Imagens de Mudanças Morfológicas em Bactérias usando Microscopia de Fluorescência de Células Vivas

Comece com uma cultura bacteriana imobilizada sob uma placa de agarose em um recipiente de fundo de vidro.

As membranas celulares bacterianas são marcadas com um corante fluorescente.

As bactérias também são projetadas para expressar um RNA antissenso que tem como alvo um mRNA específico, inibindo a produção de uma proteína essencial da divisão celular.

Adicione uma gota de óleo de imersão ao objetivo do microscópio de fluorescência invertida.

Coloque o prato em uma caixa metálica e fixe-o no palco do microscópio.

Aumente o objetivo até o óleo tocar a antena, então foque nas células.

Use softwares de imagem para configurar pilhas Z para capturar imagens em múltiplas profundidades.

Comece a adquirir imagens de lapso de tempo fluorescente.

À medida que as células respondem à expressão de RNA antissentido, elas não se dividem e desenvolvem formas inchadas.

A organização da membrana fica desfeita, resultando em fluorescência desigual e focal que indica divisão celular defeituosa.

Para imagear a amostra, use o botão de foco de ajuste grosseiro para garantir que o objetivo esteja totalmente abaixado antes de inicializar o microscópio no software do microscópio. Coloque uma gota de óleo de índice de refração de 1,517 no objetivo de imersão em óleo 100X e transfira o prato de fundo de vidro contendo a amostra para o caixão metálico da carcaça.

Deslize suavemente o prato para dentro da grama do palco e use o botão de ajuste grosso para elevar o objetivo até que o óleo toque o fundo de vidro do prato. Use a ocular e o botão de ajuste fino para focar a amostra e mude para o modo câmera. No software de imagem, na janela Resolve 3D, selecione o ícone Design/Executar Experimento.

Uma nova caixa de diálogo aparecerá chamada Design/Execute Experimento. Abra as abas Design e Seccionamento na caixa de diálogo para definir o número de Z pilhas e a espessura da amostra. Para medir a espessura das células na amostra, ajuste incrementalmente o plano Z usando as setas para cima e para baixo na caixa de diálogo do Resolve 3D, fazendo com que onde as células ficam fora de foco fiquem os limites superior e inferior para a Aquisição de Imagem.

Após ajustar a Porcentagem de Transmissão da Intensidade da Luz e a duração da Exposição para os canais selecionados na caixa de diálogo Resolver 3D, clique em Lista de Pontos para abrir a Lista de Pontos. Nas abas Design e Time Lapse, selecione a caixa de seleção Time Lapse e insira os parâmetros do time lapse. Selecione a opção de lista de Pontos de Visita e insira os pontos a serem imaginados na caixa de texto, separando os pontos por vírgulas ou hífens para sequências completas.

Depois, edite nomes e localizações de arquivos na aba Executar e selecione Play na caixa de diálogo Iniciar Experimento para iniciar o experimento.