Name: Optimizado coloração e Proliferação Métodos de Modelagem para Monitoramento Divisão Celular usando Corantes Rastreamento celulares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 49 s
Description: Aprenda a quantificar divisão celular em subconjuntos de células imunes usando corantes fluorescentes e citometria de fluxo. Este método computacional permite análise multiparamétrica de proliferação celular com modelagem de picos.

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Os autores particularmente gostaria de agradecer às seguintes pessoas por suas contribuições técnicas e intelectuais para o desenvolvimento desses métodos através dos anos: Bruce Bagwell (Verity Software House), Nadège Bercovici (IDM), Lizanne Breslin (Zynaxis Cell Science e PTI Pesquisa) , Brian Gray (PTI Research), Jan Fisher (Dartmouth Medical School), Alice Givan (Dartmouth Medical School), Betsy Ohlsson-Wilhelm (SciGro, Inc.), e Maria Waugh (Dartmouth Medical School). Eles também gostaria de agradecer a classe Bowdoin de 2006 dos Cursos Anuais em Métodos de Investigação e Aplicações da citometria de fluxo, o que gerou os dados mostrados na Figura 2. Citometria de fluxo foi realizada em Citometria de Roswell Park Cancer Institute de Fluxo de Laboratório, que foi criada em parte por doações de equipamentos do Programa de Instrumento NIH Compartilhada, e recebe o apoio do Núcleo Grant (5 P30 CA016056-29) do NacionalInstituto do Câncer do Roswell Park Cancer Institute, e no Citometria de Fluxo Abramson Cancer Center e Laboratório Célula de Recursos Classificação da Universidade da Pensilvânia, que foi criada em parte por doações de equipamentos do Programa de Instrumento NIH Compartilhada, e recebe o apoio do NIH # 2P30 CA016520 do Instituto Nacional do Câncer. O trabalho mostrado nas Figuras 3 e 5 também foi apoiado em parte pela concessão SBIR EB00228 do National Institutes of Biomedical Imaging e Bioengenharia (NIBIB) atribuído à PTI Research, Inc.

1. Rotulagem de membrana geral com PKH26 Dye Rastreamento celular (Ref. 25; Figura 1) <ol><li> Use a técnica estéril para as etapas 1,1-1,9. Prepara ~ 10 7 células mononucleares de sangue periférico ou linfócitos (hPBMC, hPBL) e utilizando o método padrão do laboratório com a adição de uma centrifugação final 300 xg para minimizar a contaminação das plaquetas. Ressuspender as células em 10 7 / ml em HBSS + 1% BSA e colocar em gelo, reservando-se uma alíquota de 500 ul (5x10 6 células) para uso no Passo 2. </li><li> Coloque 5x10 6 células (500 ul) de uma 12 75 milímetros tubo cónico de polipropileno x. Lavar uma vez com 3,5 ml de HBSS. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante, deixando não mais do que 15-25 ul de fluido residual, mas tomando cuidado para não remover as células. Utilizar este tubo para preparar uma suspensão de células de 2 x no Passo 1.4. </li><li> Durante a lavagem das células no passo 1.2, adicionar 0,5 ml de diluente de veículo rotulagem C (a partir do kit PKH26GL) para um tubo de 12 75 milímetros x de polipropileno cónico. Utilize este tubo para prepsão uma solução PKH26 2x no Passo 1.5. </li><li> Adicionar 0,5 ml de veículo Diluente C rotulagem para o sedimento de células lavado a partir do Passo 1.2 e aspirar e dispensar 3-4 vezes para se obter uma suspensão de células individuais (2x células). Evitar a formação de bolhas e excesso de mistura, o que pode reduzir a viabilidade das células e recuperação. </li><li> Imediatamente após a preparação da suspensão de células de 2 x no Passo 1.4, preparar uma solução de (4 ^ M) 2x corante por adição de 2,0 ul de estoque de 1,0 mM PKH26 corante em etanol (a partir do kit PKH26GL) para o tubo de Diluente C preparado na Fase 1.3 e vortex para dispersar uniformemente. </li><li> Imediatamente após a preparação da solução de corante em 2x Passo 1.5, rapidamente pipetar a suspensão de células a partir do Passo 2 x 1,4 na solução de corante 2x e simultaneamente aspirar e dispensar 3-4 vezes para dispersar completamente as células em corante Não:. Adicionar 1,0 mM corante directamente células; despejar as células 2x 2x em corante, ou adicionar células para 2x 2x corante enquanto vórtex. Devido a coloração é quase instantânea, tais métodos produzem menosintensidades uniformes do que o método recomendado (Figura 2). </li><li> Após 1 min, adicionar 1,0 ml de soro inactivado pelo calor ou HBSS BSA 5% para parar a absorção do corante nas membranas celulares. A não utilização de proteína suficiente arrisca-se a formação de agregados de corantes, que podem pelete com as células, durante os passos de lavagem e causar rotulagem não intencional de outras células presentes em uma experiência. Se o meio com 10% de soro inactivado de calor (CM) ou HBSS + 1% BSA é para ser usado como reagente de paragem, realizar a coloração de um tubo de polipropileno de 15 ml e adicionar, pelo menos, 5,0 ml de reagente de paragem para assegurar a adsorção de todos unincorporated corante. </li><li> Centrifugar as células marcadas por 5 min @ ~ 400 x g. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem remover células. Lava-se a pelete duas vezes com 4 ml de BSA ou HBSS CM +1%, dispersar o sedimento bem antes de nova centrifugação. Para minimizar o extravasamento de corante adsorvido nas paredes do tubo e maximizar a eficiência de lavagem, transferir as células para um tubo de polipropileno de fresco após o first ressuspensão. Nota: as células coradas adequadamente irá apresentar uma coloração distinta rosa no pellet. </li><li> Ressuspender o sedimento de células lavado em 1,0 ml de BSA% HBSS 1. Contar as células, determinar a recuperação de células, e ajustar o volume para dar uma concentração final de 10 7 / ml. Com aspiração cuidadosa, a recuperação de células deve ser ≥ 85%. Se a recuperação de celular é &lt;70%, determinar a causa antes de prosseguir. Retirar uma alíquota de 150 ul (1.5x10 6 células) e colocar em gelo para uso no Passo 2. </li></ol> 2. Preparação de controles configuração do instrumento e Ensaio (Tabela 1) <ol><li> Alíquota de 50 ul (5x10 5) de células não coradas a partir da suspensão de células guardadas em Passo 1.1 em cada um de cinco tubos de 1,8 ml de Eppendorf: 1, 3, 4, 5, e 7. Alíquota de 50 ul (5x10 5) de células PKH26 pos do Passo 1,9 em cada um dos três tubos: 2, 6 e 8. </li><li> Adicionar 10 uL de IgG bloco (100 ug / tubo de IgG, ver tabela de reagentes) para tubos de 1-8e incubar durante 10 min à temperatura ambiente (20-25 ° C). </li><li> Adicionar uma quantidade saturante do anticorpo (s) indicado na Tabela 1 para tubos 4, 5, 7, e 8, e incubar todos os tubos de amostras (1-8) durante 30 min à temperatura ambiente e protegida da luz. </li><li> Adicionar 1,5 ml de HBSS BSA 1%, para todas as amostras, sedimentar as células por centrifugação (5 min a 400 xg) e lava-se uma vez com 1,5 ml de HBSS + 1% de BSA, com aspiração cuidadosa para evitar a perda de células. </li><li> Ressuspender a cada amostra em 500 uL de HBSS BSA 1%. Se necessário para amostras a serem analisadas em seu citómetro, transferir para um tubo de 12 mm x 75 fundo redondo. Adicionar 10 ul de 100 ug / ml 7-AAD diária estoque de trabalho (ver tabela de reagentes) para tubos de 3, 6, 7 e 8, como indicado na Tabela 1. Incubar em gelo durante 30 min, antes da utilização na instalação de citometria de fluxo e verificação de coloração (Passo 3). </li></ol> 3. Instalação de citometria de fluxo e verificação de coloração <ol><li> Verifique se o fluxo cytomeTer está funcionando adequadamente, utilizando procedimentos estabelecidos pelo laboratório de controle de qualidade diário. Verificar que os sinais podem ser facilmente detectado em cada janela espectral a ser usado, e que as respostas do detector são linearmente proporcional à intensidade de sinal na janela a ser usada para a monitorização da proliferação 14. </li><li> Adquirir FSC vs SSC dados para Tubo 1 usando escalas de exibição lineares. Ajustar a amplificação de cada detector de tal forma que a população de linfócitos cai no quadrante inferior esquerdo do gráfico de pontos, não está fora de escala, em qualquer um dos parâmetros, e não é interrompido por thresholding. Coletar dados ungated FSC vs SSC para todas as amostras em Passos 3,3-3,7. </li><li> Aquisição de dados para Tubo 1, utilizando nenhuma compensação de cor e escalas logarítmicas de exibição para todos os quatro detectores de fluorescência. Ajuste de alta tensão de cada detector (HV) para colocar a autofluorescência de linfócitos não coradas em escala com poucos / sem células acumulando no primeiro canal. Definir um limite de análise para cada histogramacorrespondente a mais brilhante de 2% das células não coradas. </li><li> Usando nenhuma compensação de cor e as configurações de alta tensão estabelecido em Passos 3.2 e 3.3, a aquisição de dados para Tubo 2, coletando FSC, SSC e sinais em todos os quatro detectores de fluorescência. Para o detector usado para monitorizar a fluorescência PKH26, verificar se todas as células PKH26 pos aparecem na escala como um único pico simétrico na 3 ª década rd -4, com poucas células em / no último canal. Se houver múltiplos picos ou forma do pico é enviesada, repetir o passo 1, com especial atenção para o sal de minimização e técnica de mistura (Figura 2). Se necessário, ajustar a concentração de corante. </li><li> Usando as configurações estabelecidas no Passo 3.3, adquirir dados para Tubo 3, coletando FSC, SSC e sinais em todas as quatro detectores de fluorescência. Para o detector usado para monitorizar a fluorescência 7-AAD, verificar que as células-7-AAD pos cair acima do limite de 2% estabelecido no Passo 3.3 (ou seja, que as células não viáveis ​​são bem resolvidosa partir de células viáveis ​​7-AAD neg). </li><li> Usando as configurações estabelecidas no Passo 3.3, adquirir dados para Tubo 4, coletando FSC, SSC e sinais em todas as quatro detectores de fluorescência. Verificar se as células CD8 pos são bem resolvido a partir de células não coradas (isto é, acima do limite de queda de 2% estabelecido no passo 3.3 para o detector de FITC). Repetir com o tubo 5 e verificar que as células CD8 pos são bem resolvido a partir de células não coradas (ie queda acima do limite de 2% estabelecido no passo 3.3 para o detector APC). </li><li> Configurações usando estabelecidas no Passo 3.3, adquirir dados para Tubos 6, 7 e 8, a coleta FSC, SSC e sinais em todos os quatro detectores de fluorescência. </li><li> Use os arquivos de lista de modo coletados para Tubos 1-5 e seu software de compensação de cor para estabelecer uma cor sobrepõem matriz para cada fluorocromo nos detectores sendo usados ​​para monitorar os três fluorocromos outros. Aplicar esta matriz para o arquivo modo de lista por Amostra 6 e verificar que a presença de PKH26 laboratórioEling não altera a capacidade de detectar 7-AAD células pos. </li><li> Aplicar a cor sobrepõem matriz do Passo 3.8 para o modo de lista de arquivo para a amostra 7 e verificar se: a) três subpopulações bem resolvidos (CD3 CD4 neg neg pos, CD3 CD4 neg pos e CD3 CD4 pos) podem ser identificados com um FITC versus APC gráfico de pontos, e b) a presença de anti-CD3-FITC e anti-CD4-APC não altera a capacidade de detectar a 7-AAD células pos. Se a presença de anti-CD3-FITC altera o limite superior de 2% para os dados recolhidos no detector de PKH26, reajustar o limite, conforme necessário. </li><li> Aplique a cor matriz sobreposição de Passo 3,8 para o arquivo modo de lista para a amostra 8. Se a presença de PKH26 rotulagem altera o limite de 2% para a FITC, 7-AAD ou detectores APC dos estabelecidos utilizando o controlo autofluorescência na etapa 3.3, reajustar o limite (s), se necessário utilizando tubo 7 da Tabela 1, e verificar se ele