Name: Sistema de proteína verde fluorescente Split Visualizar efetores entregue de bactérias durante a infecção (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Aprenda a visualizar efetores bacterianos em células vegetais usando o sistema split superfolder GFP otimizado. Este método avança a pesquisa sobre interações planta-patógeno.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de pesquisa de ciência básica através da nacional Research Foundation de Coreia (NRF) financiado pelo Ministério da ciência, TIC e planejamento futuro (NRF-2018R1A2A1A05019892) para DC e por uma concessão do centro de criação de Molecular de plantas ( PMBC) do programa próxima geração Biogreen 21 do governo de Desenvolvimento Rural (PJ013201) com o EP. Agradecemos o centro de imagem do centro nacional de instrumentação para a gestão ambiental fornecer um microscópio confocal para as filmagens.

Nota: Todas as etapas são realizadas à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário.
1. preparação de materiais vegetais (4 semanas)
<ol><li>Preparação para as plantas de N. benthamiana<ol>
<li>Semeie 2 sementes de s. benthamiana na superfície do solo de cada pote, cubra a bandeja com uma cúpula de plástico e permitir que as sementes germinar em um 25 ° C, 60% câmara de crescimento de umidade com um ciclo de 16/8-h claro/escuro fotoperíodo.</li>
		<li>Depois de duas semanas, escolher e descartar a menor mudas em cada vaso e continuar a crescer plantas sob as mesmas condições de crescimento como aplicado para a germinação na etapa 1.1.1. Adicione 1 litro de água pela bandeja a cada dois dias. Nota: As condições de crescimento de plantas podem variar entre laboratórios. Portanto, segue o protocolo regando regular para o cultivo da planta em uma condição saudável.</li>
		<li>Em uma semana, transferir as plantas para uma bandeja nova e organizá-los com espaço adequado para mais crescimento. Continuam crescendo as plantas nas condições descritas na etapa 1.1.1 até que estejam prontos para estar infiltrados em 4 semanas de idade. Nota: O crescimento das plantas pode diferir dependendo da condição de crescimento através de laboratórios. Geralmente, nós encontramos que as 4 semanas de idade N. benthamiana plantas suportar cerca de seis folhas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação para a. thaliana plantas transgênicas<ol>
<li>Consulte a Tabela de materiais e ordenar as sementes transgênicas de Arabidopsis .</li>
		<li>Embeber as sementes transgênicas de Arabidopsis ~ 50-100 em 1 mL de água destilada e armazená-los em 4 ° C por 3 dias no escuro para sincronizar o início da germinação.</li>
		<li>~ 2-3 semear na superfície do solo de uma bandeja de planta de plug e cubra a bandeja com uma cúpula de plástico. Permitir que as sementes germinar a 23 ° C, umidade de 60%, com um ciclo de 10/14-h claro/escuro fotoperíodo. Nota: As sementes devem ser homozigotos. No entanto, recomendamos confirmar a presença do transgene no lote. Neste caso, esterilizar as sementes por lavagem com etanol 70% por 2 min, 50% de alvejante (cerca de 2% de hipoclorito) contendo 0.05% triton X-100 5 min. siga por 5 - 6 vezes de lavagem com água bidestilada estéril (ddH2O). Após a esterilização, estratificar a 4 ° C por 3 dias e placa-los na mídia de germinação de plantas contendo 25 µ g/L de hptII B para selecionar as plantas transgénicas.</li>
		<li>Depois de uma semana, deixar apenas uma planta por ficha e continuar a crescer plantas sob as mesmas condições de crescimento utilizadas para etapa 1.2.3. Nota: Plantas de quatro semanas de idade foram utilizadas para a infecção p. syringae . Regar plantas todos os dias para manter as plantas saudáveis.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparação da cultura de Pseudomonas (~ 1 semana)
