Optimizado coloração e Proliferação Métodos de Modelagem para Monitoramento Divisão Celular usando Corantes Rastreamento celulares

O objetivo geral deste método é utilizar corantes de rastreamento celular para quantificar diretamente o grau de divisão celular em diferentes subpopulações de células imunes dentro de populações complexas. Isso é alcançado primeiramente marcando a população parental de células com um corante fluorescente conhecido por promover ligação estável a proteínas celulares ou por intercalar de forma não covalente nas membranas celulares, para rastrear células marcadas com corante que respondem à estimulação. Após contagem, as células são coradas com anticorpos fluorescentes e analisadas por citometria de fluxo multiparamétrica, permitindo a detecção de respostas diferenciais entre os tipos celulares imunes de interesse estimulados. Controles não marcados com corante de rastreamento são utilizados para estabelecer a menor intensidade de fluorescência em células-filhas que pode ser distinguida da autofluorescência. Controles marcados com corante de rastreamento, mas não estimulados, são então usados para definir a intensidade de fluorescência na qual as células não divididas serão detectadas. A estimulação geralmente resulta em uma ampla faixa de intensidades, já que as células que se proliferam em resposta tornam-se progressivamente mais fracas em fluorescência, ao passo que as células não respondedoras não apresentam essa alteração.

Por fim, o uso de software de modelagem de picos para estimar a frequência relativa de células em diferentes gerações pode permitir a comparação quantitativa das respostas proliferativas entre diferentes populações ou estímulos, utilizando métricas como índice de proliferação ou frequência de precursoras. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como incorporação de timidina tritiada ou expressão de KI 67, é que a diluição do DI fornece uma medida direta da divisão celular que pode ser combinada com outras análises citométricas por fluxo, como imunofenotipagem e produção de citocinas. A demonstração visual do método de coloração com corante de membrana é útil, pois a captação do corante pelas células é extremamente rápida.

Consequentemente, uma boa técnica é fundamental para obter uma coloração brilhante e homogênea. Após o isolamento de células mononucleares do sangue periférico humano, centrifugue por cinco minutos a 300 × g e temperatura ambiente para minimizar a contaminação por plaquetas. Em seguida, ressuspenda o pellet em 10⁷ células por mililitro em HBSS acrescido de 1% de BSA e coloque no gelo.

Remova e reserve 500 microlitros de Eloqua, em seguida transfira outro alíquota de 500 microlitros de células para um tubo cônico de polipropileno de 12 por 75 milímetros. Adicione 3,5 mililitros de HBSS e centrifugue as células por cinco minutos a 400 × g e temperatura ambiente. Durante a lavagem, adicione 0,5 mililitros do veículo de diluição C para marcação do kit PKH26 GL a outro tubo cônico de polipropileno de 12 por 75 milímetros. Aspire cuidadosamente o sobrenadante, deixando não mais que 15 a 25 microlitros de fluido residual e tomando cuidado para não remover nenhuma célula. Em seguida, adicione 0,5 mililitros do veículo de diluição C para marcação ao pellet celular e aspire e dispense a solução várias vezes para obter uma suspensão de células simples.

Agora, prepare o estoque de dois XD adicionando dois microlitros de PKH 26 ao tubo contendo o diluente C. Imediatamente após, pipete a suspensão celular para dentro da solução recém-preparada de corante dois XPKH 26 e simultaneamente aspire e dispense a mistura várias vezes para dispersar uniformemente as células por todo o corante. Após um minuto, adicione um mililitro de soro inativado pelo calor para interromper a captação do corante pelas membranas celulares. Após centrifugar as células, aspire cuidadosamente o sobrenadante sem remover o pellet.

Em seguida, ressuspenda o pellet em quatro mililitros de meio completo contendo 10% de soro inativado pelo calor e transfira a suspensão celular para um novo tubo de polipropileno. Lave as células duas vezes em HBSS acrescido de 1% de BSA; células adequadamente coradas exibirão uma tonalidade rosa distinta no pellet. Após ressuspender o pellet celular em um mililitro de HBSS com 1% de BSA, conte as células e, então, ajuste o volume para obter uma concentração final de 10 elevado à sétima células por mililitro. Após corar as células de acordo com o protocolo de citometria de fluxo descrito na tabela, utilize os cinco primeiros tubos para ajustar os parâmetros de dispersão anterior e dispersão lateral, bem como os sinais nos quatro detectores de fluorescência.