ainda é possível distinguish CD3 CD4 pos pos, pos CD3 CD4 neg, e CD3 CD4 células neg neg usando o limite ajustado (s). </li></ol> 4. Seleção proliferação Modelo de Monitoramento Divisão celular por diluição de corante <ol><li> Determinar o espaçamento entre as gerações, que é dependente do número de canais e décadas logarítmicas no citómetro. Para instrumentos digitais, esse valor, tipicamente de 4 ou 5 décadas, é determinada pelo número de recipientes em que o processador de sinal digital. Em instrumentos analógicos, onde o número de décadas raramente é um número inteiro, modelagem precisa requer o número preciso de décadas de ser experimentalmente determinados. Para fazer isto, os dados a partir de uma mistura de grânulos calibrados fluorescentes com fabricantes-atribuídos intensidades relativas são obtidas nas mesmas configurações de detectores de alta tensão usados ​​na experiência. A posição dos picos do grânulo permite a calibração da escala logarítmica em termos de intfaixa ensity por década log. Especificamente, isto é feito através da representação gráfica do número de canal para cada tipo de grânulo contra o log do fabricante valor atribuído. A inclinação de uma linha de melhor ajuste linear para os valores de dados do grânulo dá o número de unidades de intensidade relativa por canal. Multiplicado pelo número de canais, tal valor será então o número de log de ​​décadas para a escala total, a partir do qual o número de canais que correspondem a uma diminuição de duas vezes na intensidade (isto é, o espaçamento entre a geração filha) pode ser calculado 14. </li><li> Decidir se deseja usar um espaçamento fixo entre as gerações ou para permitir o espaçamento entre a flutuar. Uma configuração (fixo) Standard usará o valor do espaçamento geracional determinado no passo 4.5 a atribuir a localização de cada geração, e é geralmente usado quando o histograma não tem picos distintos. A configuração permite que cada posição do flutuador pico de gerações a ser determinada pela forma do histograma e é normalmente utilizado quando distinguishablpicos de e geracionais são evidentes. </li><li> Decida se usar uma largura de pico fixo para todas as gerações ou uma largura flutuante. A largura fixa utiliza o SD calculada para a amostra de controlo não estimulado para modelar todas as gerações e é tipicamente escolhida quando a amostra não tem picos distinguíveis gerações. A largura flutuante permite que o programa de forma independente variar a DP para cada geração e é melhor usado com picos distintos de gerações. </li><li> Executar um programa que contém um módulo de análise de proliferação (aqui ModFit versão LT 3.3). Carregar o ficheiro estimulada PKH26 pos do conjunto de dados a ser analisada (por exemplo, uma cultura estimulada hr 96 de PKH26 células pos contracorados como para tubo 8 na Tabela 1). </li><li> Seleccionar os parâmetros para análise, neste caso, PKH26 (585/42) fechada sobre viável (7-AAD neg) linfócitos CD3 pos e FSC vs SSC a excluir detritos pequenos e grandes agregados (Figura 3). Na definiçãoestas regiões o cuidado de incluir a área de dispersão de alta frente, onde explosões são normalmente encontrados e note que CD3 expressão pode ser modulada para baixo em culturas estimuladas. </li><li> Criar um modelo de proliferação nova usando o Assistente Proliferação. Usando o arquivo de dados aberto (guia Iniciar), carregar o arquivo de controle não estimulado PKH26 pos e definir a localização do canal de pico na distribuição dos pais corresponde a células não divididas. </li><li> Analisar o arquivo para o controle não estimulado pos PKH26, observando os valores de posição de pico dos pais e largura (desvio padrão). Se uma largura de pico fixo (SD) é desejado, verifique Bloqueio SD. </li><li> Carregar o PKH26 neg controle (por exemplo, uma cultura de 96 horas de células PKH26 neg contracorados como para tubo 7 na Tabela 1). Ajuste o número de gerações, definindo o canal de pico para a geração de mais obtuso acima do neg PKH26 controle. Isso determina a number de gerações filha da modelo com precisão se encaixam e é tipicamente 6-9 gerações. </li><li> Abra o ficheiro de dados para a amostra estimulada (por exemplo, uma cultura estimulada hr 96 de PKH26 células pos contracorados como para tubo 8 na Tabela 1) e confirmam que as regiões para a posição de pico parental e o SD como definido no Passo 4,7 permanecem inalteradas. Se o espaçamento fixo de gerações é desejada, selecione a opção do modelo padrão, caso contrário, selecione a opção flutuante. </li><li> Analisar cada ficheiro experimental no conjunto de dados, utilizando o mesmo modelo definido no passo 4.9. Pequenos ajustes para a posição de pico parental pode ser necessário para o ajuste melhor, tal como definido no plano visual e pelo reduzido valor de qui-quadrado (RCS). </li><li> Gravar as métricas de proliferação desejadas resultantes do melhor ajuste para cada arquivo experimental no conjunto de dados. Para uma descrição abrangente de métricas possíveis ver ref. 22. </li></ol>

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</ol>

K. Humphrey, JD Tario, Jr. e PK Wallace recebeu reagentes pré-comerciais de células de monitoramento para avaliação da Life Technologies, Inc. e Biociências BD. AD Bantly e JS Moore receberam pré-comercial de células de rastreamento reagentes para avaliação da Life Technologies, Inc. e financiamento do PTI Research, Inc. para a pré-comercial caracterização de células CellVue vários rastreamento corantes. K. Muirhead é empregado por SciGro, Inc., que fornece serviços de consultoria para Phanos Technologies, Inc. (proprietário da PKH e corantes CellVue) e oferece suporte técnico de backup para Inc., Sigma-Aldrich e Molecular tecnologias de direcionamento (distribuidores desses corantes). Produção e livre acesso a este artigo é patrocinado pela Sigma-Aldrich.