<ol><li>Construção do plasmídeo para transformação de Pseudomonas<ol>
<li>Consulte a Tabela de materiais e pedir o vector(s) desejado do sistema de entrega baseada em T3SS effector vetor25.</li>
		<li>Inserir o gene effector do interesse do vetor de entrega effector utilizando recombinação site-specific clonagem25. Nota: Quando a Localização subcellular das proteínas efetoras completos de monitoramento, colocar o gene completo em pBK-GW-1-2 ou pBG-GW-1-2. Também é possível escolher pBK-GW-1-4... ou pBG-GW-1-4 contem 2 x sfGFP11 para aumentar o sinal de fluorescência. No caso de um efetor parcial falta de peptídeo sinal, use pBK-GW-2-2 ou pBK-GW-2-4. Consulte Park et al . para obter informações detalhadas sobre effector entrega vetores25.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transforme o plasmídeo carregando um efetor fundido para a marca de sfGFP11, p. syringae PV. Tomate (Pst) CUCPB5500 usando o padrão electroporation29. Nota: Outras estirpes de Pseudomonas podem ser usados, se necessário. O sistema de tag de sfGFP11 é construído para uma ampla gama de vetores30 e a expressão de gene do efetor é regulada pelo promotor AvrRpm1, que é comparável com, por exemplo, Pseudomonas fluorescens (EthAn)31.</li>
	<li>Espalhe as células bacterianas transformadas suavemente sobre a superfície das placas de ágar do rei B contendo 100 rifampicina µ g/mL e 25 canamicina µ g/mL ou 25 µ g/mL gentamicina. Incube a 28 ° C por 2 dias.</li>
	<li>Inocular uma colônia em meio líquido do rei B com antibióticos adequados para o vetor usado e crescem as células durante a noite a 28 ° C, com agitação a 200 rpm.</li>
	<li>Fazer um estoque de glicerol. Adicionar o glicerol esterilizado para uma concentração final de 50% e loja a-80 ° C.</li>
</ol>3. transiente expressão de sfGFP1-10 organela-alvejadoOPT em s. benthamiana (4 dias)
<ol><li>Preparação da cultura de Agrobacterium<ol>
<li>Ordem a vector(s) desejada da organela-alvo sfGFP1-10OPT plasmid(s) (consulte a Tabela de materiais).</li>
		<li>Transforme o plasmid(s) em Agrobacterium tumefaciens cepa de células GV310132. Crescem as células em ágar-ágar Luria-Bertani (LB) suplementado com 50 µ g/mL canamicina e a rifampicina 50 µ g/mL a 28 ° C durante 2 dias.</li>
		<li>De uma única colônia no ágar-ágar LB, inocule as células em 5 mL de meio líquido de LB suplementado com 50 µ g/mL canamicina e 50 rifampicina µ g/mL. Crescem as células durante a noite a 28 ° C, com agitação a 200 rpm.</li>
		<li>Colheita as células por centrifugação a 3.000 x g por 10 min. decantar a sobrenadante mídia e resuspenda o pellet em 1 mL de recém feito buffer de infiltração.</li>
		<li>Medir a quantidade de Agrobacterium , obtendo o valor de densidade óptica (OD) em uma absorvância de 600 nm (Abs 600 nm). Ajuste o OD600 das bactérias a 0,5 com buffer de infiltração. Nota: 1 mL de suspensão é suficiente para se infiltrar em dois pontos.</li>
		<li>Deixa a cultura à temperatura ambiente em um roqueiro suave para 1-5 h antes de infiltração.</li>
		<li>Fazer um buraco no centro das folhas para ser infiltrado com uma ponta de 10 µ l. Use uma seringa de 1 mL auto-injeções para infiltrar as suspensões de Agrobacterium . Cuidadosa e lentamente injete cerca de 500 µ l das suspensões preparadas a partir de passo 3.1.5 para o lado adaxial da folha através da seringa. Repeti a infiltração em pelo menos três diferentes plantas para repetições experimentais. Nota: Por razões de saúde e de segurança, óculos de proteção devem ser usados durante a infiltração.</li>
		<li>Limpe a restante suspensão bacteriana nas folhas e marca o limite da região infiltrada.</li>
		<li>Mantenha as plantas infiltradas nas mesmas condições de crescimento utilizada para etapa 1.1.1 por 2 dias.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. inoculação de Pseudomonas (4 dias)
