Sistema de proteína verde fluorescente Split Visualizar efetores entregue de bactérias durante a infecção

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de interação planta-micróbio, como como as bactérias patogênicas podem perturbar a condição ideal de suas células vegetais hospedeiras usando proteínas chamadas efetores secretadas nas células vegetais. A principal vantagem desta técnica é que a proteína efetora bacteriana é expressa na célula bacteriana usando seu sistema de expressão nativa e, em seguida, entregue à célula vegetal através do sistema de secreção bacteriana tipo III. Para iniciar este procedimento, prepare as plantas Nicotiana benthamiana e Arabidopsis thaliana conforme descrito no protocolo de texto.

Em seguida, use a eletroporação padrão para transformar o gene portador de plasmídeo e efetor fundido à marca sfGFP11 na cepa de CUCPB5500 de tomate patovar de Pseudomonas syringae. O ponto de tempo ideal e o nível de expressão, ou reconstituir sfGFP, realmente dependem da sua proteína efetora. Recomendamos otimizar as condições de inoculação ou observação.

Espalhe suavemente as células bacterianas transformadas sobre a superfície das placas de ágar King's B. Em seguida, incube as placas a 28 graus Celsius por dois dias. Depois disso, inocule uma colônia bacteriana no meio líquido King's B com um antibiótico apropriado para o vetor.

Incubar durante a noite a 28 graus Celsius com agitação a 200 rpm. No dia seguinte, adicione glicerol autoclavado ao meio inoculado até uma concentração final de 50% Armazene a 80 graus Celsius negativos. Para começar, transforme o plasmídeo em células Agrobacterium tumefaciens cepa GV3101, conforme descrito no protocolo de texto.

Cultive as células em meio LB Agar suplementado a 28 graus Celsius por dois dias. Usando uma única colônia do meio LB Agar, inocule 5 mililitros de meio LB líquido suplementado. Em seguida, cultive as células durante a noite a 28 graus Celsius com agitação a 200 rpm.

Depois disso, centrifugue a 3000 G por 10 minutos para colher as células. Despeje o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 mililitro de tampão de infiltração recém-feito. Usando um espectrofotômetro, determine a quantidade de células de Agrobacterium medindo o valor da densidade óptica em uma absorbância de 600 nanômetros.

Em seguida, use o tampão de infiltração para ajustar o OD 600 das células bacterianas para 0,5. Deixe a cultura em uma cadeira de balanço suave em temperatura ambiente por uma a cinco horas. Para se infiltrar nas folhas, use a ponta da pipeta de 10 microlitros para fazer um buraco no centro de cada folha.

Use uma seringa sem agulha de 1 mililitro para injetar cuidadosamente 500 microlitros da suspensão de Agrobacterium no lado adaxial da folha. Limpe a suspensão bacteriana restante das folhas e marque o limite da região infiltrada. Mantenha as plantas infiltradas em uma câmara de crescimento a 25 graus Celsius e 60% de umidade por dois dias.

Risque a cepa de Pseudomonas transformada do estoque de glicerol para o meio King's B Agar com o antibiótico apropriado. Incubar a 28 graus Celsius por dois dias. Inocular uma alça de células de Pseudomonas em meio líquido de manitol glutamato.

Incube a cultura durante a noite a 28 graus Celsius com agitação a 200 rpm. Depois disso, centrifugue a 3000 G por 10 minutos para colher as células. Despeje o sobrenadante e ressuspenda o pellet em solução de cloreto de magnésio a 10 milimolares.

Em seguida, ajuste a densidade óptica para 0,02 para folhas de Nicotiana benthamiana e para 0,002 para folhas de Arabidopsis. Para as folhas de Nicotiana benthamiana, infiltrar-se a suspensão de Pseudomonas na mesma área em que a Agrobacterium foi infiltrada dois dias antes. Para o Arabidopsis transgênico, infiltre a suspensão de Pseudomonas em duas folhas curtas de quatro semanas de idade.

Finalmente, corte um disco de folha para as folhas inoculadas com Pseudomonas. Em pontos de tempo específicos após a infiltração de Pseudomonas, use um sistema de varredura a laser confocal para obter imagens de dois discos de folhas de dois centímetros quadrados de uma única planta. Observe as células longe do orifício de infiltração para evitar que as células mortas sejam mortas por ferimentos.

Os efetores translocados da bactéria estão presentes apenas em quantidades muito pequenas. Portanto, você pode aumentar a potência do laser e obter uma emissão de fluorescência para detectar um sinal fluorescente. No entanto, não domine para evitar a captura de sinais falsos de autofluorescência das células vegetais.

Neste estudo, uma abordagem baseada em proteína fluorescente é usada para monitorar efetores secretados por bactérias em células hospedeiras. Uma varredura a laser confocal de uma folha de Nicotiana benthamiana três horas após a infecção é mostrada aqui. As células que expressam sfGFP otimizado apenas com AvrB não mostram nenhum sinal fluorescente.

No entanto, os sinais de GFP são vistos nas células infectadas contendo AvrB, sfGFP11. Isso verifica se o complexo AvrB sfGFP11 é reconstituído com sfGFP otimizado no citosol e, em seguida, transloca para a membrana plasmática. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter os materiais vegetais saudáveis e preparar uma cultura de bactérias frescas para as células ativas.

Após este procedimento, outros métodos, como análise de sangue em resina, podem ser adiados para entender a modificação da falsa tradução de proteínas efetoras de bactérias em células vegetais durante as respostas imunes das plantas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como visualizar a entrega do efetor tipo III em células vegetais infectadas. Materiais vegetais e culturas de bactérias devem ser descartados seguindo os critérios do seu laboratório para resíduos de risco biológico e não se esqueça de usar seu EPI.