Compactas pontos quânticos para uma única molécula de imagem

O objetivo geral deste procedimento é preparar pontos quânticos fluorescentes com brilho e estabilidade otimizados, bem como tamanho minimizado e ligação não específica para uso em imagens de molécula única. Isso é feito preparando primeiro pequenos núcleos de pontos quânticos de seleneto de cádmio. O segundo passo é ligar esses núcleos com mercúrio para mudar sua fluorescência para o espectro vermelho e aumentar seu brilho.

Em seguida, uma fina camada de liga é cultivada nos nanocristais para estabilizar sua emissão de fluorescência. A etapa final é transferir essas partículas de solventes orgânicos para tampões aquosos usando um polímero multidentado, que pode ser modificado com polietilenoglicol biologicamente inerte. Em última análise, espectrometria de fluorescência, cromatografia em gel e eletroforese em gel são usadas para mostrar que essas partículas têm fluorescência brilhante, um tamanho hidrodinâmico compacto e atributos de carga eletrostática neutra adequados para imagens de fluorescência de molécula única em biologia.

A principal vantagem desses pontos quânticos sobre os materiais comerciais existentes é que essas nanopartículas têm um tamanho hidrodinâmico significativamente reduzido. Embora pontos quânticos menores sejam impactados negativamente pela diminuição da intensidade de fluorescência, diminuição da estabilidade de fluorescência e fluorescência apenas no espectro azul, compensamos esses efeitos usando um processo de troca catiônica de mercúrio. Esses nanocristais podem ajudar a responder a questões-chave em biofísica e sinalização celular, permitindo imagens dinâmicas de biomoléculas únicas em ambientes biológicos lotados.

Para começar, prepare uma solução molar de 0,4 de selênio por cima, adicionando selênio a 50 mililitros. Balão de três gargalos, evacuando o balão sob alto vácuo e enchendo com argônio usando uma linha de haste sch em condições de ar livre. Adicione 10 mililitros de topo e aqueça a 100 graus Celsius, mexendo por uma hora para obter uma solução límpida e incolor.

Arrefecer a solução à temperatura ambiente e retirar o balão. Além disso, preparar uma solução de óxido de cádmio TDPA e EDO num balão de 250 ml e três pescoços, utilizando as quantidades indicadas no protocolo escrito. Acompanhando este vídeo, evacue a solução usando uma linha de haste enquanto agita.

Aumente a temperatura para 100 graus Celsius e evacue por mais 15 minutos. Para remover impurezas de baixo ponto de ebulição sob gás Argonne, aqueça a mistura a 300 graus Celsius por uma hora para dissolver completamente o óxido de cádmio. A solução mudará de uma cor avermelhada para clara e incolor esfriará a solução à temperatura ambiente.

Em seguida, adicione HDA à solução de cádmio, aqueça a 70 graus Celsius e evacue. Uma vez atingida uma pressão constante, aumentar a temperatura e refluir a solução durante 30 minutos. Mude a válvula de linha schlink para gás inerte e insira o termopar diretamente na solução.

Em condições de ar livre, adicione DPP à solução de cádmio e aumente a temperatura para 310 graus Celsius. Agora use uma seringa de plástico descartável presa a uma agulha de calibre 16 para remover 7,5 mililitros da solução de selênio 0,4 molar superior. Quando a temperatura se equilibrar em 310 graus Celsius, ajuste o controlador de temperatura para zero graus Celsius e injete rapidamente a solução superior de selênio diretamente na solução de cádmio.

A solução mudará de incolor para amarelo, laranja, e a temperatura cairá rapidamente e aumentará novamente para aproximadamente 280 graus Celsius. O passo mais difícil neste procedimento é injetar todo o volume da seringa o mais rapidamente possível na solução de cádmio. Isso garante que as partículas nucleem de forma homogênea.

Após um minuto de reação, remova o frasco do manto de aquecimento e resfrie rapidamente com uma corrente de ar até que a temperatura seja inferior a 200 graus Celsius. Quando a temperatura atinge aproximadamente 40 graus Celsius, diluir com 30 mililitros de hexano, a maior parte do precursor de cádmio restante se depositará fora da solução. Remover este precipitado por centrifugação.

Em cada um dos seis tubos de centrífuga cônicos de polipropileno de 50 mililitros, diluir 12 mililitros da solução nano Krystal bruta resultante. Com 40 mililitros de acetona após centrifugação com os mesmos parâmetros, decantar e descartar cuidadosamente o sobrenadante. Em seguida, dissolva os pellets de nano krysttal em hexano.

Extrair a solução com um volume igual de metanol, mantendo a fase superior. Repita esta extração mais duas vezes para a terceira extração. O volume de metanol pode ser ajustado para aproximadamente 15 mililitros para obter uma solução hexana concentrada de pontos quânticos de seleneto de cádmio puro a cerca de 200 micromolares.