<ol><li>Raia a estirpe Pseudomonas transformada partir do estoque de glicerol na etapa 2.5 na mídia de agar B do rei com os antibióticos apropriados a 28 ° C, durante 2 dias. Nota: A saúde dos Pseudomonas é muito crítica. Se não formam colônias bem, marcam as células novamente ou propagar as células em meio líquido do rei antes de prosseguir.</li>
	<li>Inocule uma loopful de células de Pseudomonas em meio líquido manitol-glutamato (MG) a 28 ° C, com agitação a 200 rpm por uma noite.</li>
	<li>Colheita as células por centrifugação a 3.000 x g por 10 min. decantar a sobrenadante mídia, resuspenda o pellet em 10 mM MgCl2e ajustar o OD600 a 0,02 (1 x 107 UFC/mL) para s. benthamiana folhas e 0,002 (1 x 10-6 UFC/mL) de Arabidopsis deixa.
</li>
	<li>Para o s. benthamiana, infiltre a suspensão de Pseudomonas na área das folhas onde o Agrobacterium carregando sfGFP1-10OPT construção foi infiltrada 2 dias anteriormente (como na etapa 3.1.7). Para o sfGFP1-10OPT transgénicos Arabidopsis, infiltre a suspensão de Pseudomonas dois 4 semanas curtas dia-crescido folhas. Nota: pelo menos três plantas são necessárias para repetições experimentais.</li>
</ol>5. a observação de sfGFP sinal via microscopia Confocal (1 dia)
<ol><li>Cortar o disco de folha da Pseudomonas-inoculados folhas. Nos pontos de tempo específico após infiltração de Pseudomonas, dois discos de folha de 2 cm2 da planta usando um laser confocal sistema com 40 X de digitalização de imagem / 1.2 objectivo de imersão de água at C-Apochromat ou 63 X / 0,8 imersão de óleo at C-Apochromat objetivo. Para evitar as células mortas, mortas por ferimento, observe as células longe do buraco de infiltração.</li>
	<li>Inicie a observação em uma configuração de baixa energia do laser do argônio 488 nm. Aumente a potência do laser para detectar sfGFP. Nota: Normalmente usamos 2-15% da intensidade do laser para detectar o sinal de fluorescência. No entanto, o poder do laser e a deteção configuração devem ser ajustados com base no sistema de microscopia do usuário. Aqui, os filtros de emissão foram criados para 520-550 nm. As células mortas, muitas vezes, emitir autofluorescência sob a excitação de 488 nm laser. Portanto, como um controle negativo, o efetor mesmo sem a marca de sfGFP11 deve ser infiltrado e observado sob as mesmas condições de observação. Além disso, a excitação do laser de alta pode induzir autofluorescência de clorofila. Portanto, ajuste a intensidade do laser, usando as células de plantas de controle para não induzir a clorofila autofluorescência.<ol>
<li>Para um counterstaining da parede celular, infiltrar-se iodeto de propidium 20mm (PI) para o disco de folha em 5-10 min antes da observação.</li>
		<li>Para o núcleo de coloração, mergulhe os discos de folha paraformaldeído 0,1% por 5 min, seguido por lavagem com água. Então, se infiltre a 10mm de PI para o disco de folha em 5-10 min antes de observação microscópica. Repeti os experimentos de pelo menos três vezes. Nota: Este passo não é crítica, mas útil para definir a localização de efetoras na membrana plasmática ou o núcleo. Se o efetores de interesse mostraram sua localização em uma organela específica, use um marcador para a organela determinado para confirmar a localização do efetor.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Nimchuk, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+fatty+acylation+drives+plasma+membrane+targeting+and+enhances+function+of+several+type+III+effector+proteins+from+Pseudomonas+syringae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic fatty acylation drives plasma membrane targeting and enhances function of several type III effector proteins from Pseudomonas syringae.</a> Cell. 101 (4), 353-363 (2000).</li>
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</ol>

Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

O protocolo descrito aqui é usado para monitorar a localização exata das proteínas efetoras injetado pelo T3SS bacteriana em célula de planta hospedeira ao ser infectado. Anteriormente, o sistema GFP de separação foi usado como uma ferramenta para estudar a Localização subcellular das proteínas de mamíferos23,36, Salmonella T3E localização e entrega de Agrobacterium VirE2 através da T4SS para o planta células37. Para apli...

As plantas são organismos sésseis que encontram inúmeros patógenos invasores, incluindo bactérias, fungos, vírus, insetos e nematoides em todo seu ciclo de vida. Entre as phytopathogens, os patógenos bacterianos Gram-negativos tais como Pseudomonas spp. e Ralstonia spp., infectar suas plantas hospedeiras, inserindo-se através de feridas ou aberturas naturais, como os estomas e Hidatódio1. Para colonizar com sucesso plantas hospedeiras, patógenos bacterianos evoluíram para desenvolver uma variedade de fatores de virulência2. Quando as bactérias invadem uma planta hospedeira, eles injetam uma série de proteínas de virulência — conhecido como efetores — diretamente para as células da planta para promover sua patogenicidade. Esses efetores suprimem ou modulam a imunidade inata da planta e manipulam os processos celulares do anfitrião para resultar em sobrevivência bacteriana3.
Bactérias patogênicas utilizam principalmente um T3SS entregar proteínas efetoras diretamente no hospedeiro células4. O T3SS se assemelha a uma seringa molecular com um canal de agulha, conectando a partir de uma estrutura de proteína do andaime em todo o interior e as exteriores membranas bacterianas para o local da injeção do anfitrião célula5. Esse mecanismo de secreção mediada por T3SS effector (T3E) é bem conservado em vários patógenos bacterianos Gram-negativos da planta, bem como humano. Dentre os patógenos vegetais representativos, o p. syringae pv. Tomate DC3000 hrcC mutante, que geralmente tem um T3SS defeituoso, restringiu o crescimento em plantas, provavelmente devido a incapacidade do mutante para suprimir totalmente a planta imunidade (através da injeção de proteínas efetoras)6. Após translocação nas células do hospedeiro, efetores alvo várias proteínas do hospedeiro que são importantes para o sistema de célula de host, incluindo respostas de defesa vegetal, da transcrição do gene, morte celular, Proteassoma, tráfico de vesículas e hormônio vias7 , 8 , 9 , 10. portanto, o rastreamento da localização celular de proteínas efetoras nas células hospedeiras é um destino atraente para entender suas funções com relação a modulação da imunidade da planta.
A maioria dos estudos de localização do T3Es ter empregado Agrobacterium -mediada superexpressão com uma proteína grande fluorescência do anfitrião planta9. No entanto, o método de expressão heteróloga de genes que são introduzidos em outras espécies tem demonstrado ser mis localizadas ou ocasionalmente não-funcional11,12,13. Além disso, vários estudos revelaram que efetores bacterianas sofrem alteração para o direcionamento adequado no anfitrião células14,15,16,17. Portanto, transitoriamente expressa efetores no citosol da planta as células não podem ser funcionalmente ou quantitativamente idênticas para os efetores que são entregues pelo T3SS ao patógeno infecção18. Além disso, a fusão de grandes marcas fluorescentes para proteínas efetoras pode perturbar o efetor adequada visualização e entrega18,19. Portanto, essas abordagens a ensaiar a T3E função podem não totalmente refletir a localização nativa dos efetores T3SS-secretado.
Uma proteína verde fluorescente (GFP) é composta por um 11-hélice β-barril delimitador uma vertente central que inclui um cromóforo20. Waldo et al relatou um sistema de divisão-GFP romance que consiste de um pequeno componente (GFP β vertente 11; GFP11) e um fragmento complementar (vertente β GFP 1-10; GFP1-10)21. Os fragmentos não fluorescem sozinhos mas fluorescem em cima de sua própria associação, quando ambos os fragmentos estão em estreita proximidade com o outro. Para a otimização da eficiência dobramento da proteína, robustas variantes de dobramento da GFP, i.e., sfGFP e sfGFPOPT, desenvolveram-se posteriormente para a divisão GFP sistema20,21,22. Recentemente, o único aminoácido mutado variantes de sfGFP1-10OPT- sfYFP1-10OPT e sfCFP1-10OPT- que pode reconstituir com um fragmento de sfGFP11 e mostrar fluorescência de ciano e amarelo, respectivamente, foram gerados23 . Além disso, o sfCherry, um derivado do mCherry, pode ser dividido em fragmentos sfCherry1-10 e sfCherry11 da mesma maneira como sfGFP23.
Este sistema foi adaptado para rotular e rastrear os efetores T3SS em células HeLa durante a infecção usando os efetores de Salmonella24. No entanto, ele foi anteriormente não otimizado para o sistema host de patógeno vegetal-bacteriana. Recentemente, nós aperfeiçoamos o sistema GFP divisão baseado o sfGFP1-10 melhoradoOPT para monitorar a Localização subcellular do T3Es entregado a partir de p. syringae em planta células25. Para facilitar os estudos de localização da T3Es para diferentes compartimentos subcellular nas células vegetais, um conjunto de transgénicos Arabidopsis thaliana plantas foram geradas para expressar sfGFP1-10OPT nos vários compartimentos subcellular 25. Além disso, o plasmídeo que carreg uma variedade de organela-alvo sfGFP1-10OPT para o Agrobacterium-mediada superexpressão transitória e os vetores de sfGFP11-marcados para a entrega baseada em T3SS effector também foram gerados. As sementes de várias linhas de Arabidopsis transgênicas e os plasmídeos para expressar a T3Es de interesse podem ser obtidas de fontes mencionadas na Tabela de materiais26,27.
O seguinte protocolo, descrevemos um sistema otimizado para monitorar a dinâmica de efetores entregados por bactérias nas células hospedeiras usando o sistema de sfGFP de separação. Infecção de plantas expressando sfGFP1-10OPT com transgénicos Pseudomonas carregando o plasmídeo recombinante sfGFP11 resulta em uma entrega do efetor sfGFP11-tag de Pseudomonas na célula hospedeira. Em consequência, estas proteínas são reconstituídas e translocar para o compartimento de alvo específico effector. A Pseudomonas syringae pv. tomate Tensão de CUCPB5500, no qual 18 efetores são excluídos, foi usado porque esta estirpe mostrou pouca ou nenhuma morte celular em ambos a. thaliana e s. benthamianas28. No entanto, todos os materiais e os passos descritos aqui podem ser substituídos ou modificados para adaptar o sistema de sfGFP de separação para investigação de outras questões biológicas ou otimização das condições de determinado laboratório.

