da luz: 254 nm) para esterilizar o dispositivo para 30 min. </li><li> Substituir a água Dl no dispositivo de PDMS com uma albumina de soro bovino a 5% (BSA) em solução de PBS 1x e incubar a 37 ° C durante 30 min para evitar que as células se colem à superfície do PDMS. Nota: O revestimento de BSA é crítica para melhorar a eficiência da transferência de células isoladas a partir de captura de poços para cultura poços. </li><li> Substituir a solução de BSA a 5% no dispositivo de PDMS com solução 1x PBS esterilizado. </li></ol> 3. Preparação da suspensão de uma única célula <ol><li> Cultura Neural stem KT98 célula, e A549 de células de carcinoma humano e MDA-MB-435 que, em uma placa de Petri em incubadora de cultura de célula convencional (37 ° C, 5% de CO 2, e 95% de humidade) para preparar as células para a experiência celular dispositivo PDMS . </li><li> Remover e descartar o meio de cultura gasto (meio basal DMEM fornecido com antibióticos 10% de soro fetal bovino e 1%) a partir do prato de cultura com células crescidas a 70-80% de confluência. </li><li> Lavar cuidadosamente as células com esterilizados PBS três vezes. &lt;/ Li&gt; <li> Retirar e descartar o PBS e adicionar 2 ml de uma mistura de enzima recombinante com proteolíticas, e atividades DNase colagenolíticas (por favor consulte a lista de materiais para informações detalhadas). </li><li> Incubar a placa de cultura à temperatura ambiente durante 5 min, e depois toque no prato de cultura para facilitar a separação celular. </li><li> Adicione 4 ml de PBS esterilizado para dispersar as células, e em seguida, transferir a suspensão celular para um tubo de 15 ml. </li><li> Centrifuga-se o tubo a 300 xg durante 3 min e remover o sobrenadante. </li><li> Suavemente ressuspender o sedimento celular em 1 ml de PBS esterilizado e contar o número de células vivas utilizando o método de exclusão com Trypan Blue padrão 13. Nota: Esta etapa de ressuspensão é crítica para a preparação de suspensão de uma única célula bem dissociado para melhorar a eficiência de isolamento de uma única célula. </li></ol> 4. Isolamento de célula única e Cultura Clonal <ol><li> Carga de 50 ul de suspensão celular a uma concentração de 2,2-2,5 x 10 <sup&gt; 6 células / ml no microcanal do dispositivo PDMS via orifício de saída do dispositivo com uma pipeta de mão. Nota: O carregamento de pipeta suspensão de células precisa ser parado e realizada na primeira posição de paragem para evitar a introdução de bolhas de ar dentro do microcanal. </li><li> Carregar mais 50 ul de suspensão de células através do orifício de entrada para preencher uniformemente-se todo o microcanal com células. </li><li> Fecha-se o orifício de saída com uma ficha (A, 1 mm de diâmetro cortado em nylon linha de pesca 3 milímetros de comprimento) para evitar o escoamento induzido pela pressão hidrostática das gotas em orifícios de entrada e de saída. Nota: Os tampões foram esterilizados UV dentro de um capuz de cultura de tecidos antes da utilização. </li><li> Encha uma seringa estéril 1 ml com meio de cultura, retire as bolhas de ar, e configurá-lo em uma bomba de seringa. </li><li> Ligar a forma carregada seringa para o orifício de entrada do dispositivo de PDMS através de uma agulha G 23 sem corte e uma tubagem de poli-tetrafluoroethene (PTFE). </li><li> Retire a ficha da furo de saída e todosow um intervalo de tempo de 2 min para permitir que as células a instalar-se nos unicelulares captura de poços por força gravitacional. </li><li> Lavar as células não confinadas com 300 ul de meio de cultura a uma taxa de fluxo de 600 mL / min impulsionado pela bomba de seringa. </li><li> Espera durante 2 min para estabilizar o aparelho, e vedar os orifícios de entrada e de saída com fichas de modo a formar um sistema de cultura fechada. </li><li> Virar o dispositivo com a mão para transferir as células individuais capturados para os micropoços de cultura. </li><li> Coloque o dispositivo PDMS em uma placa de cultura de tecido de 100-mm, e adicionar 10 ml de PBS esterilizado em torno do dispositivo de cultura para evitar a evaporação do meio do microcanal. </li><li> Mover o prato de cultura para uma incubadora convencional de cultura de células (37 ° C, 5% de CO 2, e 95% de humidade) para a cultura clonal das células individuais. </li></ol> 5. Meio de Cultura Reposição <ol><li> Depois de 1 d de cultura, substituir o meio de cultura no dispositivo de PDMS com meio fresco para melhorar PR célulaoliferation. </li><li> Colocar duas gotas de meio de cultura na parte superior do dispositivo de PDMS perto das áreas de entrada e saída de buracos para evitar a introdução de bolhas de ar para dentro do microcanal, enquanto executa o passo seguinte. </li><li> Perfurar dois buracos da parte superior do dispositivo de PDMS perto das duas extremidades do microcanal como uma entrada e uma saída para o microcanal. Nota: Não perfurar toda a duas camadas do dispositivo PDMS; em vez disso, apenas perfurar através da camada superior do PDMS. </li><li> Conecte uma seringa de plástico de 1 ml contendo meio fresco para a entrada através de um G agulha romba 23 e tubos de PTFE. </li><li> Fluxo médio de 120 ul fresco para dentro do dispositivo durante 5 minutos para substituir o meio velho. </li><li> Inserir dois tampões para selar a entrada e a saída de furos, e devolver o dispositivo para a incubadora de cultura de células. </li><li> Refrescar o meio de cultura a cada 2 d durante o período de cultura, removendo os tampões de vedação, seguido pela repetição dos passos 5,4-5,5. </li></ol>

