Uma plataforma microfluídica para a isolação de alta taxa de transferência de célula única e Cultura

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar a fabricação e operação de um chip microfluídico, que permite o isolamento e a cultura de uma única célula de alta eficiência. Este método fornece uma ferramenta útil para qualquer área que se beneficie do isolamento e cultura de uma única célula. A principal vantagem dessa técnica é que ela é altamente eficiente no carregamento de células individuais em grandes matrizes de micropoços.

Além disso, apenas o fluxo suave e a força gravitacional são usados para operar o dispositivo, o que minimiza os danos à célula. A implicação desta técnica é voltada para o diagnóstico final de doenças humanas, como o câncer, em que a heterogeneidade celular afeta a resposta da célula, então tivemos a ideia de desenvolver esse método quando estávamos estabelecendo a linha celular de micropoços, porque o método de diluição limite era muito demorado e ineficiente. Agora, esse método pode fornecer informações sobre a análise de células individuais.

Também pode ser aplicado a outras aplicações, como o estabelecimento e o tempo de observação do curso e comportamento celular individual. Para começar, fabrique moldes mestres silanizados para a camada de isolamento de célula única e a camada de cultura de micropoços, usando fotolitografia padrão, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Para cada molde mestre, combine 16 gramas de base PDMS com 1,6 gramas de um agente de cura em um copo descartável e mexa as misturas até incorporar.

Em seguida, coloque os moldes mestres em placas de Petri de 150 milímetros e despeje o PDMS em cima dos moldes. Coloque as placas de Petri em um dessecador e aplique um vácuo por uma hora para remover as bolhas de ar do PDMS. Após uma hora, retire os pratos do dessecador e coloque-os em um forno convencional a 65 graus Celsius por três a seis horas para curar o PDMS.

Em seguida, retire a louça do forno e deixe esfriar até a temperatura ambiente. Depois de esfriar, retire a matriz de poços de captura PDMS curada e a matriz de cultura de micropoços dos moldes mestres e corte os dispositivos usando uma lâmina de barbear. Em seguida, use um punção de 0,75 milímetro para criar um furo em cada extremidade do microcanal na camada de matriz de poços de captura.

Use fita adesiva para limpar o que se tornará a superfície interna do dispositivo e, em seguida, coloque as camadas individuais com as superfícies internas voltadas para cima em um limpador de plasma para um breve tratamento com plasma de oxigênio. Quando terminar, remova as camadas de PDMS do limpador de plasma e use um microscópio estéreo para alinhar e conectar as camadas superior e inferior do dispositivo. Coloque o dispositivo alinhado em um forno a 65 graus Celsius por 24 horas para criar uma ligação permanente entre as camadas do PDMS.

Em seguida, coloque o dispositivo PDMS colado em água deionizada e coloque o recipiente em um dessecador sob vácuo por 15 minutos, a fim de remover o ar do microcanal do dispositivo. Com todo o ar agora removido do dispositivo, coloque o dispositivo PDMS em uma capa de cultura de tecidos e use luz ultravioleta para esterilizar a superfície do dispositivo por 30 minutos. Em seguida, substitua a água deionizada no dispositivo por albumina de soro bovino a 5% em PBS e incube o dispositivo a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Isso bloqueará a superfície e melhorará a eficiência de transferência de células isoladas dos poços de captura para os poços de cultura. Após 30 minutos, substitua a solução de bloqueio no dispositivo por PBS estéril. Prepare uma suspensão unicelular com 2,5 milhões de células por mililitro e carregue uma pipeta com 50 microlitros da suspensão.

Em seguida, transfira as células para o dispositivo através do orifício de saída do dispositivo. Carregue mais 50 microlitros da suspensão de células e transfira-os para o dispositivo através do orifício de entrada para preencher uniformemente todo o microcanal com células. Uma vez carregado, use um plugue estéril feito de linha de pesca de náilon de um milímetro de diâmetro para selar o orifício de saída do dispositivo.

Em seguida, encha uma seringa estéril de um mililitro com meio de cultura, ejete quaisquer bolhas de ar residuais e coloque-a na bomba da seringa. Conecte uma agulha romba de calibre 23 à seringa e use um tubo de politetrafluoretileno para conectar a agulha à entrada do dispositivo. Depois de conectar o tubo, remova o plugue do orifício de saída e aguarde dois minutos enquanto as células se acomodam nos poços de captura de célula única por força gravitacional.

Em seguida, defina a bomba da seringa para 600 microlitros por minuto. Remova o plugue da tomada e lave as células não capturadas por 30 segundos. Aguarde dois minutos para que a pressão se estabilize.

Em seguida, remova o tubo da entrada do dispositivo e vede os orifícios de entrada e saída com plugues para formar um sistema de cultura fechado. Agora vire o dispositivo manualmente para transferir as células individuais capturadas para os micropoços de cultura do outro lado do dispositivo. Em seguida, coloque o dispositivo em uma placa de cultura de tecidos de 100 milímetros, adicione 10 mililitros de PBS esterilizado ao redor do dispositivo e coloque a placa em uma incubadora.

Para substituir o meio de cultura, primeiro coloque duas gotículas de meio de cultura em cima do dispositivo PDMS perto da entrada e saída para evitar a introdução de bolhas de ar no microcanal. Em seguida, use um perfurador de biópsia de 0,75 milímetro para fazer dois furos na parte superior do dispositivo PDMS perto das extremidades do microcanal. Certifique-se de perfurar apenas a camada superior do dispositivo.

Em seguida, encha uma seringa de plástico de um mililitro contendo meio pré-aquecido fresco e use uma agulha romba de calibre 23 e um tubo de PTFE para conectá-lo à porta de entrada recém-criada. Flua lentamente aproximadamente 120 microlitros de meio fresco no dispositivo durante cinco minutos para substituir o meio antigo. Quando terminar, vede as portas de entrada e saída usando dois plugues e retorne o dispositivo à incubadora de cultura de células.

O número de células que acabam nos poços de captura varia de cerca de 68% a 85%, dependendo do tipo de célula. Além disso, a maioria dos poços de captura contém apenas uma única célula, para todos os três tipos de células. Após a transferência de células KT98 capturadas para os poços de cultura, cerca de 77% dos poços tinham apenas uma única célula, 16% não tinham células, 6% tinham duas células e menos de 1% dos poços tinham três ou mais células.

Ao longo de sete dias, as células isoladas exibiram padrões de crescimento heterogêneos. Enquanto algumas das células se multiplicaram, outras não. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em aproximadamente 20 minutos se for executada corretamente.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar essa plataforma de cultura endócrina de isolamento de célula única de alto rendimento para aumentar a produtividade de seus experimentos de célula única. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de evitar que bolhas de ar entrem no microcanal e evitar que as células se agreguem com o passar do tempo.