Em especial para o detector usado para monitorar a fluorescência do PKH 26 no tubo dois. Verifique se todas as células marcadas com PKH 26 aparecem na escala como um único pico simétrico na terceira ou quarta década, com poucas ou nenhuma célula no último canal. Em seguida, utilize o software de compensação de cor e os arquivos em modo de lista coletados dos tubos um a cinco para estabelecer uma matriz de sobreposição de cores para cada fluoróforo nos detectores utilizados para monitorar os outros três fluorocromos.

Em seguida, aplique esta matriz ao arquivo em modo de lista da amostra seis. Para verificar se a presença da marcação com PKH26 altera a capacidade de detectar células positivas para sete A a D. Agora, aplique esta matriz de sobreposição de cores recém-estabelecida ao arquivo em modo de lista do tubo sete.

Identifique as populações CD três positivo CD quatro negativo e CD três positivo CD quatro positivo em um gráfico de FE versus PC. Confirme que a presença de anti-CD três, FE e anti-CD quatro A PC não altera a capacidade de detectar células positivas para sete A a D. Por fim, aplique a matriz de sobreposição de cores do tubo sete ao arquivo em modo de lista do tubo oito.

Agora, abra um programa que contenha um módulo de análise de proliferação. Carregue o arquivo marcado com PKH26 estimulado do conjunto de dados a ser analisado. Em seguida, selecione os parâmetros para análise, neste caso, PKH26 com porta definida em células viáveis, negativas para sete a a d, positivas para cd3 e análise de dispersão para frente versus dispersão lateral para exclusão de detritos pequenos e agregados grandes.

Ao definir essas regiões, tenha cuidado para incluir a área de dispersão para frente alta onde os blastos são normalmente encontrados. Em seguida, abra o assistente de proliferação. Clique na guia inicial para abrir o arquivo de dados e depois carregue o controle positivo não estimulado com PKH 26.

Defina a localização do pico parental correspondente às células não divididas. Analise o arquivo observando os valores de posição e largura do pico parental. Se uma largura de pico fixa for desejada, marque o bloqueio do DP, carregue o controle negativo P KH 26 e ajuste o número de gerações definindo o canal do pico para a geração de células filhas dimus acima das células negativas para PKH 26.

Isso define o número de gerações filhas. O modelo pode ajustar com precisão quando concluído. Recarregue o arquivo positivo para PKH 26 estimulado.

Se picos geracionais distinguíveis forem evidentes, escolha a configuração flutuante na opção de modelo. Se as décadas logarítmicas não forem exatamente 4,0, ajuste o espaçamento geracional conforme discutido no artigo. Agora, analise a amostra estimulada e confirme que a região para a posição do pico parental permanece inalterada.

Por fim, selecione analisar para cada arquivo experimental no conjunto de dados a ser aplicado. O modelo recém-criado registra as métricas de proliferação desejadas resultantes do melhor ajuste para cada arquivo experimental no conjunto de dados. Esta primeira série de dados ilustra o efeito da técnica de mistura nas distribuições de fluorescência de PKH 26.

Quando cultivadas, as células mieloides U 9 37 foram coradas com o corante de rastreamento celular utilizando o método recém-descrito; este primeiro histograma mostra os dados do controle não corado. Os parâmetros do citômetro foram ajustados para posicionar a autofluorescência dessas células na primeira década, com nenhuma ou muito poucas células acumuladas no primeiro canal. Este segundo histograma ilustra uma boa coloração com PKH 26.

A mistura rápida de duas x células com dois x corante resultou em uma distribuição de fluorescência brilhante, homogênea e simétrica, mas sem células fora da escala nas configurações do instrumento utilizadas para o histograma anterior. Quando duas x células foram adicionadas a dois x corante sem mistura imediata, obteve-se uma distribuição de fluorescência mais heterogênea. Essa pequena subpopulação de células fracamente marcadas seria erroneamente interpretada como células filhas se estivesse presente em um ponto temporal posterior no histograma final deste experimento. A má mistura também ocorreu quando três microlitros de estoque concentrado de corante em etanol foram acidentalmente adicionados diretamente a 0,5 mililitros de suspensão de duas x células, resultando em uma distribuição de intensidade de fluorescência extremamente fraca e com assimetria para a direita.