O rendimento típico desta reação é três cristais de seleneto de cádmio micromolar com um diâmetro de dois três nanômetros determinam o diâmetro e a concentração de nano Krystal medindo o espectro de absorção ultravioleta visível conforme descrito no procedimento escrito, os nanocristais podem ser parcialmente trocados com mercúrio para redshift, a absorção e emissão de fluorescência. Para fazer isso em um frasco de vidro de 20 mililitros com barra de agitação, misture hexano e clorofórmio, adicione a solução de ponto quântico de seleneto de cádmio OLA e octano de mercúrio violar. Depois de purificar os nanocristais e determinar sua concentração conforme descrito no procedimento escrito, deixe os nanocristais envelhecerem por pelo menos 24 horas em temperatura ambiente para o crescimento da casca.

Prepare soluções precursoras de concha molar de 0,1 em 50 mililitros, três frascos de gargalo sob soluções de calor a vácuo de precursor de cádmio, precursor de zinco e precursor de enxofre para refluxo por uma hora para produzir soluções claras e, em seguida, carregue com argônio em um frasco de três gargalos. Adicione o topo ODE e os pontos quânticos de seleneto de mercúrio e cádmio preparados. Evacue a hexina à temperatura ambiente usando a linha de flanco.

Aumente a temperatura para 100 graus Celsius e reflua por 15 minutos. Troque a válvula de linha para gás Argonne e insira o termopar na solução nano Krystal. Depois de aumentar a temperatura para 120 graus Celsius, adicione 0,5 monocamadas ou 140 microlitros de solução precursora de enxofre e deixe a reação prosseguir por 15 minutos.

Aumente a temperatura para 140 graus Celsius. Adicione 0,5 monocamadas ou 140 microlitros de solução precursora de cádmio e deixe a reação prosseguir por 15 minutos. Em seguida, adicione 500 microlitros de OLA anidro à solução de reação.

Adicione 160 graus Celsius, adicione 0,5 monocamadas ou 220 microlitros de solução precursora de enxofre, seguida por uma quantidade igual de solução precursora de zinco a 170 graus Celsius com 15 minutos entre cada adição. Em seguida, a 180 graus Celsius, adicione 0,25 monocamadas ou 150 microlitros de solução precursora de enxofre e solução precursora de zinco em intervalos de 15 minutos. Fresco. A solução para a temperatura ambiente e um novo coeficiente de extinção para essas partículas.

Usando um espectro de vis UV, supondo que o número de nanocristais não tenha mudado, armazene a solução de reação como uma mistura bruta em um freezer. Nesta fase, os nanocristais podem ser caracterizados usando microscopia eletrônica, espectroscopia de absorção UV vis e espectroscopia de fluorescência. Adicione pontos quânticos de casca de núcleo purificado a um frasco de 50 mililitros e três gargalos e remova a hexina sob alto vácuo.

Para obter uma película seca, encher o balão com argona. Adicione purina anidra ao filme de nanopartículas e aqueça a pasta a 80 graus Celsius ao longo de uma a duas horas. As nanopartículas se dissolverão completamente.

Adicione um mililitro de um glicerol FIO à solução e mexa a 80 graus Celsius por duas horas. Depois de resfriar a solução à temperatura ambiente, adicione 0,5 mililitros de trietilamina para detonar o tioglicerol e mexa por 30 minutos. A solução pode ficar turva após a adição de trietilamina devido à baixa solubilidade dos nanocristais polares nesta mistura de solventes.

Transfira a solução de pontos quânticos para um tubo de centrífuga cônico de 50 mililitros contendo uma mistura de 20 mililitros de hexano e 20 mililitros de acetona e misture bem. Isole os nanocristais precipitados por centrifugação, seguida de lavagem de pellets com acetona, dissolva o pellet de pontos quânticos em cinco mililitros de DMSO com sonicação em banho e siga com centrifugação. Para remover possíveis agregados, determine a concentração de nanopartículas de um espectro de absorção UV V.

A solução de pontos quânticos puros deve ser usada dentro de três horas, pois a superfície pode oxidar lentamente sob condições ambientais no ar. Diluir a solução de pontos quânticos a 10 micromolares ou menos com DMSO e transferir para um balão de 50 mililitros. Adicione uma solução preparada de cinco miligramas por mililitro de ácido poliacrílico dilatado em DMSO, gota a gota à solução de pontos quânticos, mexendo e desgaseificando a solução à temperatura ambiente por cinco minutos.