<table><tbody><tr><td><linhas transgênicas > forte Arabidopsis< / forte ></td><td></td><td></td> <td>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Monitoramento espaço-temporal de efetores de Pseudomonas syringae via secreção tipo III usando fragmentos de proteína fluorescente dividida. Célula vegetal. 29 (7), 1571-1584 (2017)</td></tr><tr><td>CYTO-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69831</td><td></td></tr><tr><td>NU-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69832</td><td></td></tr><tr><td>PT-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69833</td><td></td></tr><tr><td>MT-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69834</td><td></td></tr><tr><td>PX-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69835</td><td></td></tr><tr><td>ER-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69836</td><td></td></tr><tr><td>GO-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69837</td><td></td></tr><tr><td>PM-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69838</td><td></td></tr><tr><td>Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmídeo</td><td></td><td></td><td>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Monitoramento espaço-temporal de efetores de Pseudomonas syringae via secreção tipo III usando fragmentos de proteína fluorescente dividida. Célula vegetal. 29 (7), 1571-1584 (2017)</td></tr> <tr><td>CYTO-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97387</td><td></td></tr><tr><td>NU-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97388</td><td></td></tr><tr><td>PT-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97389</td><td></td></tr><tr><td>MT-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97390</td><td></td></tr><tr><td>PX-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97391</td><td></td></tr><tr><td>ER-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97392</td><td></td></tr><tr><td>GO-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97393</td><td></td></tr><tr><td>PM-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97394</td><td></td></tr><tr><td>ER-sfCherry1-10</td><td>Addgene</td><td>97403</td><td></td></tr><tr><td>ER-sfYFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97404</td><td></td></tr><tr><td>CYTO-sfCFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97405</td><td></td></tr><tr><td>sfGFP11-tagged Vetor compatível com gateway para sistema de entrega de efetor baseado em T3SS</ forte></td><td>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Monitoramento espaço-temporal de efetores de Pseudomonas syringae via secreção tipo III usando fragmentos de proteína fluorescente dividida. Célula vegetal. 29 (7), 1571-1584 (2017)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pBK-GW-1-2</td><td>Addgene</td><td>98250</td><td>pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente à canamicina (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBK-GW-1-4</td><td>Addgene</td><td>98251</td><td>pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente à canamicina (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBK-GW-2-2</td><td>Addgene</td><td>98252</td><td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente à canamicina (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBK-GW-2-4</td><td>Addgene</td><td>98253</td><td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente à canamicina (25 ug / ml)</td></tr> <tr><td>pBG-GW-1-2</td><td>Addgene</td><td>98254</td><td>pAvrRpm1: GW: HA-sfGFP11: AvrRpm1t; Resistente à Gentamicina (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBG-GW-1-4</td><td>Addgene</td><td>98255</td><td>pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente à Gentamicina (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBG-GW-2-2</td><td>Addgene</td><td>98256</td><td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente à Gentamicina (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBG-GW-2-4</td><td>Addgene</td><td>98257</td><td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente à gentamicina (25 ug / ml)</td></tr> <tr><td>< forte > cepas bacterianas < / forte ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td> Agrobacterium tumefaciens GV3101</td><td></td><td></td><td>Csaba Koncz e Jeff Schell, O promotor do gene TL-DNA 5 controla a expressão específica do tecido de genes quiméricos transportados por um novo tipo de vetor binário de Agrobacterium. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistente à gentamicina (50 ug/ml) e rifampicina (50 ug/ml)</td></tr><tr><td>Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500</td><td></td><td></td><td>Kvitko, B. H. et al. Deleções no repertório de genes efetores de secreção tipo III de Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 revelam sobreposição funcional entre os efetores. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistente à rifampicina (100 ug / ml)</td></tr> <tr><td>< forte > componentes de mídia < / forte ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< forte > meio de germinação de plantas < / forte ></td><td></td><td></td> <td>Adicionar 2.165g / L Murashige & Skoog em pó, 10 g/L de sacarose em água. Ajustar para pH 5,8 e adicionar 2,2 g/L de fitagel. Autobezerro.</td></tr><tr><td>Murashige & Meio Skoog incluindo vitaminas</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0222</td><td>Armazenar a 4 °C.</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td><forte>LB meio</forte></td><td></td><td></td><td>Adicione 10 g/L de triptona, 5 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de NaCl à água. Para meios sólidos, adicione 15 g/L de microágar. Autoclave.&nbsp; Deixe a solução esfriar a 55 graus; C e adicione antibiótico, se necessário.</td></tr><tr><td>Triptona</td><td>BD Bioscience</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>BD Bioscience</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0520</td><td></td></tr><tr><td>Micro ágar</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M1002</td><td></td></tr><tr><td>King's B media</td><td></td><td></td><td>10 g/L de peptona de protease #2, 1,5 g/L de K2HPO4, 15 g/L de ágar para água. Autoclave. Esfriar para 55 &graus; C e adicione 15 ml/L de glicerol estéril, 5 ml/L de MgSO4 ao meio. Adicione antibióticos, se necessário.</td></tr><tr><td>Peptona de proteose</td><td>BD Bioscience</td><td>212120</td><td></td></tr><tr><td>Anidro K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1551128 USP</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>G1345</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Bioscience</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td><forte>Manitol-Glutamato (MG) meio líquido </forte></td><td></td><td></td><td>Adicione 10 g/L de manitol, 2 g/L de ácido L-glutâmico, 0,5 g/L de KH2PO4, 0,2 g/L de NaCl e 0,2 g/L de MgSO4 à água. Ajuste para pH 7</td></tr><tr><td>Manitol</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0803</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-glutâmico</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>G0707</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NIST200B</td><td></td></tr><tr><td>Tampão</td><td></td><td></td> de infiltração <td>10 mM MES (2-(N-morfolino)-ácido sulfônico etano), 10 mM MgCl2, 150 &micro; M acetosiringona. pH 5,6; Prepare um novo tampão antes de usar.</td></tr><tr><td>MES</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M1503</td><td>Prepare 100 mM (pH 5,6) em água. Esterilize por filtro.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>Preparar 100 mM de massa em água. Autoclave.</td></tr><tr><td>Acetosiringona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td>Prepare estoque de 150 mM em DMSO.</td></tr><tr><td>Microscópio confocal equipamentos/materiais</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>710 sistema confocal de varredura a laser</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio observador Z1 microscópio invertido</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de propídio</td><td>ThermoFisher</td><td>P1304MP</td><td></td></tr></tbody></table>