Aqui são apresentados resultados típicos de um experimento de proliferação no qual células mononucleares do sangue periférico humano marcadas com PKH 20 foram cultivadas com ou sem agentes estimulatórios. São mostrados os reagentes anti-CD3 e IL-2. Após 96 horas de cultivo, as células foram colhidas e coradas com anti-CD3, FE anti-CD19 APC e 7AAD.

Duas estratégias de seleção diferentes foram comparadas. Na primeira estratégia, um gráfico de dispersão de CD três versus sete A A D foi utilizado para selecionar células T viáveis, negativas para sete A A D e positivas para CD três. Em seguida, uma região de dispersão direta e lateral foi usada para excluir grandes agregados, mantendo ainda as linfócitos em blástula.

Os eventos com portão em R um mais R dois para o controle não corado são representados pelo histograma cinza, e as células coradas com PKH 26, mas não estimuladas, estão em azul. Observe a coloração brilhante, simétrica e homogênea para linfócitos T viáveis, porém não divididos, no controle não estimulado. Esses dados foram submetidos a portão da mesma maneira que na figura anterior, mas, neste caso, as células foram estimuladas com anti-CD três e IL dois. O histograma de PKH 26 para eventos com portão em R um mais R dois agora contém principalmente células divididas, com intensidade reduzida, representada por picos coloridos para cada geração de células-filhas.

Embora algumas células brilhantes não divididas ainda permaneçam no pico parental azul. Observe que a intensidade das células altamente divididas ainda não se sobrepõe à região onde são medidas as células não coradas, o que poderia confundir a estimativa de métricas baseadas no número de células nas gerações filhas de menor intensidade aqui. Os mesmos dados foram analisados como nos dois conjuntos anteriores de figuras, mas apenas a dispersão da luz e o CD três foram utilizados para selecionar linfócitos T viáveis.

Essa estratégia de seleção exclui muitas, mas não todas, as células mortas, conforme demonstrado pela pequena população residual de sete células mortas positivas para sete A a D que permanecem nos dot plots de CD três versus sete A a D. A escolha dos fluorocromos utilizados para imunofenotipagem pode criar problemas desafiadores de compensação ao usar corantes de rastreamento celular, já que a intensidade de coloração das células não divididas é extremamente elevada. Neste experimento, células mononucleares do sangue periférico com 24 horas de cultivo foram marcadas com PKH 26 e, em seguida, contra-coloridas com anticorpos contra CD três e CD quatro, além de um corante de viabilidade.

Nesta série de dados, as células marcadas com PKH 26 a dois micromolares foram contra-coloridas com anti-CD3 FZ7A6D e anti-CD4 APC, e então analisadas utilizando a mesma estratégia de seleção R1 mais R2 usada anteriormente. Como há pouca sobreposição do PKH 26 no canal APC, os eventos CD4 positivos e negativos foram claramente resolvidos, independentemente de ter sido aplicada ou não a compensação. Esses dados ilustram como as células T viáveis CD3 positivas e CD4 positivas permaneceram bem resolvidas mesmo quando a concentração final de PKH 26 foi aumentada para quatro micromolares. O uso de anti-CD4 PerCP em combinação com anti-CD3 FE, PKH 26 a dois micromolares e o corante de viabilidade Pro3 resultou em desempenho muito inferior devido à sobreposição significativa do PKH 26 no canal PerCP.

Células positivas e negativas para CD4 não puderam ser separadas umas das outras nos dados não compensados e foram apenas marginalmente resolvidas quando foi aplicada a compensação. Aumentar a concentração final de PKH26 para quatro micromolares resultou na perda completa da capacidade de separar eventos CD4 positivos de eventos CD4 negativos, mesmo após a aplicação da compensação. Observe como as amostras com ou sem anti-CD4 perCP foram essencialmente idênticas.

Quando um perfil de diluição de corante é analisado usando software de modelagem de picos para estimar a frequência de células em gerações filhas sucessivas, as posições e/ou larguras dos picos filhos sucessivos podem ser fixas ou flutuantes, em relação aos valores do pico parental. Esses valores são estimados a partir do controle não estimulado.

