Atividades de monitoramento quinases e fosfatases através do ciclo celular por raciométrica FRET

Neste vídeo, as atividades de quinase e fosfatase são monitoradas ao longo do ciclo celular usando a transferência de energia de ressonância da Forrester ou traste. Aqui, uma sonda de atividade polo como quinase um ou LK um tem proteína fluorescente ciano CFP colocada em uma extremidade e proteína fluorescente amarela YFP colocada na outra. Esta sonda é transfectada em células U2 OS.

Em seguida, para examinar o status de fosforilação dos alvos LK um durante a transição G dois dois M, as células TRANSFECTADAS U2 OS são submetidas a imagens de fluorescência de lapso de tempo. Quando CFP e YFP estão próximos e CFP está excitado, a energia é transferida para YFP e a admissão de YFP pode ser detectada. No entanto, quando a sonda se torna fosforilada, uma mudança de confirmação na proteína separa CFP e YFP.

Agora, quando o CFP é excitado, uma forte emissão de CFP e apenas uma emissão fraca de YFP são detectadas quantificação da razão de emissão de YFP após a excitação de CFP e YFP demonstra que a atividade de PLK um aumenta em G dois e atinge o pico durante a mitose. Portanto, a principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a filmagem geométrica padrão, é que é dada atenção específica para que o ciclo celular não seja perturbado pelas condições de filmagem ou pela expressão de uma sonda. Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo do ciclo celular, como onde e quando quinases ou fosfatases específicas são ativadas.

Embora este método possa fornecer informações sobre enzimas reguladas pelo ciclo celular, ele também pode ser aplicado a outros sistemas onde são necessárias condições de unres, como ensaios de proliferação celular. Para monitorar o ciclo celular humano, as células U2 OS são transfectadas com uma sonda de atividade PK uma baseada em traste. Usando um método padrão de transfecção de fosfato de cálcio, as células são selecionadas em purmicina por pelo menos sete dias.

Isso enriquece a população de células que expressam a sonda e limita o número de células com níveis de expressão tóxicos ou níveis de expressão que afetam gravemente o ciclo celular. Os clones estáveis são então selecionados pela expressão de diluição limitada de CFP e YFP é então examinado para verificar se eles estão presentes em todas as células aproximadamente na mesma proporção. Se algumas células contiverem apenas CFP ou YFP, a recombinação provavelmente ocorreu neste caso, repita a preparação do plasmídeo usando bactérias menos propensas à recombinação homóloga, como duas células, linearize o plasmídeo e repita a transfecção.

Uma vez que as células expressem a sonda de forma estável, semeie-as em pratos com fundo de vidro número 1,5 depois de terem se fixado e sejam 30 a 50% confluentes. Mude o meio para um que seja independente de CO2 e não contenha vermelho de fenol, monte as células em um microscópio de epifluorescência motorizado Com controle de temperatura ajustado para 37 graus centígrados. O microscópio deve ser equipado com filtros de excitação e emissão CFP e YFP.

Um espelho ROIC adequado para monitorar CFP e YFP e uma objetiva adequada para a resolução necessária. Aqui, uma objetiva aérea de 20 x NA 0,75 é usada. Usando luz transmitida, coloque as células em foco.

Não use luz fluorescente neste ponto, pois ela induzirá uma resposta ao estresse que pode perturbar o ciclo celular. Para evitar fototoxicidade, ajuste a curvatura para o máximo disponível que permita a resolução subcelular necessária. Para este experimento, deve ser possível distinguir o núcleo e o citoplasma.

Defina um tempo de exposição curto e insira um filtro de alta densidade neutra. Em seguida, adquira uma imagem de teste de 12 ou 16 bits Usando excitação e emissão YFP, ajuste o tempo de exposição e os filtros de densidade neutra para que a intensidade média em uma célula seja aproximadamente igual à intensidade de fundo mais cinco vezes a diferença entre as intensidades de fundo mínima e máxima. Para verificar se as imagens não estão saturadas, examine a intensidade de fluorescência da imagem de amostra.

A intensidade máxima na imagem deve ser inferior à metade da faixa dinâmica para permitir diferenças de intensidade quando as células entram em mitose. Em seguida, repita este processo usando a excitação CFP e os filtros de emissão YFP. Selecione várias regiões com células transfectadas, excluindo as regiões usadas para focar e otimizar as condições de exposição.

Como esses procedimentos podem ter invocado uma resposta ao estresse, certifique-se de que a intensidade máxima seja menor que a metade da faixa dinâmica em todas as células. Instrua o software a adquirir duas imagens a cada 45 minutos usando excitação YFP, emissão YFP e excitação CFP. Filtros de emissão YFP.

Defina também a duração total do experimento para exceder a duração do ciclo celular. Depois que tudo estiver definido, comece a adquirir imagens após a conclusão da aquisição, abra as imagens adquiridas e monitore o tempo do ciclo celular de mitose para mitose. Para células que expressam a sonda transfectada aqui, o tempo do ciclo celular foi de aproximadamente 20 a 25 horas.

Compare isso com os dados de controle para o tipo de célula usado. Se o tempo do ciclo celular corresponder aos tempos de referência, o traste pode ser analisado. Uma vez verificado o tempo, as imagens podem ser analisadas.

