Mapeamento de Difusão Molecular na membrana plasmática por Multiple-Target Tracing (MTT)

Hi.In este vídeo, apresentamos um único experimento completo de rastreamento quântico. Um algoritmo dedicado foi inteiramente concebido em colaboração com especialistas em imagens ISIS. Durante este vídeo, usaremos o receptor do fator de crescimento epidérmico como modelo para descrever o método dessa técnica.

O receptor do fator de crescimento epidérmico é uma proteína transmembrana. Este receptor será marcado usando um anticorpo monoclonal, que é reduzido para manter apenas o fragmento A a B. O fragmento A a B é biotinilado e, em seguida, ligado à estreptavidina do ponto quântico, o sistema de parede reconhecerá com precisão o receptor EGF.

Nosso objetivo é fornecer uma visão abrangente da dinâmica dos receptores de superfície celular. De fato, as trajetórias moleculares podem se desviar da difusão de brot por estarem confinadas em nanodomínios. Por exemplo, e isso pode ser a assinatura de uma interação subjacente com, por exemplo, parceiros de sinalização ou andaimes moleculares.

Nosso objetivo é descrever esses eventos exaustivamente, mapeando-os sobre a célula, o que requer trabalhar em alta resolução temporal SPECT juntamente com alta densidade de marcação. Portanto, chamamos essa abordagem de rastreamento de vários alvos. O primeiro passo do experimento é a preparação da amostra.

Trabalhamos com células vivas sem antibióticos. Aqui usamos células de custo sete, que expressam endogenamente os receptores EGF. Depois de separar a célula, precisamos confirmar com precisão para ter o mesmo número de células no poço do laboratório.

Um número preciso de células é muito importante para aumentar a previsibilidade do número de pontos quânticos por célula Depois de dispensar a célula em H, bem, você precisa incubar o labato por 24 horas a 37 graus com 7% de CO2. O próximo passo é a preparação do ponto quântico acoplado a anticorpos. Os pontos quânticos são pequenas nanopartículas fluorescentes.

Essas partículas têm um interesse muito grande aqui porque são muito brilhantes e estáveis em comparação com a sonda e o sinal fluorescentes clássicos. A proporção do nariz é muito importante para este tipo de experimento. Nesse caso, usamos meio completo para saturar os ides de faixa ao redor dos pontos quânticos e evitar a agregação.

Depois disso, tivemos os pontos quânticos na proteína bioTE ou anticorpos de interesse com proporção de um para um, a fim de ter estatisticamente mais pontos quânticos monovalentes. Neste experimento, usamos um fragmento a b contra o receptor EGF produzido em laboratório a partir de anticorpos monoclonais e que são direcionados com biotina. Durante a incubação em torno de 15 minutos, você pode manter o controle sob agregação e homogeneidade usando um agitador a 1.200 rotações por minuto e dois a cinco graus.

Quando a mistura estiver pronta, você pode adicioná-la em suas células. Remova o meio do poço com muito cuidado para evitar o descolamento celular no técnico de laboratório e adicione a quantidade necessária de mistura para o seu experimento. Nesse caso, adicionaremos 100 microlitros de mistura por poço.

Após a adição da mistura, você pode incubar sua célula por 15 minutos. Neste caso, a 37 graus com 7% de CO2. Após esta incubação, você pode encontrar um grande número de pontos gêmeos frequentes em suspensão no meio.

Esses pontos quânticos devem ser removidos antes da imagem. Por causa do barulho que trazemos. É por isso que precisamos lavar cada um, bem várias vezes neste caso, cinco vezes para se lavar.

Use meio de imagem com não autofluorescência. Aqui usamos o buffer HBSS com aps. Agora suas células estão prontas.

É hora de ir para a configuração para aquisição. A configuração é composta por quatro partes principais, um microscópio invertido, uma câmera com sensibilidade ocular, uma poderosa lâmpada de mercúrio e uma incubadora para manter a célula a 37 graus. A luz da lâmpada de mercúrio passa por uma fibra e por uma roda de filtro antes de iluminar a amostra.

O eSense da gripe da amostra é filtrado e coletado por uma câmera E-M-C-C-D à esquerda. Atualmente usamos 1,3 e 1,49 abertura numérica comerciante de óleo de objetivas. A etapa central deste experimento é a aquisição por si só.

Uma vez que as células estão em foco, olhamos para uma representativa com um rótulo forte. Nos pontos quânticos, primeiro adquirimos uma única imagem em luz branca transmitida, que pode ser usada para verificar o aspecto da célula e o limite especial dos pódios de LA. Em seguida, adquirimos vídeo normalmente a uma taxa de 36 milissegundos, a taxa mais rápida permitida em full frame.

Usamos um CCD multiplicador de elétrons para atingir a sensibilidade de uma única molécula com uma relação sinal-norte suficiente pelo menos acima de 20 decibéis. Normalmente em torno de 25 decibéis, geralmente adquirimos 300 quadros. Para avaliar um determinado conjunto de dados, você só precisa fornecer a passagem para o diretório que contém os arquivos de vídeo.

