Comparação de três métodos diferentes de determinação da proliferação celular em linhas celulares de cancro da mama

O objetivo geral desta demonstração é comparar três ensaios diferentes de proliferação celular e apresentar as vantagens e desvantagens de cada método. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da pesquisa do câncer, como o uso do método de proliferação celular mais apropriado. A preparação desse método é crítica, pois as etapas do gerador de imagens celulares são difíceis de aprender.

Eles exigem que você se concentre nas células antes de aplicar a máscara de contagem de células apropriada. Para iniciar este procedimento, cultive duas linhagens celulares MCF-7 por três dias até 75 a 80% de confluência nos frascos de cultura de tecidos T75 de centímetro quadrado usando DMEM sem vermelho de fenol. Após três dias, remova as células dos frascos despejando o meio em um recipiente de lixo.

Em seguida, lave imediatamente a camada celular com dois mililitros de tripsina pré-aquecida duas vezes. Aspire a tripsina e adicione mais dois mililitros de tripsina pré-aquecida à camada celular antes de colocá-la em uma incubadora. Depois que as células se soltarem, lave-as com 10 mililitros de DMEM suplementado fresco aquecido.

Em seguida, transfira a suspensão da célula para um tubo estéril de 15 mililitros e centrifugue-o por cinco minutos à temperatura ambiente. Após cinco minutos, aspire cuidadosamente e descarte o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda o pellet celular em cinco mililitros de DMEM suplementado fresco.

Para realizar uma contagem de células, diluir 100 microlitros da suspensão celular em 900 microlitros de uma vez DPBS. Em seguida, coloque um novo sensor de 60 micrômetros no contador de células automatizado. Segure o êmbolo e mergulhe o sensor na suspensão de células diluídas.

Solte lentamente o êmbolo no contador de células. Em seguida, remova o sensor do contador de células quando terminar. Semeie as células em um volume final de 100 microlitros em uma placa de 96 poços a cerca de 20% de confluência para permitir espaço para o crescimento celular e a medição da proliferação ao longo de três a cinco dias.

Para determinar a contagem de células usando um hemocitômetro, pré-aqueça o meio e a tripsina a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de células, forno ou banho-maria. Em seguida, aspire o meio das células para um recipiente de resíduos. Em seguida, lave-os uma vez com 30 microlitros de duas vezes tripsina e aspire o meio para o recipiente de resíduos novamente.

Em seguida, lave as células novamente com 30 microlitros de tripsina duas vezes e incube-as por cinco minutos a 37 graus Celsius. Bata suavemente na borda da placa para desalojar as células. Em seguida, adicione 50 microlitros de DMEM suplementado e misture as células pipetando até formar uma única suspensão celular.

Coloque a lamínula de vidro sobre as câmaras de contagem e fixe-a até que os anéis de refração de Newton sejam vistos entre as bordas da lamínula e o helocitômetro. Em seguida, pipete suavemente 20 microlitros da suspensão celular sob a lamínula e deixe a câmara de contagem ser preenchida por movimento capilar. Posteriormente, visualize as câmaras de contagem no layout da grade com ampliação de 10x.

Neste procedimento, descongele o reagente de luminescência em banho-maria a 22 graus Celsius por 30 minutos. Inverta suavemente a garrafa para obter uma mistura homogênea. Em seguida, equilibre uma placa de células semeadas em temperatura ambiente por 30 minutos.

Depois, adicione 100 microlitros de reagente de luminescência a cada poço. Misture o conteúdo em um agitador orbital por dois minutos. Em seguida, deixe a placa incubar por 10 minutos em temperatura ambiente.

Para configurar um experimento de luminescência usando o software leitor de placas multimodo, ligue o leitor de placas multimodo e abra o software. No Gerenciador de Tarefas, selecione Experimentos e Criar Novo. Em seguida, selecione Arquivo na barra de ferramentas lateral e, na guia Protocolo, selecione Procedimento.

Em seguida, selecione Greiner 96 flat bottom como o tipo de placa e marque a caixa Usar tampa. Selecione a ação Ler na caixa Método de leitura. Em seguida, selecione Luminescência como método de detecção e clique OK.In caixa Etapa de leitura, selecione os poços a serem verificados na guia Placa completa e selecione poços para atuar como poços em branco.