Os métodos descritos aqui são aqueles encontrados em nossos laboratórios combinados a mais confiável dar ótimos resultados para a rotulagem hPBMC usando corantes membrana 13,16,18 e para fenotipagem subconjunto de linfócitos e proliferação de rastreamento usando membrana ou corantes proteína 2,11,13,16, 18. Como ilustrado nas Figuras 1 e 2, a rotulagem uniforme brilhante é mais prontamente conseguido através da limitação da presença de sais fisiológicos e usando uma técnica de mistura que resulta na exposição rápida e homogénea de todas as células para a mesma concentração de corante. Por causa da coloração com corantes de membrana ocorre por divisão na bicamada lipídica, outras variáveis ​​que alteram a concentração de corante livre pode também ter impacto eficiência de marcação. Por exemplo, na etiquetagem de fundo redondo tubos de poliestireno resultados na lavagem menos eficiente de sais antes da ressuspensão em C Diluente e também da concentração de corante livre reduzida devido a tingir adsorção nas paredes do tubo, particularmentenas menores concentrações de corante. Ambos os factores tendem a dar mais amplas distribuições de coloração do que quando se faz a rotulagem utilizando tubos de polipropileno de fundo cónico (Figuras 3, 4 e resultados não publicados). Idade da amostra e tipo também pode afetar largura do pico, mesmo quando procedimentos de coloração otimizado são usados. Por exemplo, para os CV PKH26 pos linfócitos isolados a partir de sangue recentemente extraído gama 14-20% (Figura 3, Ref. 13 e resultados não publicados), enquanto que para os CV linfócitos isolados a partir de amostras de sangue 24 h de idade ou TRIMA pheresis gama filtros 25-30 % (Figura 4 e Ref. 18). Coloração uniformidade e a extensão em que as células não viáveis ​​podem ser excluídos da análise tanto afetar se picos filhas diferenciáveis ​​são evidentes no perfil de diluição de corante, que por sua vez afecta a escolha de um modelo de proliferação para ajustar os dados observados (Figuras 5 e 6 </strong&gt;). Embora ModFit (Verity Software House, Topsham, ME) é usado aqui como um exemplo de software usado para gerar métricas como índice de proliferação e Freqüência Precursor (Figuras 3, 5 e 6, Tabela 3), outros pacotes de software também contém os módulos para analisar dados de proliferação. Estes incluem FCSExpress (De Novo Software, Los Angeles, CA) e FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR). Todos esses programas usar um pelo não-linear análise quadrados para iterativamente encontrar o melhor ajuste para os dados brutos, alterando a posição, altura e SD (ou largura) de picos gaussianos representando gerações filha seqüenciais. Índice proliferativa (PI) e Freqüência Precursor (PF) são as medidas mais usadas de extensão da proliferação. PI, tal como definido pela ModFit, é uma medida do aumento no número de células durante o curso do ensaio, análogo ao &quot;índice de estimulação&quot; de um ensaio de incorporação de timidina. PF retorna a fracção de células na populat inicialíon que responderam ao estímulo de proliferação. Aconselha-se precaução, no entanto, ao ler a literatura desde a terminologia varia um pouco entre os pacotes de software (por exemplo, FlowJo e ModFit usam diferentes definições e cálculos para o que se entende por &quot;proliferação do Índice&quot;) 22. As questões críticas discutidas aqui para rotulagem e análise de proliferação de membrana com corantes também são encontradas ao utilizar corantes proteína. Por exemplo, uma atenção cuidadosa à técnica de mistura devem também ser observado, junto com a exclusão de células mortas / a morrer, a fim de se obter distribuições uniformes e picos filhas diferenciáveis ​​pelo uso CFSE (Figura 6) 2-4,13,18,24. Escolha adequada de fluorocromos para fenotipagem e avaliação de viabilidade também é importante para evitar o excesso de sobreposição espectral e incapacidade de reconhecer as células de anticorpos positivos, principalmente com corantes emissores visíveis de proteína, como CFSE 2-4,11,13,16,18 </sup&gt;. Reduzir a concentração de corante de rastreamento diminui os problemas de compensação, em canais adjacentes espectrais, mas também limita o número de divisões celulares, que podem ser monitorizados antes de intensidades de células filhas começam a sobrepor-se com autofluorescência. Em alternativa, a utilização de corantes de rastreamento de células novas, tais como o vermelho longínquo Claret emissor CellVue (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ou emissor de violeta CellTrace Violet (Life Technologies, Grand Island, NY) pode reduzir os problemas de compensação (Figura 6). Finalmente, apesar de os corantes de membrana em geral, tendem a apresentar menor toxicidade 11,26, é possível ao longo do rótulo células com uma ou outra classe de corante. Por conseguinte, é sempre necessário verificar que a concentração de corante de rastreio utilizado não alterou a funcionalidade das células a serem rastreadas (Figura 6) 3,13,16,18.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente ou equipamento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Comercialmente Comprada </td></tr><tr><td> 7-D Aminoactinomycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9400 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> De soro fetal bovino (FBS) </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> Solução salina equilibrada de Hanks (HBSS) </td><td> Life Technologies </td><td> 14175-079 </td><td> Cálcio e magnésio livre, sem vermelho de fenol </td></tr><tr><td> IgG humana fracção Cohn II e III, as globulinas </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-4386 </td><td></td></tr><tr><td> De ratinho anti-humano CD3-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td><td> Concentração de saturação, conforme determinado por titulação de laboratório </td></tr><tr><td> De rato anti-CD4 humano-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340672 </td><td> Concentração de saturação, conforme determinado por titulação de laboratório </td></tr><tr><td> De rato anti-CD4 humano-PECy7 </td><td> BD Biosciences </td><td> 348799 </td><td> Concentração de saturação, conforme determinado por titulação de laboratório </td></tr><tr><td> De ratinho anti-humano CD8-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 347313 </td><td> Concentração de saturação, conforme determinado por titulação de laboratório </td></tr><tr><td> De ratinho anti-humano CD8-APC </td><td> Caltag (Life Technologies) </td><td> MHCD0805 </td><td> Concentração de saturação, conforme determinado por titulação de laboratório </td></tr><tr><td> De ratinho anti-humano CD19-APC </td><td> Caltag (Life