Optimizado coloração e Proliferação Métodos de Modelagem para Monitoramento Divisão Celular usando Corantes Rastreamento celulares

O objetivo geral deste método é usar corantes de rastreamento celular para quantificar diretamente a extensão da divisão celular para diferentes subconjuntos de células imunes em populações complexas. Isso é obtido primeiro marcando a população de células-mãe com um corante fluorescente conhecido por dar ligação estável a proteínas celulares ou por intercalar de forma não covalente nas membranas celulares para rastrear células marcadas com corante que respondem a contadores de estimulação, coloração com anticorpos fluorescentes e análise usando citometria de fluxo multiparâmetro permite a detecção de respostas diferenciais entre os tipos de células imunes de interesse estimuladas, Mas os controles de rastreamento de corante não corado são usados para estabelecer a menor intensidade de fluorescência da célula filha que pode ser distinguida do corante de rastreamento de autofluorescência marcado, mas os controles não estimulados são usados para estabelecer a intensidade de fluorescência na qual as células indivisas serão detectadas. A estimulação geralmente resulta em uma ampla gama de intensidades à medida que as células que proliferam em resposta se tornam progressivamente mais fracas, mas as que não respondem não.

Em última análise, o uso de software de modelagem de pico para estimar a frequência relativa das células em diferentes gerações pode permitir a comparação quantitativa das respostas proliferativas em diferentes populações ou estímulos usando métricas como índice de proliferação ou frequência precursora. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como tritiado, tua incorporação ou expressão de KI 67, é que a diluição DI fornece uma medida direta da divisão celular que pode ser combinada com outras medidas de citometria de fluxo ME, como imunofenotipagem e produção de citocinas. A demonstração visual do método de coloração com corante de membrana é útil, pois a absorção do corante pelas células é extremamente rápida.

Consequentemente, uma boa técnica é a chave para obter uma coloração homogênea brilhante. Após as células mononucleares do sangue periférico humano serem isoladas, centrífuga por cinco minutos a 300 vezes G e temperatura ambiente para minimizar a contaminação plaquetária. Em seguida, ressuspenda o pellet a 10 elevado à sétima célula por mililitro em HBSS mais 1% BSA e coloque-os no gelo.

Remova e reserve um Eloqua de 500 microlitros e, em seguida, transfira outra alíquota de células de 500 microlitros para um tubo cônico de polipropileno de 12 por 75 milímetros. Adicione 3,5 mililitros de HBSS e gire as células por cinco minutos a 400 vezes G e temperatura ambiente durante a lavagem, adicione 0,5 mililitros de veículo de rotulagem C diluente do kit PKH 26 GL a outro tubo cônico de polipropileno de 12 por 75 mililitros, aspire cuidadosamente o super natin deixando não mais do que 15 a 25 microlitros de fluido residual e tomando cuidado para não remover nenhuma célula. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de veículo de marcação de C diluente ao pellet celular e aspire e dispense a solução várias vezes para obter uma suspensão de célula única.

Agora prepare os dois estoques XD adicionando dois microlitros de PKH 26 ao tubo contendo o diluente C. Só agora pipete imediatamente a suspensão celular em duas soluções de corante XPKH 26 recém-preparadas e, simultaneamente, aspire e dispense a mistura várias vezes para dispersar uniformemente as células por todo o corante. Após um minuto, adicione um mililitro de soro inativado pelo calor para interromper a absorção do corante nas membranas celulares. Depois de girar as células, aspire cuidadosamente o sobrenadante sem remover o pellet.

Em seguida, disperse o pellet em quatro mililitros de meio completo contendo 10% de soro inativado por calor e transfira a suspensão celular para um tubo de polipropileno novo. Lave as células duas vezes em HBSS mais 1% BSA adequadamente coradas as células exibirão uma coloração rosa distinta no pellet Após a suspensão do pellet celular em um mililitro HBSS mais 1% BSA, conte as células e ajuste o volume para dar uma concentração final de 10 elevado às sétimas células por mililitro. Depois de corar as células de acordo com o protocolo de citometria de fluxo descrito na tabela, use os cinco primeiros tubos para definir os parâmetros de dispersão direta e lateral e os sinais em todos os quatro detectores de fluorescência.