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<li>Liang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+Screening+Using+a+Library+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+Reveals+Disease-Specific+Patterns+of+Cardiotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Drug Screening Using a Library of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Reveals Disease-Specific Patterns of Cardiotoxicity.</a> Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Sistemas de dispositivo baseado em micropoços 6,14 têm sido utilizados para a manipulação de uma única célula e análise, tal como uma única célula em larga escala prendendo 6 e proliferação de células-tronco hematopoiéticas único 15. Embora o tamanho bem, número e forma podem ser ajustados a aplicações específicas, a eficiência de isolamento de uma única célula está sempre comprometida quando o tamanho do poço é aumentada. 9,15 Para superar esta li...

Actualmente colocando células isoladas individualmente num espaço de cultura é geralmente conseguido através de diluição limitante ou de células activadas por fluorescência (FACS). Para muitos laboratórios, diluição limitante é um método conveniente, uma vez que requer apenas uma pipeta e placas de cultura de tecidos, as quais estão prontamente disponíveis. Neste caso, uma suspensão de células é diluída em série até uma densidade celular apropriada, e, em seguida, colocados em poços de cultura, utilizando uma pipeta manual. Estas células individuais compartimentados são então utilizados para análise de células, tais como heterogeneidade genética e rastreio de uma colónia de formação 2. No entanto, este método é de baixo rendimento e de trabalho intensivo, sem a utilização de um braço robótico para assistência, devido à natureza distribuição de Poisson do método de diluição limitante restringe eventos de uma única célula a uma probabilidade máxima de 37% 3. máquinas de FACS com um braço robótico integrado pode superar a limitação da distribuição de Poisson pela precisão placção de uma única célula em um poço de cultura de cada vez 4. No entanto, a alta tensão de cisalhamento mecânico (assim, reduzido a viabilidade celular) 5 e compra da máquina e os custos operacionais têm limitado o seu uso em muitos laboratórios. Para superar as limitações acima, em microescala dispositivos têm sido desenvolvidos para carregar altamente eficiente de células individuais em micropoços 6. No entanto, os micropoços não proporcionar um espaço adequado para as células carregadas com a proliferar, devido à necessidade de tornar o tamanho de cada micropoço próximo do de uma única célula de carga para maximizar a probabilidade de uma única célula. Como são necessários ensaios de cultura em muitas aplicações baseadas em células (por exemplo, ensaio clonogénico 7), micropoços maiores (90-650 um de diâmetro ou de comprimento lateral) também têm sido utilizados para permitir a culturas celulares prolongadas. No entanto, como o método da diluição limitante, eles também possuem baixas eficiências de carga de células individuais, que variam de 10 -. 30% 8, 9 Anteriormente, nós desenvolvemos uma plataforma de microfluidos de alto rendimento para isolar células individuais em micropoços individuais e demonstrar a sua aplicação no ensaio clonogénico das células isoladas. 10 O dispositivo foi feito com poli-dimetilsiloxano (PDMS), e compreende dois conjuntos de matrizes de micropoços com diferentes tamanhos de microcavidades, que podem melhorar em grande medida a eficiência no carregamento de uma única célula em um micropoço cujo tamanho é significativamente maior do que a célula. Notavelmente, este conceito &quot;dupla bem&quot; permite que o tamanho da área de cultura a ser ajustada de forma flexível, sem afectar a eficiência da captação de uma única célula, tornando-a simples de ajustar o desenho do dispositivo para se adequar a diferentes tipos de células e aplicações. Este método de elevada eficiência deveria ser útil para experiências de cultura de células de longo prazo para os estudos de heterogeneidade da célula e estabelecimento linha celular monoclonal.