Technologies) </td><td> MHCD1905 </td><td&gt; concentração saturante, tal como determinado por titulação de laboratório </td></tr><tr><td> De ratinho anti-humano CD25-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340938 </td><td> Concentração de saturação, conforme determinado por titulação de laboratório </td></tr><tr><td> De ratinho anti-humano CD127-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 557938 </td><td> Concentração de saturação, conforme determinado por titulação de laboratório </td></tr><tr><td> CD3 de ratinho anti-humano </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0037-85 </td><td> 1,0 mg / ml; azida livre </td></tr><tr><td> CD28 de rato anti-humano </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0289-85 </td><td> 1,0 mg / ml; azida livre </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 21300-058 </td><td></td></tr><tr><td> PKH26 kit linker vermelho fluorescente de células que contém 10-3M PKH26 em EtOH e Diluente C </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> PKH26GL-1KT ou MINI26-1KT </td><td> Procedimentos da Etapa 1 também se aplicama kits contendo PKH67 ou corantes CellVue outros </td></tr><tr><td> CellVue Claret vermelho longínquo kit linker fluorescente de células que contém 10-3M Claret CellVue em EtOH e C Diluente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MINCLARET 1KT ou MIDCLARET-1KT </td><td></td></tr><tr><td> 5 - (e-6)-diacetato de carboxifluoresceína, éster de succinimidilo (CFDA-SE) </td><td> Invitrogen (Life Technologies) </td><td> C34554 </td><td> Não fluorescente, clivados por esterases de membrana para formar amino-reactivo fluorescente carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) </td></tr><tr><td> VIVO / MORTO Violeta fixável </td><td> Invitrogen (Life Technologies) </td><td> L34955 </td><td></td></tr><tr><td> Estéril 12 x 75 mm cônico tubos de polipropileno e bonés </td><td> VWR </td><td> 60818-102 </td><td> Dá uma melhor eficiência membrana coloração corante (corante reduzido adsorção; menos perda de células durante a aspiração sobrenadante) </td></tr><tr><td> 12 x 75 mm rounfundo d tubos de poliestireno </td><td> Becton Dickinson </td><td> 21008-936 </td><td></td></tr><tr><td> Citómetro </td><td> BD Bioscience </td><td> FACSCalibur LSRFortessa </td><td> Qualquer citómetro capaz de detectar FITC, PKH26, e 7-AAD (ex. 488 nm,. In nm 520, 567 nm, e 655 nm, respectivamente) e APC ex. 633-640 nm; eles. 660 nm) </td></tr><tr><td> Citómetro </td><td> Beckman Coulter </td><td> LSRII Ciano </td><td> Qualquer citómetro capaz de detectar FITC, PKH26, e 7-AAD (ex. 488 nm,. In nm 520, 567 nm, e 655 nm, respectivamente) e APC ex. 633-640 nm; eles. 660 nm) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Laboratório Preparado </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D, estoque concentrado </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 1 mg / ml em PBS. Congelar em alíquotas e armazenar a -20 ° C. </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D, worrei estoque </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 100 ug / ml em PBS; preparar diária de 1 estoque mg / ml congelado. </td></tr><tr><td> IgG bloco </td><td> NA </td><td> NA </td><td> HBSS + 10 mg / ml de IgG humana fracção Cohn II e III, as globulinas + 10 mg / ml de BSA. </td></tr></tbody></table>

optimizado coloração e proliferação métodos de modelagem para monitoramento divisão celular usando corantes rastreamento celulares

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Corantes de rastreamento de células fluorescentes, em combinação com a citometria de fluxo e de imagem, são poderosos instrumentos com os quais estudar as interacções e destinos de diferentes tipos de células, in vitro e in vivo. 1-5 Embora existem literalmente centenas de publicações usando tais corantes, alguns dos as aplicações de localização mais comumente encontrados celulares incluem a monitorização de: <ol><li> caule e quiescência das células progenitoras, proliferação e / ou diferenciação 6-8 </li><li> antígeno-driven transferência membrana 9 e / ou a proliferação de precursores de células e 3,4,10-18 </li><li> função das células imunes regulamentar e efetor 1,18-21. </li></ol> Corantes de rastreamento de células disponíveis comercialmente variam muito nas suas propriedades químicas e de fluorescência, mas a grande maioria da queda em uma de duas classes com base no seu mecanismo de marcação celular. &quot;Corantes de membrana&quot;, caracterizado por PKH26, são corantes altamente lipofílicos tpartição de chapéu de modo estável, mas de forma não covalente em membranas celulares 1,2,11. &quot;Proteína corantes&quot;, que se caracteriza por CFSE, são amino-corantes reactivos que formam ligações covalentes estáveis ​​com proteínas celulares 4,16,18. Cada classe tem suas próprias vantagens e limitações. A chave para seu uso bem sucedido, especialmente em estudos multicolor onde diversas tinturas e são usados ​​para controlar diferentes tipos de células, é, portanto, de entender as questões críticas permitindo o uso ideal de cada classe 2-4,16,18,24. Os protocolos incluídos aqui destacar três causas mais comuns de maus resultados ou variável ao usar celular de rastreamento de corantes. Estes são os seguintes: <ol><li> A falha em conseguir brilhante, rotulagem, uniforme reprodutível. Este é um ponto de partida necessário para qualquer estudo de rastreamento de celular, mas requer atenção a diferentes variáveis ​​ao utilizar corantes membrana que ao utilizar corantes ou reagentes de proteína de ligação de equilíbrio, tais como anticorpos. </li><li> Subótimas combinações fluorocromo umnd / ou falha para incluir controles de compensação críticas. Acompanhamento de fluorescência do corante é tipicamente 10 fevereiro - 10 março vezes mais brilhante que a fluorescência dos anticorpos. Por conseguinte, é essencial a fim de verificar que a presença de corante de rastreio não comprometa a capacidade de detectar outras sondas sendo usados. </li><li> A não obtenção de um bom ajuste com o software de modelagem de pico. Esse tipo de software permite a comparação quantitativa de respostas proliferativas em diferentes populações ou estímulos baseados na frequência precursor ou outras métricas. A obtenção de um bom ajuste, no entanto, requer a exclusão de morto / morrendo células que podem distorcer os perfis de diluição de corante e congruência dos pressupostos subjacentes ao modelo com características do perfil observado corante diluição. </li></ol> Os exemplos apresentados aqui ilustram como estas variáveis ​​podem afectar os resultados quando se utiliza membrana e / ou de corantes proteicos para monitorizar a proliferação das células.