sistema de proteína verde fluorescente split visualizar efetores entregue de bactérias durante a infecção

Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection

Bactérias, dentre os mais importantes agentes causadores de várias doenças de planta, secretam um conjunto de proteínas efetoras em célula de planta hospedeira para subverter o sistema imunológico de planta. Durante a infecção efetores citoplasmáticos são entregues para o citosol de anfitrião através de um tipo sistema do secretion de III (T3SS). Após o parto para a célula da planta, o effector(s) alveja o compartimento específico para modular processos de célula do host para a sobrevivência e replicação do patógeno. Embora tenha havido algumas pesquisas sobre a Localização subcellular das proteínas efetoras nas células hospedeiras para entender sua função na patogenicidade usando proteínas fluorescentes, investigação da dinâmica dos efetores injetados diretamente de bactérias tem sido um desafio devido à incompatibilidade entre o T3SS e proteínas fluorescentes.
Aqui, descrevemos nosso método recente de um sistema de proteína verde fluorescente de superfolder divisão otimizado (sfGFPOPT) para visualizar a localização de efetores entregadas via o T3SS bacteriana na célula hospedeira. O sfGFP11 (11th β-vertente de sfGFP)-etiquetado effector secretada através o T3SS pode ser montado com uma organela específica alvejada sfGFP1-10OPT (1-10th β-vertente de sfGFP) líder para emissão de fluorescência no local. Este protocolo fornece um procedimento para visualizar o sinal de fluorescência sfGFP reconstituído com um proteínas efetoras de Pseudomonas syringae em uma organela especial nas instalações de Arabidopsis e Nicotiana benthamiana .

A estrutura do β-tambor de GFP é composta por onze β fios e pode ser dividida em dois fragmentos, a vertente deth (GFP11) 11 e de 1-10th strand (GFP1-10OPT). Embora nenhum dos dois fragmentos fluorescentes por si, Self montado sfGFP pode emitir fluorescência quando os dois fragmentos existem nas proximidades (figura 1A). Neste sistema, sfGFP1-10OPT-expressando Arabidopsis ou N. benthamiana plantas ...

Abordagens de baseados em proteína fluorescentes para monitorar efetores secretadas pelas bactérias em células hospedeiras são desafiadores. Isto é devido à incompatibilidade entre proteínas fluorescentes e o sistema de secreção do tipo III. Aqui, é utilizado um sistema GFP de superfolder de separação otimizada para visualização de efetores secretada pelas bactérias para a célula da planta hospedeira.

Sistema de proteína verde fluorescente Split Visualizar efetores entregue de bactérias durante a infecção