Purgue a solução de polímero de ponto quântico com Argonne e aqueça a 80 graus Celsius por 90 minutos. Depois de resfriar a solução à temperatura ambiente, adicione um volume igual de 50 milimolares de sódio com pH oito gota a gota e mexa por 10 minutos. Purifique os pontos quânticos conforme descrito no procedimento escrito e determine a concentração de um espectro de absorção UV vis em um frasco de vidro de quatro mililitros com barra de agitação, misture um mole pontos quânticos em tampão borato com um excesso molar de 40.000 vezes de 750 Dalton mono amino polietilenoglicol.

Instruções podem ser encontradas no procedimento escrito sobre como adicionar funcionalidade química específica aos nanocristais. Adicione rapidamente um excesso molar de 25.000 vezes de uma solução recém-preparada da solução do agente ativador à solução de pontos quânticos e mexa em temperatura ambiente por 30 minutos. Repita esta etapa mais quatro vezes para saturar a superfície nano krysttal com PEG.

Finalmente, adicione 200 microlitros de um tampão tris molar para extinguir a reação antes de purificar os nanocristais Usando filtros centrífugos de diálise ou ultracentrifugação, o nano chrystal resultante pode ser analisado quanto ao tamanho hidrodinâmico de mono dispersão e carga superficial usando cromatografia líquida, eletroforese em gel e microscopia de fluorescência. Aqui é mostrado um espectro representativo de absorção e fluorescência para nanocristais de seleneto de cádmio, mercúrio, cádmio, seleneto, nanocristais após troca de cádions e um núcleo de seleneto de cádmio de mercúrio, cádmio de concha, nanocristais de sulfeto de zinco após o crescimento da casca. Os nanocristais de seleneto de cádmio do núcleo têm um rendimento quântico de fluorescência próximo a 15%No entanto, essa eficiência cai para menos de 1% após a troca de mercúrio, provavelmente devido a armadilhas portadoras de carga introduzidas por meio da ruptura do átomo da superfície.

O crescimento de uma fina casca de sulfeto de cádmio e zinco aumenta essa eficiência para mais de 70%, que é amplamente mantida após a transferência para a água. Em contraste, os nanocristais de seleneto de cádmio central, cádmio e sulfeto de zinco sem incorporação de mercúrio perdem uma fração substancial de seu rendimento quântico em água, a menos que uma casca espessa seja cultivada. É importante notar que o capeamento com sulfeto de cádmio e zinco desloca os espectros para o vermelho devido ao vazamento dos portadores de carga eletrônica no material do invólucro.

Essa mudança é de cerca de 20 a 30 nanômetros para núcleos de cádmio e aumenta com o aumento do teor de mercúrio no núcleo. Assim, ao incorporar mercúrio no nanocristal do núcleo, o pequeno tamanho do nano Krystal pode ser mantido sem sacrificar o brilho. O pequeno tamanho é demonstrado nesta micrografia eletrônica de transmissão e distribuição de tamanho de partícula de nanocristais de mercúrio, cádmio, seleneto, cádmio e sulfeto de zinco mostrando um diâmetro médio de 3,2 mais ou menos 0,6 nanômetros.

O uso de uma transferência de fase em duas etapas para a água é fundamental para obter uma população homogênea de nanocristais que não requerem mais classificação de tamanho para remover aglomerados e agregar a exclusão de tamanho. O cromatograma aqui representado confirma que o tamanho é semelhante ao da albumina. Com 75 kilodaltons e após modificação com 750 Dalton amino PEG, o tamanho é aumentado para apenas 12 nanômetros, semelhante ao de um anticorpo IgG.

A modificação do PEG neutraliza a carga superficial conforme confirmado no experimento de eletroforese em gel aros descrito aqui, o poço é marcado com uma seta e as polaridades do eletrodo são indicadas à direita, mostrando que antes da conjugação os nanocristais migram como partículas onic e que os nanocristais peguilados são eletrostaticamente neutros. Aqui é mostrada uma micrografia de epifluorescência desses nanocristais depositados em uma lamínula de vidro e excitados com luz visível de 545 nanômetros. Esses nanocristais são prontamente observados no nível de molécula única a 30 quadros por segundo com uma câmera CCD multiplicadora de elétrons.

Este gráfico mostra que o número de partículas fluorescentes observadas em cada quadro flutua ao longo do tempo com excitação contínua. Isso se deve a uma combinação de piscar e fotodegradação. O piscar domina nos primeiros sete minutos antes que a fotodegradação oxidativa se torne lentamente aparente.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como sintetizar quimicamente pontos quânticos, como transferi-los para tampões aquosos e como modificá-los para aplicações de bioimagem. Não se esqueça de que trabalhar com reagentes contendo cádio e mercúrio pode ser extremamente perigoso, e precauções extras devem ser tomadas para evitar a exposição pessoal.