<table><tbody><tr><td>Software AutoCAD</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD LT 2011</td><td>Parte No. 057C1-74A111-1001</td></tr><tr><td>Wafer de silício&nbsp;</td><td>Eltech corperation</td><td>SPE0039</td><td></td></tr><tr><td>Forno convencional</td><td>YEONG-SHIN empresa</td><td>ovp45</td><td></td></tr><tr><td>Limpador de plasma</td><td>Nordson</td><td>AP-300</td><td>Sistema de tratamento de plasma de bancada</td></tr><tr><td>SU-8 50 fotorresistente negativo</td><td>MicroChem</td><td>Y131269</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 100 fotorresistente negativo</td><td>MicroChem</td><td>Y131273</td><td></td></tr><tr><td>Revestidor de rotação</td><td>Synrex Co., Ltd.</td><td>SC-HMI 2 "~ 6"</td><td></td></tr> <tr><td>Placa de aquecimento</td><td>YOTEC empresa</td><td>YS-300S</td><td></td></tr><tr><td>Msak alinhador</td><td>Deya Optronic CO.</td><td>A1K-5-MDA</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 desenvolvedor</td><td>Grand Chemical Companies</td><td>GP5002-000000-72GC</td><td>Propilenoglicol monometil éter acetato</td></tr><tr><td>Perfilômetro a laser de varredura</td><td>KEYENCE</td><td>VK-X 100</td><td></td></tr><tr><td>Triclorosilano</td><td>Gelest, Inc</td><td>SIT8174.0</td><td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctil. Perigoso. Corrosivo para o trato respiratório, reage violentamente com a água.</td></tr><tr><td>Dessecador</td><td>Bel-Art Products</td><td>F42020-0000</td><td>Dessecador a vácuo economizador de espaço 190&nbsp; mm base branca</td></tr><tr><td>Polidimetilsiloxano (PDMS) kit</td><td>Dow corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Harris Uni-Core perfurador</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>15072</td><td>com fita removível de diâmetro interno de 0,75 mm</td></tr><tr><td></td><td>3M Company</td><td>Fita removível escocesa 811</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica E24</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Bersing Technology</td><td>ALB001.500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM meio basal</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Thermo Hyclone</td><td>SH30071.03HI</td><td></td></tr><tr><td>Antibióticos</td><td>Biowest</td><td>L0014-100</td><td>Glutamina-Penicilina-Estreptomicina</td></tr><tr><td>Mistura enzimática recombinante</td><td>Tecnologia celular inovadora</td><td>AM-105</td><td>Accumax</td></tr><tr><td>DiIC12(3) corante de membrana celular</td><td>BD Biosciences</td><td>354218</td><td>Usado como rastreador celular</td></tr><tr><td>Bomba de seringa</td><td>Harvard Apparatus</td><td>703007</td><td></td></tr><tr><td>Plastic (1 ml)</td><td>BD Biosciences</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>agulhas rombas de calibre 23</td><td>Ever Sharp Technology, Inc.</td><td>Tubulação de</td> poli-tetrafluoreteno (PTFE) TD21 <td></td></tr><tr><td></td><td>Ever Sharp Technology, Inc.</td><td>Diâmetro interno do TFT-23T</td><td>, 0,51&nbsp; milímetro; diâmetro externo, 0,82&nbsp; milímetro</td></tr></tbody></table>

uma plataforma microfluídica para a isolação de alta taxa de transferência de célula única e cultura