Em seguida, digitando o comando, o texto se reconecta no MetLab ou no comando MTT 23 I, que primeiro exibe uma listagem de interface gráfica. Todos os parâmetros utilizados iniciarão a análise totalmente automatizada. A análise MTT principal é realizada em cada quadro, invocando três tarefas principais, primeiro detecção para cada pixel para a presença ou ausência de uma dívida quântica alvo.

Em seguida, para cada estimativa de detecção do alvo, parâmetros relevantes, como sua posição de pixel, intensidade do sinal e assim por diante. Última reconexão dos novos alvos. Com os traços já construídos sobre os quadros anteriores para cada pixel.

Considerando uma sub-região local, comparamos duas hipóteses de presença, seja de apenas ruído ou de um sinal. Com a função de propagação de pontos, o ModuLite tem um pico de hin. Usamos um limite que garante alarmes falsos baixos o suficiente com menos de uma detecção de perus por quadro para cada alvo detectado.

Em seguida, realizamos um mínimo quadrado de pés nutritivos fantasmas para estimar a largura e a altura da posição do Goshen detectado. Isso fornece notavelmente a posição da célula spic do corante, normalmente em torno de 10 a 20 nanômetros de precisão para relações sinal-ruído típicas em picos de alta densidade que muitas vezes podem ser muito fechados e picos fortes podem impedir os mais fracos de lidar com isso. Esvaziamos os picos detectados da imagem inicial em execução.

Novamente, a detecção no resíduo normalmente pode distorcer 10% dos picos. Alcançar uma detecção quase exaustiva é muito proveitoso para uma reconexão precisa. Em seguida, o conjunto de novos alvos é combinado com o conjunto de traços anteriores para este aluno.

Para atribuir cada traço a um alvo, se possível, e lidar com possíveis piscadas, usamos todas as informações estatísticas disponíveis obtidas na etapa de detecção. Portanto, os alvos não são atribuídos apenas ao rastreamento mais próximo. Em caso de conflitos, quando os traços podem se cruzar, o que significa que as respectivas regiões relevantes de pesquisa se sobrepõem, consideraremos o valor estatístico de intensidade, velocidade, largura e piscar tanto para os traços quanto para os alvos.

Isso fornece a pontuação de reconexão estatisticamente ideal. A estratégia permite evitar, quando possível, enviesar a reconexão para os vizinhos mais próximos, ou seja, o movimento mais lento. Em seguida, usamos uma função para avaliar o possível confinamento transitório dentro das trajetórias.

Essa função está inversamente relacionada à difusão local estabelecida por Sexton Simpson e colaboradores. A aplicação de um limite permite definir episódios confinados ou não. Ao iterar esses traços gerais, podemos finalmente mapear a dinâmica da membrana em termos de confinamento transitório, evidência de desaceleração, e isso pode ser representado.

Alternativamente, usando os valores binários ou discretos deste índice de confinamento, por padrão, o MTT executará automaticamente essas tarefas, salvando para cada vídeo, os parâmetros de linha para cada pico em um arquivo eski e para investigações mais avançadas. Resultados típicos, como o mapa de traços sobre cada célula e histogramas gráficos para parâmetros de interesse, intensidades de pico, relação sinal-ruído, valores deficientes locais e, portanto, esse aspecto também pode ser facilmente adaptado a qualquer investigação dedicada. Este vídeo agora resumirá os resultados típicos obtidos pelo MTT.

Uma parte substancial do trabalho reside na elaboração do algoritmo, que pode precisar ser adaptado a investigações dedicadas, como os modos de movimento ou interações de sofrimento. Mas executar o MTT é muito simples. Os usuários devem otimizar apenas alguns parâmetros, como os limites de espaço e tempo.

Ao elaborar o MTT, buscamos reconsiderar inteiramente as opções analíticas utilizadas para cada tarefa. Otimizamos o processo ao longo de dois eixos desafiadores. Primeiro, lidar com altas densidades para obter as melhores informações especiais sobre a superfície da superfície e, em segundo lugar, lidar com SNR fraco, que normalmente permite trabalhar em baixa eliminação e confinamento de alta velocidade, pode ser interpretado como a assinatura de uma interação subjacente.

Os receptores de membrana podem interagir com o citoesqueleto submembrana ou domínios pró-lipídicos, por exemplo. Tais eventos podem ser investigados por meio de variações de confinamento no espaço e no tempo. As medidas dinâmicas podem ser comparadas a abordagens complementares, como FRA, F, Cs ou frete.

O código-fonte aberto está disponível para pesquisa acadêmica. Ele pode ser baixado de nossa página da web em CML dot univ se um S fr em nossa página de equipes, que fornece um link para download. Os industriais interessados também são bem-vindos para entrar em contato conosco.

Gostaríamos de agradecer especialmente aos membros de nossa equipe e das instalações comuns pelo apoio e discussões frutíferas. Este projeto é apoiado por financiamento do CNRS em c MAA University Pac Region National de La, e a Foundation Medical é apoiada pelo controlador da liga. Obrigado por assistir.