Defina o conjunto de filtros como Filtro vazio. Defina o ganho para 135, com um tempo de integração de 5 segundos por poço e uma altura de leitura de 6,5 milímetros. Clique em OK para salvar as configurações para a leitura de luminescência.

Para executar uma leitura de luminescência, ejete o suporte da placa selecionando a guia Controle do instrumento e clique em Saída da placa. Coloque a placa de 96 poços no suporte da placa, certificando-se de que a tampa esteja colocada. Feche o suporte da placa clicando em Plate In na guia Instrument Control.

Em seguida, clique em Ler agora na barra de ferramentas para executar uma leitura luminescente. Depois disso, exporte as medições de RLU de cada poço para uma planilha para análise posterior. Para configurar um experimento de imagem celular, ligue o gerador de imagens celular multimodo e abra o software.

No Gerenciador de Tarefas, selecione a guia Experimentos e Criar Novo. Na barra de ferramentas Arquivo, clique na guia Protocolo e, em seguida, na guia Procedimento. Selecione a ação Definir temperatura.

Defina a incubadora como Ligada e defina a temperatura para 37 graus Celsius. Marque Pré-aquecer e clique em OK para salvar as configurações. Em seguida, selecione a ação Ler.

Clique em Imagem como método de detecção. Em seguida, selecione o tipo de leitura Endpoint/Kinetic e o tipo de óptica Filters e clique em OK. Depois disso, clique na guia Placa Completa e selecione os poços na placa a ser visualizada. Clique em OK para salvar as configurações.

Agora, selecione o objetivo 2,5 vezes na opção suspensa Objetivos. Na guia Canais, selecione GFP 469.525 e Campo claro. Marque a Exposição Automática para ambos os canais e selecione a exposição automática.

Para determinar as configurações de foco automático, clique em Opções. Para as opções de foco automático, selecione o método Digitalizar e, em seguida, foco automático. Clique em OK para salvar as configurações.

Depois disso, defina o deslocamento horizontal e vertical do centro do poço para zero. Selecione para digitalizar várias imagens por poço em uma montagem de três por dois. Em seguida, clique em OK para salvar as configurações do procedimento.

Para ler o experimento na placa selecionada, clique na guia Controle do instrumento e selecione a função Saída da placa. Coloque uma placa de 96 poços no suporte da placa, certificando-se de que a tampa esteja colocada. Na guia Controle do instrumento, selecione a função Placa de entrada.

Em seguida, selecione Ler agora na guia da placa e repita a leitura a cada 24 horas, até 96 horas após a propagação. Para analisar uma imagem, clique na guia Dados na placa de imagem e selecione Imagem GFP 469, 525 mais Campo claro. Em seguida, clique duas vezes no poço de imagem.

Agora, clique em uma imagem carregada. Selecione Analisar e, em seguida, selecione a imagem única da montagem a ser analisada. Em seguida, clique em OK. Depois, verifique apenas o canal GFP e defina os parâmetros conforme descrito na Tabela 3.

Depois disso, clique em Iniciar para aplicar os parâmetros às células de imagem. Observe a máscara de contagem de células colocada sobre as células com imagem, que é usada para determinar a contagem de células por imagem. Clique em Aplicar alterações e mantenha essas configurações para cada placa criada durante o experimento.

Nesta figura, uma análise de regressão linear foi realizada para comparar as relações correlativas entre os diferentes métodos examinados para medir a proliferação celular em células MCF-7-LeGO e células MCF-7-delta 40p53. Calculou-se o coeficiente de correlação de Pearson e determinou-se a significância entre os diferentes métodos que medem a proliferação celular. A correlação mais forte foi observada entre a comparação do ensaio baseado em luminescência e o gerador de imagens celulares.

Aqui são mostradas as imagens representativas de células de câncer de mama MCF-7-LeGO e MCF-7-delta 40p53 positivas para GFP capturadas usando o gerador de imagens celulares a cada 24 horas até que as células atinjam perto de 100% de confluência. Este método fornece informações celulares úteis, incluindo a capacidade de monitorar visualmente o crescimento celular ao longo de vários dias e comparar o tamanho e a morfologia celular entre diferentes linhagens celulares. Um resumo das vantagens e desvantagens de cada método testado é mostrado aqui, o que demonstra a versatilidade de cada um dos métodos e ajudará os leitores a escolher o método mais adequado.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de três ensaios diferentes de proliferação celular e deve ser capaz de determinar qual deles se adapta melhor ao seu próprio projeto experimental.