O sucesso no uso de corantes de rastreamento celulares para monitorar a função de células imunes e proliferação envolve várias etapas críticas. Descrevemos métodos para: 1) a obtenção de brilhante, uniforme, reprodutível etiqueta ing com corantes de membrana, 2) selecção de fluorocromos e condições de aquisição de dados, e 3) a escolha de um modelo para quantificar a proliferação de células com base na diluição de corante.

Optimizado coloração e Proliferação Métodos de Modelagem para Monitoramento Divisão Celular usando Corantes Rastreamento celulares

Corantes fluorescentes de rastreamento celular, em combinação com a citometria de fluxo e de imagem, são ferramentas poderosas para estudar as interações e os destinos de...

O objetivo geral deste método é utilizar corantes de rastreamento celular para quantificar diretamente o grau de divisão celular em diferentes subpopulações de células imunes dentro de populações complexas. Isso é alcançado primeiramente marcando a população parental de células com um corante fluorescente conhecido por promover ligação estável a proteínas celulares ou por intercalar de forma não covalente nas membranas celulares, para rastrear células marcadas com corante que respondem à estimulação. Após contagem, as células são coradas com anticorpos fluorescentes e analisadas por citometria de fluxo multiparamétrica, permitindo a detecção de respostas diferenciais entre os tipos celulares imunes de interesse estimulados. Controles não marcados com corante de rastreamento são utilizados para estabelecer a menor intensidade de fluorescência em células-filhas que pode ser distinguida da autofluorescência. Controles marcados com corante de rastreamento, mas não estimulados, são então usados para definir a intensidade de fluorescência na qual as células não divididas serão detectadas. A estimulação geralmente resulta em uma ampla faixa de intensidades, já que as células que se proliferam em resposta tornam-se progressivamente mais fracas em fluorescência, ao passo que as células não respondedoras não apresentam essa alteração.Por fim, o uso de software de modelagem de picos para estimar a frequência relativa de células em diferentes gerações pode permitir a comparação quantitativa das respostas proliferativas entre diferentes populações ou estímulos, utilizando métricas como índice de proliferação ou frequência de precursoras. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como incorporação de timidina tritiada ou expressão de KI 67, é que a diluição do DI fornece uma medida direta da divisão celular que pode ser combinada com outras análises citométricas por fluxo, como imunofenotipagem e produção de citocinas. A demonstração visual do método de coloração com corante de membrana é útil, pois a captação do corante pelas células é extremamente rápida.Consequentemente, uma boa técnica é fundamental para obter uma coloração brilhante e homogênea. Após o isolamento de células mononucleares do sangue periférico humano, centrifugue por cinco minutos a 300 × g e temperatura ambiente para minimizar a contaminação por plaquetas. Em seguida, ressuspenda o pellet em 10⁷ células por mililitro em HBSS acrescido de 1% de BSA e coloque no gelo.Remova e reserve 500 microlitros de Eloqua, em seguida transfira outro alíquota de 500 microlitros de células para um tubo cônico de polipropileno de 12 por 75 milímetros. Adicione 3,5 mililitros de HBSS e centrifugue as células por cinco minutos a 400 × g e temperatura ambiente. Durante a lavagem, adicione 0,5 mililitros do veículo de diluição C para marcação do kit PKH26 GL a outro tubo cônico de polipropileno de 12 por 75 milímetros. Aspire cuidadosamente o sobrenadante, deixando não mais que 15 a 25 microlitros de fluido residual e tomando cuidado para não remover nenhuma célula. Em seguida, adicione 0,5 mililitros do veículo de diluição C para marcação ao pellet celular e aspire e dispense a solução várias vezes para obter uma suspensão de células simples.Agora, prepare o estoque de dois XD adicionando dois microlitros de PKH 26 ao tubo contendo o diluente C. Imediatamente após, pipete a suspensão celular para dentro da solução recém-preparada de corante dois XPKH 26 e simultaneamente aspire e dispense a mistura várias vezes para dispersar uniformemente as células por todo o corante. Após um minuto, adicione um mililitro de soro inativado pelo calor para interromper a captação do corante pelas membranas celulares. Após centrifugar as células, aspire cuidadosamente o sobrenadante sem remover o pellet.Em seguida, ressuspenda o pellet em quatro mililitros de meio completo contendo 10% de soro inativado pelo calor e transfira a suspensão celular para um novo tubo de polipropileno. Lave as células duas vezes em HBSS acrescido de 1% de BSA; células adequadamente coradas exibirão uma tonalidade rosa distinta no pellet. Após ressuspender o pellet celular em um mililitro de HBSS com 1% de BSA, conte as células e, então, ajuste o volume para obter uma concentração final de 10 elevado à sétima células por mililitro. Após corar as células de acordo com o protocolo de citometria de fluxo descrito na tabela, utilize os cinco primeiros tubos para ajustar os parâmetros de dispersão anterior e dispersão lateral, bem como os sinais nos quatro detectores de fluorescência.Em especial para o detector usado para monitorar a fluorescência do PKH 26 no tubo dois. Verifique se todas as células marcadas com PKH 26 aparecem na escala como um único pico simétrico na terceira ou quarta década, com poucas ou nenhuma célula no último canal. Em seguida, utilize o software de compensação de cor e os arquivos em modo de lista coletados dos tubos um a cinco para estabelecer uma matriz de sobreposição de cores para cada fluoróforo nos detectores utilizados para monitorar os outros três fluorocromos.Em seguida, aplique esta matriz ao arquivo em modo de lista da amostra seis. Para verificar se a presença da marcação com PKH26 altera a capacidade de detectar células positivas para sete A a D. Agora, aplique esta matriz de sobreposição de cores recém-estabelecida ao arquivo em modo de lista do tubo sete.Identifique as populações CD três positivo CD quatro negativo e CD três positivo CD quatro positivo em um gráfico de FE versus PC. Confirme que a presença de anti-CD três, FE e anti-CD