Visualização das respostas toxina bacteriana induzida por microscopia de fluorescência de células vivas

O objetivo deste procedimento é visualizar as respostas das células imunes às toxinas bacterianas. Primeiro, a toxina é expressa e purificada a partir de células de ouro BL 21. Uma vez confirmada a atividade e a concentração da toxina, a toxina é entregue às células imunológicas.

É realizada micro injetora e microscopia de células vivas de alta velocidade. A análise das imagens resultantes revela a cinética em tempo real das respostas das células imunes à toxina. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia, como o mecanismo de ativação do inflamassoma.

Embora esse método possa fornecer informações sobre as respostas das células imunes mediadas por toxinas, ele também pode ser aplicado a outros estímulos, incluindo tratores quimiotáticos. Primeiro temos a ideia desse método ao estudar a interação de bactérias com células imunes cultivadas e observamos interações altamente variáveis entre bactérias e células imunes. Comece a purificação de estreptococos lisina O ou SLO com uma cultura de células de ouro BL 21 contendo PAG três SLO.

Seu plasmídeo cresceu para um OD de aproximadamente 0,6. Para induzir a expressão proteica, adicione cinco mililitros de 20% de OSes à cultura e agite a 2 25 RPM em temperatura ambiente por três horas. Em seguida, transfira as bactérias para um frasco de centrífuga de 500 mililitros.

Em seguida, centrifugar a cultura a 12 000 vezes G durante 12 minutos a quatro graus Celsius após a centrifugação decantar. O supinato armazena o pellet a menos 80 graus Celsius durante a noite ou mais, se necessário. Para purificar o SLO expresso, adicione 10 mililitros de tampão de lavagem suplementado com lisozima Triton X 100 e fluoreto de fenil metil sulfuril à pipeta de pellets congelados para cima e para baixo por cerca de 15 minutos.

Para Resus, suspenda o pellet mantendo a amostra no gelo. Transfira o pellet ressuspenso para um tubo de polipropileno de fundo redondo de 50 mililitros. Sonicar o lisado usando um sonicado de sonda a 40% de saída cinco vezes por 30 segundos cada em intervalos de 30 segundos com 30 segundos no gelo entre eles.

Em seguida, gire o lisado de sonicado a 39.000 vezes G por 20 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, adicione o supinato bacteriano a um mililitro de níquel NTA aros lavado. Incubar o níquel NTA aros e lisado juntos por 2,5 horas a quatro graus Celsius com agitação suave após a incubação.

Esfole as contas girando a 400 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Observe que todas as lavagens e eluições adicionais são realizadas com essas configurações de centrifugação e menos observadas de outra forma. Após a centrifugação.

Combine 30 microlitros de supinato com 10 microlitros quatro vezes o tampão de amostra SDS em um tubo de microcentrífuga e guarde-o no gelo para análise de pureza. Em seguida, descarte o restante do agente supino e lave as contas quatro vezes no tampão de lavagem de piolhos. E uma vez que o tampão de sal de interesse centrifugue entre cada lavagem Deste ponto em diante, certifique-se de manter a amostra no gelo o tempo todo.

O SLO é uma proteína muito sensível ao redox e perderá rapidamente sua atividade se estiver quente a 37 graus centígrados, mesmo que por um curto período de tempo. Para eluir a proteína SLO, adicione um mililitro de tampão de eluição e cinco microlitros de um molar de DTT às contas, incube no gelo por 10 minutos. Em seguida, centrifugue e colete o supinato em um tubo de fuga marcado com o número eluciano.

Repita este processo três vezes e, em seguida, para esgotar a endotoxina da proteína SLO, adicione 200 microlitros de grânulos agrícolas conjugados com mistura de polietileno lavado, tampão de sal res suspenso à amostra e agite a quatro graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, gire a 10.000 vezes G por um minuto a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, colete o sobrenadante em novos tubos de microcentrífuga rotulados.

Combine 30 microlitros de cada eluição com 10 microlitros, quatro vezes o tampão de amostra SDS. Para análise de página SDS, armazene as soluções SLO no gelo. Determine as concentrações de proteínas e a atividade hemolítica, se satisfatórias, puxe o SLOE em cinco a 10 microlitros, congele em gelo seco e armazene a 80 graus Celsius negativos.

Em seguida, determine a lise específica. Reese. Suspenda as células a serem testadas duas vezes. Centralize as seis células por mililitro no tampão RB com 20 microgramas por mililitro.

iodeto de propídio Aqui as células T 27 A são testadas. Adicione 100 microlitros de células a cada poço de uma placa inferior em V de 96 poços em tubos de microcentrífuga separados.

Diluir em série o SLO até duas vezes a concentração final no tampão rb. Em seguida, adicione 100 microlitros de toxina ou 100 microlitros de tampão RB às células e incube por cinco minutos a 37 graus Celsius. As concentrações finais típicas variam de 2000 unidades por mililitro a 31,25 unidades por mililitro.

Execute as células em um citômetro de fluxo e colete dados com filtros para fi, cetrina ou pe. Um deslocamento de um log representa células transitoriamente permeáveis, enquanto um deslocamento de três logs indica células mortas. Calcule a lise específica das células subtraindo a porcentagem de células mortas no controle do experimental usando a equação mostrada aqui um dia antes da placa do experimento, duas vezes centralizar os cinco macrófagos no vidro revestido de colágeno.

Pratos inferiores de 35 milímetros. O microscópio usado para entrega de toxinas deve ser equipado com um estágio invertido, um estágio aquecido, os cubos de filtro de emissão de excitação apropriados e, se disponível, uma lente bertand. A parte mais difícil deste procedimento é trazer a agulha intacta até as células.