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de interação planta-micróbio, como como as bactérias patogênicas podem perturbar a condição ideal de suas células vegetais hospedeiras usando proteínas chamadas efetores secretadas nas células vegetais. A principal vantagem desta técnica é que a proteína efetora bacteriana é expressa na célula bacteriana usando seu sistema de expressão nativa e, em seguida, entregue à célula vegetal através do sistema de secreção bacteriana tipo III. Para iniciar este procedimento, prepare as plantas Nicotiana benthamiana e Arabidopsis thaliana conforme descrito no protocolo de texto.Em seguida, use a eletroporação padrão para transformar o gene portador de plasmídeo e efetor fundido à marca sfGFP11 na cepa de CUCPB5500 de tomate patovar de Pseudomonas syringae. O ponto de tempo ideal e o nível de expressão, ou reconstituir sfGFP, realmente dependem da sua proteína efetora. Recomendamos otimizar as condições de inoculação ou observação.Espalhe suavemente as células bacterianas transformadas sobre a superfície das placas de ágar King's B. Em seguida, incube as placas a 28 graus Celsius por dois dias. Depois disso, inocule uma colônia bacteriana no meio líquido King's B com um antibiótico apropriado para o vetor.Incubar durante a noite a 28 graus Celsius com agitação a 200 rpm. No dia seguinte, adicione glicerol autoclavado ao meio inoculado até uma concentração final de 50% Armazene a 80 graus Celsius negativos. Para começar, transforme o plasmídeo em células Agrobacterium tumefaciens cepa GV3101, conforme descrito no protocolo de texto.Cultive as células em meio LB Agar suplementado a 28 graus Celsius por dois dias. Usando uma única colônia do meio LB Agar, inocule 5 mililitros de meio LB líquido suplementado. Em seguida, cultive as células durante a noite a 28 graus Celsius com agitação a 200 rpm.Depois disso, centrifugue a 3000 G por 10 minutos para colher as células. Despeje o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 mililitro de tampão de infiltração recém-feito. Usando um espectrofotômetro, determine a quantidade de células de Agrobacterium medindo o valor da densidade óptica em uma absorbância de 600 nanômetros.Em seguida, use o tampão de infiltração para ajustar o OD 600 das células bacterianas para 0,5. Deixe a cultura em uma cadeira de balanço suave em temperatura ambiente por uma a cinco horas. Para se infiltrar nas folhas, use a ponta da pipeta de 10 microlitros para fazer um buraco no centro de cada folha.Use uma seringa sem agulha de 1 mililitro para injetar cuidadosamente 500 microlitros da suspensão de Agrobacterium no lado adaxial da folha. Limpe a suspensão bacteriana restante das folhas e marque o limite da região infiltrada. Mantenha as plantas infiltradas em uma câmara de crescimento a 25 graus Celsius e 60% de umidade por dois dias.Risque a cepa de Pseudomonas transformada do estoque de glicerol para o meio King's B Agar com o antibiótico apropriado. Incubar a 28 graus Celsius por dois dias. Inocular uma alça de células de Pseudomonas em meio líquido de manitol glutamato.Incube a cultura durante a noite a 28 graus Celsius com agitação a 200 rpm. Depois disso, centrifugue a 3000 G por 10 minutos para colher as células. Despeje o sobrenadante e ressuspenda o pellet em solução de cloreto de magnésio a 10 milimolares.Em seguida, ajuste a densidade óptica para 0,02 para folhas de Nicotiana benthamiana e para 0,002 para folhas de Arabidopsis. Para as folhas de Nicotiana benthamiana, infiltrar-se a suspensão de Pseudomonas na mesma área em que a Agrobacterium foi infiltrada dois dias antes. Para o Arabidopsis transgênico, infiltre a suspensão de Pseudomonas em duas folhas curtas de quatro semanas de idade.Finalmente, corte um disco de folha para as folhas inoculadas com Pseudomonas. Em pontos de tempo específicos após a infiltração de Pseudomonas, use um sistema de varredura a laser confocal para obter imagens de dois discos de folhas de dois centímetros quadrados de uma única planta. Observe as células longe do orifício de infiltração para evitar que as células mortas sejam mortas por ferimentos.Os efetores translocados da bactéria estão presentes apenas em quantidades muito pequenas. Portanto, você pode aumentar a potência do laser e obter uma emissão de fluorescência para detectar um sinal fluorescente. No entanto, não domine para evitar a captura de sinais falsos de autofluorescência das células vegetais.Neste estudo, uma abordagem baseada em proteína fluorescente é usada para monitorar efetores secretados por bactérias em células hospedeiras. Uma varredura a laser confocal de uma folha de Nicotiana benthamiana três horas após a infecção é mostrada aqui. As células que expressam sfGFP otimizado apenas com AvrB não mostram nenhum sinal fluorescente.No entanto, os sinais de GFP são vistos nas células infectadas contendo AvrB, sfGFP11. Isso verifica se o complexo AvrB sfGFP11 é reconstituído com sfGFP otimizado no citosol e, em seguida, transloca para a membrana plasmática. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter os materiais vegetais saudáveis e preparar uma cultura de bactérias frescas para as células ativas.Após este procedimento, outros métodos, como análise de sangue em resina, podem ser adiados para entender a modificação da falsa tradução de proteínas efetoras de bactérias em células vegetais durante as respostas imunes das plantas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como visualizar a entrega do efetor tipo III em células vegetais infectadas. Materiais vegetais e culturas de bactérias devem ser descartados seguindo os critérios do seu laboratório para resíduos de risco biológico e não se esqueça de usar seu EPI.

split-green-fluorescent-protein-system-to-visualize-effectors

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fonte: Lee, H. et. al., Sistema de proteína fluorescente verde dividida para visualizar efetores entregues por bactérias durante a infecção. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra um método para monitorar a infecção bacteriana e a entrega de proteínas efetoras em células vegetais usando a complementação de proteína fluorescente verde de superpasta dividida (sfGFP) combinada com microscopia confocal. A abordagem permite a visualização precisa da translocação efetora para o citosol da célula...