A análise pode ser realizada pela maioria dos softwares dedicados à microscopia. Aqui, o freeware image j é usado com o plugin ratio plus. Comece a análise abrindo as imagens na Imagem J.Se as imagens estiverem em um formato de pilha multicolorida, separe os canais individuais convertendo-os em uma hiperpilha selecionando a imagem.

Em seguida, hiperpilha, pilha a hiperpilha. A janela converter para hiperpilha é aberta com as configurações exibidas, clique em OK. A imagem agora será exibida com duas barras deslizantes abaixo dela.

Ao lado de dividir as imagens em pilhas de canal único, clique na imagem e selecione hiperpilha para reduzir dimensionalidade. Isso abrirá a janela de redução, garantirá que os quadros e a fonte de manutenção estejam selecionados. Em seguida, clique em OK.

Uma nova imagem contendo apenas um canal aparecerá. Repita esse processo para exibir uma nova imagem com o segundo canal. Em seguida, para aumentar a clareza visual das imagens finais, selecione a pilha de emissão YFP de excitação YFP

Clique em processo e, em seguida, clique em matemática. Em seguida, multiplique Quando a janela de multiplicação for aberta, insira três para multiplicar a pilha de emissão YFP de excitação YFP por três. A etapa é opcional e garante que as proporções não estejam no intervalo entre zero e um.

Em seguida, na barra de ferramentas J da imagem, selecione a ferramenta à mão livre. Em seguida, na excitação YFP, pilha de emissão YFP, desenhe uma região de interesse ou ROI em uma área desprovida de células, mas que esteja próxima a uma célula que será medida para adicionar o ROI ao gerenciador de ROI, clique em ferramentas de análise. Em seguida, gerente de ROI.

A janela do gerenciador de ROI será exibida. Clique em adicionar para salvar as coordenadas ROI para medir a intensidade média do ROI na pilha de emissões YFP de excitação YFP. Clique em analisar e selecione medir.

A janela de resultados será aberta. Selecione a pilha de emissão YFP de excitação CFP. Em seguida, clique duas vezes no ROI no gerenciador de ROI e repita a medição.

A medida é adicionada à janela de resultados. Role para outros locais na pilha para repetir esse processo em vários momentos. Verifique se as intensidades de fundo próximas à célula de interesse são semelhantes em todo o filme, comparando as medições na janela de resultados.

Para definir as medições para incluir intensidade mínima, clique em analisar, depois clique em definir medições e indique o valor mínimo e máximo de cinza. Uma janela mostrando alternativas de medição aparecerá em seguida. Depois de ajustar o brilho e o contraste conforme necessário, desenhe um ROI cobrindo a maior parte de uma célula e meça a intensidade mínima em ambas as pilhas.

Em seguida, faça medições como antes dessa vez usando uma célula em vez do plano de fundo. Usando os valores das seções de resultados, calcule a diferença entre a intensidade mínima medida e a intensidade de fundo e divida-a por dois. Isso fornece uma estimativa inicial para um valor de recorte para a proporção de abertura mais plug-ins selecionados.

Em seguida, proporção mais. Em seguida, para a taxa de frete, selecione a pilha S de emissão YFP de excitação CFP um ou para a taxa de frete invertida visualizando sondas onde a eficiência do traste diminui com a fosforilação. Selecione a pilha S de emissão YFP de excitação YFP um para inserir as intensidades de fundo medidas e os valores de corte.

Use os valores da janela de resultados e cole-os na janela de proporção mais. Defina o dimensionamento da pilha de proporção resultante e aplique uma tabela de pesquisa adequada para visualizar as alterações de proporção. As células U2 OS expressando uma sonda baseada em trastes monitorando a atividade PLK one foram filmadas por 60 horas, conforme descrito neste vídeo.

Esta imagem mostra a entrada mitótica cumulativa de 50 células que expressam a sonda traste, incluindo divisões de células-filhas. A maioria das células que expressam a sonda prolifera com um tempo de ciclo celular entre 20 e 25 horas, indicando que as condições de imagem e os níveis de expressão da sonda não afetam o tempo do ciclo celular. Uma representação de cor falsa da razão de traste invertida seguindo uma célula através de quatro divisões demonstra que, embora haja ruído considerável, é observada uma tendência na qual a atividade de PK um aumenta em G dois e atinge o pico durante a mitose.

Quando os dados brutos são filtrados e apresentados como um gráfico, o tempo entre os picos de atividade é fácil de estimar. Esta figura mostra a quantificação da razão de traste invertido da célula mostrada nas imagens anteriores do gráfico. O tempo de ativação pode ser estimado e, como pode ser visto aqui, a fosforilação da sonda torna-se visível aproximadamente quatro horas antes da fosforilação atingir o pico na mitose.

Ao tentar este procedimento, é importante manter as células em uma condição sem estresse, para que isso seja feito minimizando a exposição à luz, bem como minimizando as mudanças de temperatura ou pH. Também é importante lembrar que este método monitora o equilíbrio entre a atividade da quinase e da fosfatase em uma célula. Este procedimento pode ser combinado com interferências de RNA ou telas inibidoras para identificar os reguladores a montante dessas quinases e fosfatases.