Para garantir o sucesso, usamos uma lente Bertrand, que normalmente é usada para alinhamento para visualizar a agulha à medida que a trazemos através dos planos focais. O microscópio deve ser conectado a um microinjetor e deve ser controlado por um computador com memória suficiente para coletar e armazenar dados, ligar o microscópio e o microinjetor e permitir que o tempo do estágio aquecido aqueça a 37 graus Celsius enquanto espera o aquecimento do estágio. Rotule as células por 30 minutos com corante a 37 graus Celsius.

Dependendo do ensaio, a rotulagem pode ser feita com cinco microlitros, quatro ou 2:00 AM em um mililitro, HBSS ou dois microlitros de cálcio am em um mililitro de meio completo aqui, quatro ou dois são usados. Remova o meio celular e lave as células uma vez com PBS. Aspire o PBS e substitua-o por um mililitro de RPMI suplementado com dois milimolares de cloreto de cálcio.

Monte o prato no microscópio, coloque as células em foco com campo claro e ajuste para focar um pouco acima das células. Em seguida, combine um microlitro de toxina SLO, quatro microlitros, 10 miligramas por mililitro, DEXTRA 5 55 e seis microlitros de água. Em seguida, centrifugue suas 20.000 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius.

O dextrano é usado para verificar se a ponta femto não está entupida com G. Use um micro carregador para carregar dois microlitros de toxina diluída na ponta do femto pela parte traseira. Carregue a ponta femto no micro injetor.

Em seguida, ajuste o ângulo do injetor para que a ponta fique sobre o centro das células com espaço para se mover em todas as direções, limpe as configurações anteriores para o limite Z, que limita o quão baixo a ponta do microinjetor pode ir. Defina o microinjetor para injetar por 0.5 segundos a 120 PSI com contrapressão de 20 PSI. Em seguida, abaixe a ponta até que ela entre no meio.

Usando a lente Bertrand. Centralize a ponta e siga a ponta à medida que ela é abaixada para mais perto das células. Assim que a agulha sair de foco, volte para a ótica normal.

A sombra da agulha deve ser aparente no campo. Concentre-se acima das células e abaixe a agulha até que ela entre em foco. Em seguida, coloque as células em foco e traga cuidadosamente a agulha adjacente a uma célula.

Depois de definir o limite Z para injeção, comece a imagem e injete a toxina. Em seguida, levante a agulha e vá para uma nova região de células. Injete toxina adicional e continue a imagem após a injeção.

Mova a agulha para a posição inicial para evitar qualquer vazamento indesejado de toxina da agulha usando o método descrito neste vídeo, 10 a sete a 10 a oito unidades por mililitro. O SLO é normalmente obtido com uma concentração de proteína de quatro miligramas por mililitro. Este gel de página SDS mostra amostras bacterianas antes e depois da indução da toxina após a purificação, e cada uma das três colorações de azul de kamasi ellucians revela que o SLO induzido foi purificado com sucesso.

SLO é a banda a 69 kilodaltons para determinar a quantidade de toxina necessária para a lise de T 27 A ou D duas células. As células foram desafiadas com várias concentrações de SLO por cinco minutos a 37 graus Celsius na presença de iodeto de propídio e examinadas por citometria de fluxo. A lise específica foi determinada conforme demonstrado como mostrado aqui.

250 unidades por mililitro. O SLO fornece 50% de lise de T 27 A e D duas células. Uma dose sublítica de 10% de lise de toxina seria de 62,5 unidades por mililitro.

Esses valores são importantes para a atividade de toxina de referência para avaliar a morte celular após a exposição à toxina. Fibroblastos dérmicos humanos foram incubados com homodímero de cálcio e aterio usando um kit de mortos-vivos da Life Technologies. Após a exposição localizada à toxina bacteriana, antrolisina O.In esta imagem, o cálcio é mostrado em verde e brometo de atherio em regiões vermelhas próximas ao microbioma, mostram morte celular tipificada por perda de cálcio e absorção de homodímero, enquanto regiões mais distantes da ponta não mostram danos.

A microentrega da toxina também permite o exame de eventos em tempo real, como o fluxo de cálcio. Esses DCs humanos carregados com 4:02 AM foram expostos ao SLO a uma taxa de fluxo constante com mudança simultânea de imagem ao vivo de verde para azul. A pseudocor indica um aumento nos níveis citosólicos de cálcio.

O SLO induz um rápido aumento do cálcio citosólico, que se propaga pela região da placa devido à entrega localizada. No entanto, apenas as células próximas à ponta do microinjetor encontram a toxina do reator. Isso demonstra uma reação celular à toxina e a área espacialmente restrita de entrega de toxina para resolver eventos na dimensão zdi.

A micro entrega foi combinada com microscopia confocal 3D de alta velocidade. Este conjunto de imagens mostra células dendríticas após a injeção de toxina. Eles foram pré-incubados com anti CD 11 C conjugado a um PC mostrado em verde para marcar a membrana plasmática.

Como pode ser visto aqui, as microvesículas são liberadas após a entrega da toxina. Como parte do processo de reparo celular, as moléculas de toxina são concentradas em bolhas, que são eliminadas para eliminar a toxina. Uma vez dominada, a microscopia pode ser feita em 45 minutos.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter a toxina fria antes de se misturar com as células e testar a atividade hemolítica. Bom. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir a cinética em tempo real das respostas das células imunes às toxinas bacterianas usando microscopia de células vivas.