Em particular para o detector usado para monitorar a fluorescência PKH 26 no tubo dois. Verifique se todas as células coradas com PKH 26 aparecem na escala como um único pico simétrico na terceira a quarta década, com poucas ou nenhuma célula no último canal. Em seguida, use o software de compensação de cores e os arquivos de modo de lista coletados para os tubos de um a cinco para estabelecer uma matriz de sobreposição de cores para cada fluro nos detectores que estão sendo usados para monitorar os outros três fluorocromos.

Em seguida, aplique essa matriz ao arquivo de modo de lista para a amostra seis. Verificar se a presença de marcação com PKH 26 não altera a capacidade de detectar sete células positivas para A, a D. Agora aplique essa matriz de sobreposição de cores recém-estabelecida ao arquivo de modo de lista para o tubo sete.

Identifique as populações de CD três positivas em quatro negativos e em uma parcela de EC versus PC. Confirme se a presença de anti CD três, FE e anti CD quatro A PC não altera a capacidade de detectar sete células positivas A a D. Por fim, aplique a matriz de sobreposição de cores para o tubo sete ao modo de lista Arquivo para o tubo oito.

Agora abra um programa contendo um módulo de análise de proliferação. Carregue o arquivo corado PKH 26 estimulado do conjunto de dados a ser analisado. Em seguida, selecione os parâmetros para análise neste caso, PKH 26 fechado em sete cd negativo viável a a, três linfócitos positivos e espalhamento frontal versus espalhamento lateral para exclusão de pequenos detritos e grandes agregados.

Ao definir essas regiões, tenha o cuidado de incluir a área de alta dispersão para a frente onde as explosões são normalmente encontradas. Em seguida, abra o assistente de proliferação. Clique na guia iniciar para abrir o arquivo de dados e, em seguida, carregue o controle positivo PKH 26 não estimulado.

Defina a localização do pico parental correspondente às células indivisas. Analise o arquivo observando os valores para a posição e largura do pico parental. Se uma largura de pico fixa for desejada, marque a trava SD, carregue o controle negativo P KH 26 e ajuste o número de gerações definindo o canal de pico para a geração filha dimus acima das células negativas PKH 26.

Isso define o número de gerações filhas. O modelo pode caber com precisão quando concluído. Recarregue o arquivo positivo PKH 26 estimulado.

Se os picos geracionais distinguíveis forem evidentes, escolha a configuração flutuante na opção de modelo. Se as décadas de log não forem exatamente 4.0, ajuste o espaçamento geracional conforme discutido no artigo. Agora, analise a amostra estimulada e confirme se a região para a posição de pico parental permanece inalterada.

Por fim, selecione analisar para cada arquivo experimental no conjunto de dados a ser aplicado. O modelo acabou de criar e registrar as métricas de proliferação desejadas resultantes do melhor ajuste para cada arquivo experimental no conjunto de dados. Esta primeira série de dados ilustra o efeito da técnica de mistura nas distribuições de fluorescência de PKH 26.

Quando cultivadas, as células mieloides U 9 37 foram coradas com o corante de rastreamento celular usando o método que acabamos de descrever, este primeiro histograma mostra os dados de controle não corados. As configurações do citômetro foram ajustadas para colocar a autofluorescência dessas células na primeira década, com nenhuma ou muito poucas células se acumulando no primeiro canal. Este segundo histograma ilustra uma boa coloração PKH 26.

A mistura rápida de duas células x com dois corantes x deu uma distribuição de fluorescência brilhante, homogênea e simétrica, mas não tinha células fora da escala nas configurações do instrumento usadas para o histograma anterior. Quando duas células x foram adicionadas a dois corantes x sem mistura imediata, uma distribuição de fluorescência mais heterogênea foi obtida. Esta pequena subpopulação de células fracamente marcadas seria erroneamente interpretada como células-filhas se estivessem presentes em um ponto posterior no histograma final deste experimento, a mistura deficiente também ocorreu quando três microlitros de estoque de corante de etanol concentrado foram acidentalmente adicionados diretamente a 0,5 mililitros de suspensão de duas células x, produzindo uma distribuição de intensidade de fluorescência extremamente fraca e inclinada para a direita.

