Uma plataforma microfluídica para a isolação de alta taxa de transferência de célula única e Cultura

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar a fabricação e o funcionamento de um chip microfluídico, que permite o isolamento e o cultivo de células individuais com alta eficiência. Este método fornece uma ferramenta útil para qualquer área que se beneficie do isolamento e cultivo de células individuais. A principal vantagem desta técnica é sua alta eficiência no carregamento de células individuais em matrizes de micropoços de grande porte.

Além disso, apenas fluxo suave e a força gravitacional são utilizados para operar o dispositivo, o que minimiza o dano celular. A implicação desta técnica direciona-se ao diagnóstico final de doenças humanas, como o câncer, em que a heterogeneidade celular afeta a resposta da célula; tivemos a ideia de desenvolver este método quando estávamos estabelecendo linhagens celulares em micropoços, porque o método de diluição limitante era muito demorado e ineficiente. Atualmente, este método pode fornecer informações sobre a análise de células individuais.

Ele também pode ser aplicado a outras aplicações, como o estabelecimento e a temporalidade da observação do curso e comportamento de células individuais. Para começar, fabrique moldes-mestre silanizados para a camada de isolamento de célula única e para a camada de cultura em micropoços, utilizando fotolitografia padrão conforme descrito no protocolo textual complementar. Para cada molde-mestre, combine 16 gramas da base de PDMS com 1,6 gramas de um agente de cura em um copo descartável e misture até homogeneização.

Em seguida, coloque os moldes mestres em placas de Petri de 150 milímetros e despeje o PDMS sobre os moldes. Coloque as placas de Petri em um dessecador e aplique vácuo por uma hora para remover bolhas de ar do PDMS. Após uma hora, retire as placas do dessecador e coloque-as em uma estufa convencional a 65 graus Celsius por três a seis horas para curar o PDMS.

Em seguida, retire as placas do forno e deixe esfriar até a temperatura ambiente. Após esfriar, retire cuidadosamente o arranjo de poços de captura de PDMS curado e o arranjo de cultivo em micropoços dos moldes-mestre e recorte os dispositivos usando uma lâmina de barbear. Depois, utilize um furador de 0,75 milímetro para criar um orifício em cada extremidade do microcanal na camada do arranjo de poços de captura.

Use fita para limpar o que será a superfície interna do dispositivo e, em seguida, coloque as camadas individuais com as superfícies internas voltadas para cima em um limpador de plasma para um breve tratamento com plasma de oxigênio. Após a conclusão, remova as camadas de PDMS do limpador de plasma e use um microscópio estéreo para alinhar e conectar as camadas superior e inferior do dispositivo. Coloque o dispositivo alinhado em uma estufa a 65 graus Celsius por 24 horas para criar uma ligação permanente entre as camadas de PDMS.

Em seguida, coloque o dispositivo de PDMS ligado em água desionizada e coloque o recipiente em um dessecador sob vácuo por 15 minutos, a fim de remover o ar do microcanal do dispositivo. Com todo o ar agora removido do dispositivo, coloque o dispositivo de PDMS em uma câmara de cultura de tecidos e use luz ultravioleta para esterilizar a superfície do dispositivo por 30 minutos. Em seguida, substitua a água desionizada no dispositivo por albumina sérica bovina a 5% em PBS e incube o dispositivo a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Isso irá bloquear a superfície e melhorar a eficiência de transferência de células isoladas dos poços de captura para os poços de cultura. Após 30 minutos, substitua a solução de bloqueio no dispositivo por PBS estéril. Prepare uma suspensão de células simples com 2,5 milhões de células por mililitro e carregue uma pipeta com 50 microlitros da suspensão.

Em seguida, transfira as células para o dispositivo através do orifício de saída do dispositivo. Carregue outros 50 microlitros da suspensão celular e transfira-os para o dispositivo através do orifício de entrada para preencher uniformemente todo o microcanal com células. Após o carregamento, utilize uma tampa estéril feita de linha de pesca de náilon com um milímetro de diâmetro para selar o orifício de saída do dispositivo.

Em seguida, preencha uma seringa estéril de um mililitro com meio de cultura, elimine todas as bolhas de ar residuais e coloque-a na bomba de infusão. Conecte uma agulha romba de calibre 23 à seringa e utilize um tubo de politetrafluoretileno para conectar a agulha à entrada do dispositivo. Após conectar o tubo, remova a tampa do orifício de saída e aguarde dois minutos enquanto as células sedimentam nos poços de captura individual por força gravitacional.

Em seguida, ajuste a bomba de seringa para 600 microlitros por minuto. Remova a tampa de saída e lave as células não capturadas por 30 segundos. Aguarde dois minutos para que a pressão se estabilize.

Em seguida, remova o tubo da entrada do dispositivo e feche ambos os orifícios, de entrada e saída, com tampões para formar um sistema de cultura fechado. Agora, vire o dispositivo manualmente para transferir as células individuais capturadas para as micropoços de cultura do outro lado do dispositivo. Depois, coloque o dispositivo em uma placa de cultura de tecidos de 100 milímetros, adicione 10 mililitros de PBS esterilizado ao redor do dispositivo e coloque a placa em uma incubadora.

Para substituir o meio de cultura, primeiro coloque duas gotas de meio de cultura sobre o dispositivo de PDMS próximo à entrada e à saída, a fim de evitar a introdução de bolhas de ar no microcanal. Em seguida, use um furador de biópsia de 0,75 milímetro para fazer dois orifícios na parte superior do dispositivo de PDMS próximo às extremidades do microcanal. Certifique-se de furar apenas a camada superior do dispositivo.

Em seguida, preencha uma seringa plástica de um mililitro com meio fresco pré-aquecido e use uma agulha romba de 23 graus e tubo de PTFE para conectá-la ao novo orifício de entrada. Passe lentamente cerca de 120 microlitros de meio fresco para dentro do dispositivo ao longo de cinco minutos, substituindo o meio antigo. Ao finalizar, feche os orifícios de entrada e saída usando dois tampões e retorne o dispositivo ao incubador de cultura celular.

O número de células que acabam nos poços de captura varia de cerca de 68% a 85%, dependendo do tipo de célula. Além disso, a maioria dos poços de captura contém apenas uma única célula, para os três tipos de células. Após a transferência das células KT98 capturadas para os poços de cultura, cerca de 77% dos poços tinham apenas uma célula, 16% não tinham células, 6% tinham duas células e menos de 1% dos poços tinham três ou mais células.

Ao longo de sete dias, células isoladas individuais exibiram padrões de crescimento heterogêneos. Enquanto algumas células se multiplicaram, outras não. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em aproximadamente 20 minutos, se for executada corretamente.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar esta plataforma de cultura endocrina de isolamento de células únicas de alto rendimento para aumentar a produtividade de seus experimentos com células individuais. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de evitar que bolhas de ar entrem no microcanal e de impedir que as células se agreguem ao longo do tempo.