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Estudar a heterogeneidade de células individuais é crucial para muitas questões biológicas, mas é tecnicamente difícil. Assim, há a necessidade de um método simples, mas de alto rendimento, para realizar experimentos de cultura de células únicas. Aqui, relatamos uma estratégia baseada em chip microfluídico para isolamento de célula única de alta eficiência (~ 77%) e demonstramos sua capacidade de realizar cultura de célula única de longo prazo (até 7 d) e análise de heterogeneidade celular usando ensaio clonogênico. Essas aplicações foram demonstradas com células-tronco neurais de camundongo KT98 e células cancerígenas humanas A549 e MDA-MB-435. A alta eficiência de isolamento de célula única e a capacidade de cultura de longo prazo são alcançadas usando diferentes tamanhos de micropoços na parte superior e inferior do canal microfluídico. A matriz de micropoços pequenos é projetada para isolar com precisão células únicas, e a matriz de micropoços grandes é usada para cultura clonal de célula única no chip microfluídico. Esta plataforma microfluídica constitui uma abordagem atraente para aplicações de cultura de células únicas, devido à sua flexibilidade de espaços de cultura de células ajustáveis para diferentes estratégias de cultura, sem diminuir a eficiência do isolamento.

A plataforma de microfluidos para o isolamento de uma única célula e de cultura compreende um micro-canal (200 um de altura) com dois conjuntos de matrizes de micropoços (Figura 2A). Os dois conjuntos de matrizes de micropoços são denominados como captura de poços (25 um de diâmetro e 27 uM em profundidade) e cultura poços (285 um de diâmetro e 300 mm de profundidade) para o isolamento de uma única célula e a cultura, respectivamente, e cada captura-se bem posicionada no...

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e cultivar células únicas com uma plataforma microfluídica, que utiliza um novo conceito de design de micropoços para permitir o isolamento de célula única de alta eficiência e cultura clonal de longo prazo.