Monitoramento da infecção bacteriana e entrega de proteínas efetoras em células vegetais

Este artigo descreve métodos para a síntese e marcação fluorescente de nanopartículas (PN). As NPs foram aplicados em experiências de pulse-chase para rotular o sistema de endo-lisossomal de células eucarióticas. A manipulação do sistema de endo-lisossomal por actividades do agente patogénico intracelular, Salmonella enterica foram seguidas de imagem de células vivas e quantificada.

Aplicação de nanopartículas fluorescentes para estudar Reformas do Sistema Endo-lysosomal por bactérias intracelulares

A eletroporação foi usada para inserir proteínas efetoras de virulência bacteriana purificadas diretamente em células eucarióticas vivas. A localização das proteínas foi monitorada por microscopia de imunofluorescência confocal. Este método permite estudos sobre tráfego, função e interações proteína-proteína usando proteínas exógenas ativas, evitando a necessidade de expressão heteróloga em células eucarióticas.

A electroporação de efectores bacterianos funcionais em células de mamíferos

A translocação efetora para as células hospedeiras por meio de um sistema de secreção tipo III é uma estratégia de virulência comum entre bactérias gram-negativas. Um ensaio baseado em fusão efetora beta-lactamase para análise quantitativa da translocação foi aplicado. Em células infectadas por Yersinia, a conversão de um repórter FRET pela beta-lactamase é monitorada usando microscopia de varredura a laser.

Análises de<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector translocação em células hospedeiras Usando Beta-lactamase Effector Fusions

Investigar as interações entre patógenos bacterianos e seus hospedeiros é uma importante área de pesquisa biológica. Aqui, descrevemos as técnicas necessárias para medir efetoras translocação por Coxiella burnetii durante o silenciamento do gene siRNA usando substrato BlaM.

Aplicando Transferência de ressonância de fluorescência Energia (FRET) para examinar Eficiência Effector translocação pela<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; Durante siRNA silenciamento

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a fagocitose de macrófagos peritoneais de rato usando reforçada fluorescência verde proteína-expressando a Escherichia coli.

Usando avançada proteína de fluorescência verde-expressando Escherichia Coli para avaliar a fagocitose de macrófagos peritoneais de Mouse

Descrito aqui é um método de análise de expressão gênica bacteriana em tecidos animais em nível celular. Este método fornece um recurso para estudar a diversidade fenotípica ocorrendo dentro de uma população bacteriana em resposta ao ambiente de tecido durante uma infecção.

Um método baseado em fluorescência para estudar o Regulamento de Gene bacteriano em tecidos infectados

A imagem de células bacterianas é uma abordagem de biologia de sistemas emergentes focada na definição de processos estáticos e dinâmicos que ditam a função de grandes máquinas macromoleculares. Aqui, a integração da imagem quantitativa de células vivas e tomografia crio-elétron é usada para estudar a arquitetura e funções do sistema de secreção legionella tipo IV.

Aplicando imagens de células vivas e tomografia crio-elétron para resolver características espaciales do Sistema de Secreção Legionella pneumophila Dot/ICM

Este protocolo de imagem celular live-bacteria permite a visualização de interações entre múltiplas espécies bacterianas no nível de célula única ao longo do tempo. A imagem de lapso de tempo permite a observação de cada espécie bacteriana em monocultura ou cocultura para interrogar interações entre espécies em comunidades bacterianas multiespécies, incluindo motilidade e viabilidade celular individual.

Visualização cinética de interespécies interespécies unicelulares interespécies

Este artigo fornece um protocolo simples e claro para marcar efetores secretados por Salmonella usando especificamente o sítio de expansão do código genético (GCE) e obter imagens da localização subcelular de proteínas secretadas em células HeLa usando microscopia de reconstrução óptica estocástica direta (dSTORM)...

Imagem de Super-Resolução de Proteínas Secretadas por Bactérias Usando Expansão de Código Genético

Aqui, descrevemos um procedimento que permite a detecção de bactérias patogênicas em todo o órgão durante a infecção e a quantificação das atividades do repórter fluorescente.

Tomografia tridimensional de órgãos inteiros de alta resolução de infecções microbianas

Aprenda a visualizar efetores bacterianos em células vegetais usando o sistema split superfolder GFP otimizado. Este método avança a pesquisa sobre interações planta-patógeno.

Sistema de proteína verde fluorescente Split Visualizar efetores entregue de bactérias durante a infecção

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