quatro A PC não altera a capacidade de detectar células positivas para sete A a D. Por fim, aplique a matriz de sobreposição de cores do tubo sete ao arquivo em modo de lista do tubo oito.Agora, abra um programa que contenha um módulo de análise de proliferação. Carregue o arquivo marcado com PKH26 estimulado do conjunto de dados a ser analisado. Em seguida, selecione os parâmetros para análise, neste caso, PKH26 com porta definida em células viáveis, negativas para sete a a d, positivas para cd3 e análise de dispersão para frente versus dispersão lateral para exclusão de detritos pequenos e agregados grandes.Ao definir essas regiões, tenha cuidado para incluir a área de dispersão para frente alta onde os blastos são normalmente encontrados. Em seguida, abra o assistente de proliferação. Clique na guia inicial para abrir o arquivo de dados e depois carregue o controle positivo não estimulado com PKH 26.Defina a localização do pico parental correspondente às células não divididas. Analise o arquivo observando os valores de posição e largura do pico parental. Se uma largura de pico fixa for desejada, marque o bloqueio do DP, carregue o controle negativo P KH 26 e ajuste o número de gerações definindo o canal do pico para a geração de células filhas dimus acima das células negativas para PKH 26.Isso define o número de gerações filhas. O modelo pode ajustar com precisão quando concluído. Recarregue o arquivo positivo para PKH 26 estimulado.Se picos geracionais distinguíveis forem evidentes, escolha a configuração flutuante na opção de modelo. Se as décadas logarítmicas não forem exatamente 4,0, ajuste o espaçamento geracional conforme discutido no artigo. Agora, analise a amostra estimulada e confirme que a região para a posição do pico parental permanece inalterada.Por fim, selecione analisar para cada arquivo experimental no conjunto de dados a ser aplicado. O modelo recém-criado registra as métricas de proliferação desejadas resultantes do melhor ajuste para cada arquivo experimental no conjunto de dados. Esta primeira série de dados ilustra o efeito da técnica de mistura nas distribuições de fluorescência de PKH 26.Quando cultivadas, as células mieloides U 9 37 foram coradas com o corante de rastreamento celular utilizando o método recém-descrito; este primeiro histograma mostra os dados do controle não corado. Os parâmetros do citômetro foram ajustados para posicionar a autofluorescência dessas células na primeira década, com nenhuma ou muito poucas células acumuladas no primeiro canal. Este segundo histograma ilustra uma boa coloração com PKH 26.A mistura rápida de duas x células com dois x corante resultou em uma distribuição de fluorescência brilhante, homogênea e simétrica, mas sem células fora da escala nas configurações do instrumento utilizadas para o histograma anterior. Quando duas x células foram adicionadas a dois x corante sem mistura imediata, obteve-se uma distribuição de fluorescência mais heterogênea. Essa pequena subpopulação de células fracamente marcadas seria erroneamente interpretada como células filhas se estivesse presente em um ponto temporal posterior no histograma final deste experimento. A má mistura também ocorreu quando três microlitros de estoque concentrado de corante em etanol foram acidentalmente adicionados diretamente a 0,5 mililitros de suspensão de duas x células, resultando em uma distribuição de intensidade de fluorescência extremamente fraca e com assimetria para a direita.Aqui são apresentados resultados típicos de um experimento de proliferação no qual células mononucleares do sangue periférico humano marcadas com PKH 20 foram cultivadas com ou sem agentes estimulatórios. São mostrados os reagentes anti-CD3 e IL-2. Após 96 horas de cultivo, as células foram colhidas e coradas com anti-CD3, FE anti-CD19 APC e 7AAD.Duas estratégias de seleção diferentes foram comparadas. Na primeira estratégia, um gráfico de dispersão de CD três versus sete A A D foi utilizado para selecionar células T viáveis, negativas para sete A A D e positivas para CD três. Em seguida, uma região de dispersão direta e lateral foi usada para excluir grandes agregados, mantendo ainda as linfócitos em blástula.Os eventos com portão em R um mais R dois para o controle não corado são representados pelo histograma cinza, e as células coradas com PKH 26, mas não estimuladas, estão em azul. Observe a coloração brilhante, simétrica e homogênea para linfócitos T viáveis, porém não divididos, no controle não estimulado. Esses dados foram submetidos a portão da mesma maneira que na figura anterior, mas, neste caso, as células foram estimuladas com anti-CD três e IL dois. O histograma de PKH 26 para eventos com portão em R um mais R dois agora contém principalmente células divididas, com intensidade reduzida, representada por picos coloridos para cada geração de células-filhas.Embora algumas células brilhantes não divididas ainda permaneçam no pico parental azul. Observe que a intensidade das células altamente divididas ainda não se sobrepõe à região onde são medidas as células não coradas, o que poderia confundir a estimativa de métricas baseadas no número de células nas gerações filhas de menor intensidade aqui. Os mesmos dados foram analisados como nos dois conjuntos anteriores de figuras, mas apenas a dispersão da luz e o CD três foram utilizados para selecionar linfócitos T viáveis.Essa estratégia de seleção exclui muitas, mas não todas, as células mortas, conforme demonstrado pela pequena população residual de sete células mortas positivas para sete A a D que permanecem nos dot plots de CD três versus sete A a D. A escolha dos fluorocromos utilizados para imunofenotipagem pode criar problemas desafiadores de compensação ao usar corantes de rastreamento celular, já que a intensidade de coloração das células não divididas é extremamente elevada. Neste experimento, células mononucleares do sangue periférico com 24 horas de cultivo foram marcadas com PKH 26 e, em seguida, contra-coloridas com anticorpos contra CD três e CD quatro, além de um corante de viabilidade.Nesta série de dados, as células marcadas com PKH 26 a dois micromolares foram contra-coloridas com anti-CD3 FZ7A6D e anti-CD4 APC, e então analisadas utilizando a mesma estratégia de seleção R1 mais R2 usada anteriormente. Como há pouca