Uma plataforma microfluídica para a isolação de alta taxa de transferência de célula única e Cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar a fabricação e o funcionamento de um chip microfluídico, que permite o isolamento e o cultivo de células individuais com alta eficiência. Este método fornece uma ferramenta útil para qualquer área que se beneficie do isolamento e cultivo de células individuais. A principal vantagem desta técnica é sua alta eficiência no carregamento de células individuais em matrizes de micropoços de grande porte.Além disso, apenas fluxo suave e a força gravitacional são utilizados para operar o dispositivo, o que minimiza o dano celular. A implicação desta técnica direciona-se ao diagnóstico final de doenças humanas, como o câncer, em que a heterogeneidade celular afeta a resposta da célula; tivemos a ideia de desenvolver este método quando estávamos estabelecendo linhagens celulares em micropoços, porque o método de diluição limitante era muito demorado e ineficiente. Atualmente, este método pode fornecer informações sobre a análise de células individuais.Ele também pode ser aplicado a outras aplicações, como o estabelecimento e a temporalidade da observação do curso e comportamento de células individuais. Para começar, fabrique moldes-mestre silanizados para a camada de isolamento de célula única e para a camada de cultura em micropoços, utilizando fotolitografia padrão conforme descrito no protocolo textual complementar. Para cada molde-mestre, combine 16 gramas da base de PDMS com 1,6 gramas de um agente de cura em um copo descartável e misture até homogeneização.Em seguida, coloque os moldes mestres em placas de Petri de 150 milímetros e despeje o PDMS sobre os moldes. Coloque as placas de Petri em um dessecador e aplique vácuo por uma hora para remover bolhas de ar do PDMS. Após uma hora, retire as placas do dessecador e coloque-as em uma estufa convencional a 65 graus Celsius por três a seis horas para curar o PDMS.Em seguida, retire as placas do forno e deixe esfriar até a temperatura ambiente. Após esfriar, retire cuidadosamente o arranjo de poços de captura de PDMS curado e o arranjo de cultivo em micropoços dos moldes-mestre e recorte os dispositivos usando uma lâmina de barbear. Depois, utilize um furador de 0,75 milímetro para criar um orifício em cada extremidade do microcanal na camada do arranjo de poços de captura.Use fita para limpar o que será a superfície interna do dispositivo e, em seguida, coloque as camadas individuais com as superfícies internas voltadas para cima em um limpador de plasma para um breve tratamento com plasma de oxigênio. Após a conclusão, remova as camadas de PDMS do limpador de plasma e use um microscópio estéreo para alinhar e conectar as camadas superior e inferior do dispositivo. Coloque o dispositivo alinhado em uma estufa a 65 graus Celsius por 24 horas para criar uma ligação permanente entre as camadas de PDMS.Em seguida, coloque o dispositivo de PDMS ligado em água desionizada e coloque o recipiente em um dessecador sob vácuo por 15 minutos, a fim de remover o ar do microcanal do dispositivo. Com todo o ar agora removido do dispositivo, coloque o dispositivo de PDMS em uma câmara de cultura de tecidos e use luz ultravioleta para esterilizar a superfície do dispositivo por 30 minutos. Em seguida, substitua a água desionizada no dispositivo por albumina sérica bovina a 5% em PBS e incube o dispositivo a 37 graus Celsius por 30 minutos.Isso irá bloquear a superfície e melhorar a eficiência de transferência de células isoladas dos poços de captura para os poços de cultura. Após 30 minutos, substitua a solução de bloqueio no dispositivo por PBS estéril. Prepare uma suspensão de células simples com 2,5 milhões de células por mililitro e carregue uma pipeta com 50 microlitros da suspensão.Em seguida, transfira as células para o dispositivo através do orifício de saída do dispositivo. Carregue outros 50 microlitros da suspensão celular e transfira-os para o dispositivo através do orifício de entrada para preencher uniformemente todo o microcanal com células. Após o carregamento, utilize uma tampa estéril feita de linha de pesca de náilon com um milímetro de diâmetro para selar o orifício de saída do dispositivo.Em seguida, preencha uma seringa estéril de um mililitro com meio de cultura, elimine todas as bolhas de ar residuais e coloque-a na bomba de infusão. Conecte uma agulha romba de calibre 23 à seringa e utilize um tubo de politetrafluoretileno para conectar a agulha à entrada do dispositivo. Após conectar o tubo, remova a tampa do orifício de saída e aguarde dois minutos enquanto as células sedimentam nos poços de captura individual por força gravitacional.Em seguida, ajuste a bomba de seringa para 600 microlitros por minuto. Remova a tampa de saída e lave as células não capturadas por 30 segundos. Aguarde dois minutos para que a pressão se estabilize.Em seguida, remova o tubo da entrada do dispositivo e feche ambos os orifícios, de entrada e saída, com tampões para formar um sistema de cultura fechado. Agora, vire o dispositivo manualmente para transferir as células individuais capturadas para as micropoços de cultura do outro lado do dispositivo. Depois, coloque o dispositivo em uma placa de cultura de tecidos de 100 milímetros, adicione 10 mililitros de PBS esterilizado ao redor do dispositivo e coloque a placa em uma incubadora.Para substituir o meio de cultura, primeiro coloque duas gotas de meio de cultura sobre o dispositivo de PDMS próximo à entrada e à saída, a fim de evitar a introdução de bolhas de ar no microcanal. Em seguida, use um furador de biópsia de 0,75 milímetro para fazer dois orifícios na parte superior do dispositivo de PDMS próximo às extremidades do microcanal. Certifique-se de furar apenas a camada superior do dispositivo.Em seguida, preencha uma seringa plástica de um mililitro com meio fresco pré-aquecido e use uma agulha romba de 23 graus e tubo de PTFE para conectá-la ao novo orifício de entrada. Passe lentamente cerca de 120 microlitros de meio fresco para dentro do dispositivo ao longo de cinco minutos, substituindo o meio antigo. Ao finalizar, feche os orifícios de entrada e saída usando dois tampões e retorne o dispositivo ao incubador de cultura celular.O número de células que acabam nos poços de captura varia de cerca de 68% a 85%, dependendo do tipo de célula. Além disso, a maioria dos poços de captura contém apenas uma única célula, para os três tipos de células. Após a transferência das células KT98 capturadas para os poços de cultura, cerca de 77% dos poços tinham apenas uma célula, 16% não tinham células, 6% tinham duas células e menos de 1% dos poços tinham três ou mais células.Ao longo de sete dias, células isoladas individuais exibiram padrões de crescimento heterogêneos. Enquanto algumas células se multiplicaram, outras não. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em aproximadamente 20 minutos, se for executada corretamente.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar esta plataforma de cultura endocrina de isolamento de células únicas de alto rendimento para aumentar a produtividade de seus experimentos com células individuais. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de evitar que bolhas de ar entrem no microcanal e de impedir que as células se agreguem ao longo do tempo.

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Research

JoVE Journal

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Uma plataforma microfluídica para a isolação de alta taxa de transferência de célula única e Cultura

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