Aqui, resultados típicos de um experimento de proliferação no qual células mononucleares do sangue periférico humano coradas com PKH 20 foram cultivadas com ou sem estímulo. Os reagentes anti CD três e IL dois são mostrados. Após 96 horas de cultivo, as células foram colhidas e contracoradas com anti CD três FE anti CD 19 A PC e sete A a d.

Duas estratégias de gating diferentes foram comparadas na primeira estratégia de gating, um gráfico de pontos de CD três versus sete. A A D foi usado para selecionar sete células T vivas a a d CD negativo três positivas. Uma região de dispersão frontal e lateral foi então usada para bloquear grandes agregados enquanto ainda incluía linfócitos explosivos.

Os eventos fechados R um mais R dois para o controle não corado são representados pelo histograma cinza e as células coradas com PKH 26, mas não estimuladas estão em nota azul, a coloração homogênea simétrica brilhante para células T viáveis, mas não divididas no controle não estimulado. Esses dados foram bloqueados da mesma maneira que a figura anterior, mas, neste caso, as células foram estimuladas com anti CD três e IL dois. O histograma PKH 26 para R um mais R dois eventos fechados agora contém principalmente células divididas com intensidade reduzida representada por picos coloridos para cada geração filha.

Embora algumas células brilhantes e indivisas ainda permaneçam no pico parental azul. Observe que a intensidade das células altamente divididas ainda não se sobrepõe à região onde as células não coradas são medidas, o que confundiria a estimativa de métricas com base no número de células nas gerações filhas de menor intensidade aqui. Os mesmos dados foram analisados como os dois conjuntos de figuras anteriores, mas apenas dispersão de luz e CD três foram usados para selecionar células T viáveis.

Essa estratégia de gating exclui muitas, mas não todas as células mortas, conforme demonstrado pela pequena população residual de sete células mortas positivas A A D restantes no CD três versus sete gráficos de pontos AAD. A escolha dos fluorocromos usados para imunofenotipagem pode criar problemas de compensação desafiadores ao usar matrizes de rastreamento celular, pois a intensidade de coloração de células indivisas é extremamente brilhante. Neste experimento, células mononucleares do sangue periférico com 24 horas de idade foram marcadas com PKH 26 e, em seguida, contracoradas com anticorpos para CD três e CD quatro mais um corante de viabilidade.

Nesta série de dados, as células marcadas com dois PKH 26 micromolares foram contra-coradas com anti CD três FZ sete A a D e anti CD quatro A PC, e então analisadas usando a mesma estratégia de gating R um mais R dois de antes, porque há pouca sobreposição de PKH 26 no canal A PC, CD quatro eventos positivos e negativos foram claramente resolvidos independentemente de a compensação ter sido aplicada ou não. Esses dados ilustram como o CD viável três células T positivas e quatro positivas permaneceu bem resolvido mesmo quando a concentração final de PKH 26 foi aumentada para quatro micromolares. O uso de anti CD quatro por CP em combinação com anti CD três FE dois PKH micromolar 26 e a matriz de viabilidade para pro três deu resultados muito piores devido à sobreposição significativa de PKH 26 no canal por CP.

As quatro células positivas e negativas não puderam ser resolvidas uma da outra em dados não compensados e foram resolvidas apenas marginalmente quando a compensação foi aplicada. O aumento da concentração final de PKH 26 para quatro micromolares resultou em uma perda completa da capacidade de resolver os eventos CD quatro positivos de CD quatro negativos, mesmo após a aplicação da compensação. Observe como as amostras incluindo ou sem anti CD quatro por CP eram essencialmente idênticas.

Quando um perfil de diluição de corante é analisado usando um software de modelagem de pico para estimar a frequência de células em gerações filhas sucessivas, as posições e/ou larguras de picos filhas sucessivas podem ser fixas ou flutuantes. Com relação aos valores para o pico parental. Esses valores são estimados a partir do controle não estimulado.