Por exemplo, este perfil de intensidade PKH26 é de uma cultura de 96 horas não estimulada de um respondente moderado e foi utilizado para fornecer ao assistente de ajuste de proliferação uma primeira estimativa de posição e largura para o pico que representa as células parentais não divididas. O uso de uma configuração fixa para a posição do pico exige que a média de cada pico geracional seja exatamente metade da intensidade de fluorescência do pico anterior. Uma configuração flutuante para a posição do pico permite que as posições finais dos picos geracionais variem em relação às intensidades esperadas, conforme necessário para obter o melhor ajuste.

Da mesma forma, uma configuração fixa para a largura do pico exige que a largura de cada pico geracional seja igual à do pico controle parental ou não estimulado. Uma configuração flutuante para a largura do pico permite que as larguras finais sejam variadas independentemente conforme necessário para obter o melhor ajuste nesta tabela. Os resultados das análises das figuras anteriores para dois doadores diferentes são apresentados para esses doadores nos quais picos geracionais distinguíveis foram evidentes.

Os melhores valores de qui quadrado reduzido foram obtidos quando tanto a posição do pico quanto a largura foram permitidas flutuar para perfis de proliferação onde picos geracionais distinguíveis não são evidentes; recomenda-se uma configuração fixa para a posição do pico. Esses dados ilustram o uso de dois corantes de rastreamento para monitorar separadamente as histórias de proliferação de diferentes tipos de células imunes em um ensaio de supressão imune por citometria de fluxo. As células T efetoras mostradas em verde foram marcadas com CFSE e as células T reguladoras mostradas em azul foram marcadas com cell view.

Populações celulares marcadas com clarete foram misturadas em diferentes proporções e cultivadas na presença de anti-CD3, anti-CD28 e células acessórias irradiadas durante 96 horas. Posteriormente, as células foram coletadas e marcadas com anti-CD4, PE-Cy7 e violeta para discriminação de células mortas. Aqui, dados representativos para uma razão de Treg para células T efetoras de 0,25 para 1 são apresentados após o gateamento para exclusão de células positivas para violeta para discriminação de células mortas.

Um filtro de dispersão da luz que incluía linfócitos e blastos, mas excluía agregados e detritos, foi aplicado, seguido por um filtro para incluir eventos CD4 positivos. A coloração com Cell View Claret permitiu distinguir facilmente as células Treg viáveis das células T efetoras viáveis, que estavam altamente proliferadas, e, portanto, os perfis de proliferação CFSE DIM para as células T efetoras CFSE positivas e as células Treg positivas para Cell View Claret foram analisados utilizando o software de modelagem de picos Mod Fit. Aproximadamente 25.000 eventos foram analisados.

Destas, 48% eram linfócitos T efetores viáveis, 6% eram linfócitos T reguladores viáveis, sendo o restante células mortas, células acessórias e detritos. O índice de proliferação calculado, que reflete o aumento da quantidade de células durante o período do ensaio, foi de 3,85 para os linfócitos T efetores e de 1,83 para os Treg. Aqui, mostra-se o efeito da concentração de células Treg sobre o índice de proliferação das células T efetoras, calculado a partir do perfil de diluição do corante CFSE.

Os resultados foram os mesmos, independentemente de as células Treg terem sido marcadas com o corante Cell View Claret ou terem sido deixadas não coradas, indicando que a função das Treg não foi alterada pela coloração. Com o rastreamento conforme esperado, o grau de proliferação das células T efetoras aumentou à medida que a concentração de células Treg foi reduzida. Os índices de proliferação das células Treg também foram calculados a partir dos perfis de diluição do corante Cell View Claret em diferentes proporções de Treg para T efetoras.

Como esperado, as Tregs sofreram proliferação mínima na ausência de células T efetoras conforme a concentração de células T efetoras aumentou. No entanto, o grau de proliferação das células Treg também aumentou. Após assistir ao vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar com êxito corantes de rastreamento celular para monitorar a proliferação celular, como escolher fluorocromos e controles de compensação de cor apropriados, e como selecionar um modelo adequado para quantificar a divisão celular com base na diluição do corante.

Juntamente com este procedimento, outros métodos podem ser realizados para responder perguntas experimentais, como a coloração de células T específicas para antígenos ou a triagem por fluxo para recuperação de células semelhantes a células-tronco que estão quiescentes ou se dividindo lentamente. Muito obrigado por assistir.