sobreposição do PKH 26 no canal APC, os eventos CD4 positivos e negativos foram claramente resolvidos, independentemente de ter sido aplicada ou não a compensação. Esses dados ilustram como as células T viáveis CD3 positivas e CD4 positivas permaneceram bem resolvidas mesmo quando a concentração final de PKH 26 foi aumentada para quatro micromolares. O uso de anti-CD4 PerCP em combinação com anti-CD3 FE, PKH 26 a dois micromolares e o corante de viabilidade Pro3 resultou em desempenho muito inferior devido à sobreposição significativa do PKH 26 no canal PerCP.Células positivas e negativas para CD4 não puderam ser separadas umas das outras nos dados não compensados e foram apenas marginalmente resolvidas quando foi aplicada a compensação. Aumentar a concentração final de PKH26 para quatro micromolares resultou na perda completa da capacidade de separar eventos CD4 positivos de eventos CD4 negativos, mesmo após a aplicação da compensação. Observe como as amostras com ou sem anti-CD4 perCP foram essencialmente idênticas.Quando um perfil de diluição de corante é analisado usando software de modelagem de picos para estimar a frequência de células em gerações filhas sucessivas, as posições e/ou larguras dos picos filhos sucessivos podem ser fixas ou flutuantes, em relação aos valores do pico parental. Esses valores são estimados a partir do controle não estimulado.Por exemplo, este perfil de intensidade PKH26 é de uma cultura de 96 horas não estimulada de um respondente moderado e foi utilizado para fornecer ao assistente de ajuste de proliferação uma primeira estimativa de posição e largura para o pico que representa as células parentais não divididas. O uso de uma configuração fixa para a posição do pico exige que a média de cada pico geracional seja exatamente metade da intensidade de fluorescência do pico anterior. Uma configuração flutuante para a posição do pico permite que as posições finais dos picos geracionais variem em relação às intensidades esperadas, conforme necessário para obter o melhor ajuste.Da mesma forma, uma configuração fixa para a largura do pico exige que a largura de cada pico geracional seja igual à do pico controle parental ou não estimulado. Uma configuração flutuante para a largura do pico permite que as larguras finais sejam variadas independentemente conforme necessário para obter o melhor ajuste nesta tabela. Os resultados das análises das figuras anteriores para dois doadores diferentes são apresentados para esses doadores nos quais picos geracionais distinguíveis foram evidentes.Os melhores valores de qui quadrado reduzido foram obtidos quando tanto a posição do pico quanto a largura foram permitidas flutuar para perfis de proliferação onde picos geracionais distinguíveis não são evidentes; recomenda-se uma configuração fixa para a posição do pico. Esses dados ilustram o uso de dois corantes de rastreamento para monitorar separadamente as histórias de proliferação de diferentes tipos de células imunes em um ensaio de supressão imune por citometria de fluxo. As células T efetoras mostradas em verde foram marcadas com CFSE e as células T reguladoras mostradas em azul foram marcadas com cell view.Populações celulares marcadas com clarete foram misturadas em diferentes proporções e cultivadas na presença de anti-CD3, anti-CD28 e células acessórias irradiadas durante 96 horas. Posteriormente, as células foram coletadas e marcadas com anti-CD4, PE-Cy7 e violeta para discriminação de células mortas. Aqui, dados representativos para uma razão de Treg para células T efetoras de 0,25 para 1 são apresentados após o gateamento para exclusão de células positivas para violeta para discriminação de células mortas.Um filtro de dispersão da luz que incluía linfócitos e blastos, mas excluía agregados e detritos, foi aplicado, seguido por um filtro para incluir eventos CD4 positivos. A coloração com Cell View Claret permitiu distinguir facilmente as células Treg viáveis das células T efetoras viáveis, que estavam altamente proliferadas, e, portanto, os perfis de proliferação CFSE DIM para as células T efetoras CFSE positivas e as células Treg positivas para Cell View Claret foram analisados utilizando o software de modelagem de picos Mod Fit. Aproximadamente 25.000 eventos foram analisados.Destas, 48% eram linfócitos T efetores viáveis, 6% eram linfócitos T reguladores viáveis, sendo o restante células mortas, células acessórias e detritos. O índice de proliferação calculado, que reflete o aumento da quantidade de células durante o período do ensaio, foi de 3,85 para os linfócitos T efetores e de 1,83 para os Treg. Aqui, mostra-se o efeito da concentração de células Treg sobre o índice de proliferação das células T efetoras, calculado a partir do perfil de diluição do corante CFSE.Os resultados foram os mesmos, independentemente de as células Treg terem sido marcadas com o corante Cell View Claret ou terem sido deixadas não coradas, indicando que a função das Treg não foi alterada pela coloração. Com o rastreamento conforme esperado, o grau de proliferação das células T efetoras aumentou à medida que a concentração de células Treg foi reduzida. Os índices de proliferação das células Treg também foram calculados a partir dos perfis de diluição do corante Cell View Claret em diferentes proporções de Treg para T efetoras.Como esperado, as Tregs sofreram proliferação mínima na ausência de células T efetoras conforme a concentração de células T efetoras aumentou. No entanto, o grau de proliferação das células Treg também aumentou. Após assistir ao vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar com êxito corantes de rastreamento celular para monitorar a proliferação celular, como escolher fluorocromos e controles de compensação de cor apropriados, e como selecionar um modelo adequado para quantificar a divisão celular com base na diluição do corante.Juntamente com este procedimento, outros métodos podem ser realizados para responder perguntas experimentais, como a coloração de células T específicas para antígenos ou a triagem por fluxo para recuperação de células semelhantes a células-tronco que estão quiescentes ou se dividindo lentamente. Muito obrigado por assistir.

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Biology

Biologia

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