Por exemplo, este perfil de intensidade PKH 26 é de uma cultura não estimulada de 96 horas de um respondedor moderado e foi usado para fornecer ao assistente de proliferação de ajuste mod a primeira estimativa de posição e largura para o pico que representa células parentais não divididas. O uso de uma configuração fixa para a posição de pico requer que a média de cada pico geracional seja exatamente metade da intensidade de fluorescência do pico anterior. Uma configuração flutuante para a posição de pico permite que as posições finais dos picos geracionais variem das intensidades esperadas conforme necessário para obter o melhor ajuste.

Da mesma forma, uma configuração fixa para a largura do pico requer que a largura de cada pico geracional seja a mesma do pico de controle parental ou não estimulado. Uma configuração flutuante para largura de pico permite que as larguras finais sejam variadas independentemente conforme necessário para obter o melhor ajuste nesta tabela. Os resultados das análises dos números anteriores para dois doadores diferentes são mostrados para esses doadores, onde picos geracionais distinguíveis eram evidentes.

Os melhores valores de qui-quadrado reduzido foram obtidos quando a posição do pico e a largura foram deixadas flutuar para perfis de proliferação onde picos geracionais distinguíveis não são evidentes, recomenda-se uma configuração fixa para a posição do pico. Esses dados ilustram o uso de dois corantes de rastreamento para monitorar separadamente os históricos de proliferação de diferentes tipos de células imunes em um ensaio de imunossupressão por citometria de fluxo. As células T efetoras mostradas em verde foram marcadas com CFSE e as células T reguladoras mostradas em azul foram marcadas com visualização celular.

As populações de células marcadas com clarete foram misturadas em proporções variadas e cultivadas na presença de células anti CD três, anti CD 28 e células acessórias irradiadas por 96 horas. Em seguida, as células foram colhidas e coradas com anti CD quatro, PE tamanho sete e violeta viva morta. Aqui. Dados representativos para uma proporção de efetores treg para T de 0,25 para um são mostrados após a eliminação de células positivas violetas mortas vivas.

Um portão de dispersão de luz que incluía linfócitos e blastos, mas excluía agregados e detritos foi aplicado, seguido por um portão para incluir quatro eventos positivos para DC. A coloração de clarete de visão celular permitiu que as células treg viáveis fossem facilmente distinguidas das células efetoras T viáveis que foram altamente proliferadas e, portanto, os perfis de proliferação de DIM CFSE para células efetoras T positivas para CFSE e células treg positivas para Claret de visão celular foram analisados usando um software de modelagem de pico mod fit. Aproximadamente 25.000 eventos foram analisados.

Destes, 48% eram efetores T viáveis, 6% eram T regs viáveis, sendo o restante células mortas, células acessórias e detritos. O índice de proliferação calculado, que reflete o aumento de dobras no número de células durante o período do ensaio, foi de 3,85 para efetores T e 1,83 para Tregs. Aqui, é mostrado o efeito da concentração de células tregs no índice de proliferação de células T efetoras calculado a partir do perfil de diluição do corante CFSE.

Os resultados foram os mesmos, quer as células treg tenham sido marcadas com clarete de visão celular ou não tenham sido coradas, indicando que a função treg não foi alterada pela coloração. Com o rastreamento como esperado, a extensão da proliferação do tector aumentou à medida que a concentração de células treg diminuiu. Os índices de proliferação de células Treg também foram calculados a partir de perfis de diluição de corante clarete em diferentes proporções de efetores treg para T.

Como esperado, as Tregs sofreram proliferação mínima na ausência de células efetoras T à medida que a concentração de células efetoras T aumentou. No entanto, a extensão da proliferação de células treg também aumentou. Depois de assistir ao vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar com sucesso corantes de rastreamento celular para monitorar a proliferação celular, como escolher fluorocromos apropriados e controles de compensação de cor e como selecionar um modelo apropriado para quantificar a divisão celular com base na diluição do corante.

Junto com este procedimento, outros métodos podem ser realizados para responder a questões experimentais, como coloração de células T específicas do antígeno ou classificação de fluxo para recuperação de células-tronco que estão quiescentes ou se dividindo lentamente. Muito obrigado por assistir.