Name: Comparação de três métodos diferentes de determinação da proliferação celular em linhas celulares de cancro da mama (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 35 s
Description: Aprenda a comparar três métodos de análise de proliferação celular em linhas MCF-7 de câncer de mama, incluindo contagem convencional, ensaio de luminescência e imagem celular.

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Gostaríamos de agradecer ao Dr. Hamish Campbell e ao Prof. Antony Braithwaite por sua ajuda no desenvolvimento das linhagens celulares MCF-7-LeGO transduzidas. Gostaríamos de agradecer nosso apoio financeiro pela Bloomfield Group Foundation por meio do Hunter Medical Research Institute. BCM é apoiado por uma bolsa APA através da Universidade de Newcastle e a bolsa MM Sawyer através do Hunter Medical Research Institute.

1. Células Preparação para a proliferação Ensaios Nota: Preparar as duas linhas celulares do mesmo modo e sementes no mesmo formato para cada método a ser analisado. <ol><li> Crescer células MCF-7 e MCF-LEGO-7-Δ40p53 7 células a 75-80% de confluência em T de 75 cm 2 frascos de cultura de tecidos utilizando fenol-vermelho livre de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS) , 200 mM de L-glutamina, 2 ug / ml de insulina e 1 ug / ml de puromicina a 37 ° C com 5% de CO 2. Lidar com células em uma biossegurança estéril classe gabinete II. Nota: A quantidade de tempo que leva para crescer as células até à confluência varia dependendo da diluição semeadura. Na preparação para o plaqueamento das células para os ensaios de proliferação, as células de semente a uma diluição de 1: 3 em meio DMEM suplementado e manter em condições normais de crescimento durante 3 dias, até 75-80% de confluência. </li><li> Para remover as células do frasco, deitar fora os meios de comunicação emum recipiente de resíduos. Imediatamente lavar a camada de células com 2 ml de tripsina 2x pré-aquecido. Aspirar tripsina. Adicionar mais 2 ml de tripsina pré-aquecido para a camada de células e colocar numa incubadora durante 5 min a 37 ° C com 5% de CO 2. <ol><li> Uma vez que as células de separar, lavar as células com 10 ml de DMEM fresco suplementado aquecido. Transferir a suspensão de células para um tubo de 15 ml estéril e centrifugar a 491 xg durante 5 min à TA. Aspirar cuidadosamente e descartar o sobrenadante. </li></ol></li><li> Ressuspender o sedimento de células em 5 ml de DMEM suplementado fresco. Executar uma contagem de células para determinar a densidade correcta para propagar as células em placas de 96 poços. <ol><li> Dilui-se 100 ul da suspensão de células em 900 ul de 1x Dulbecco salina tamponada com fosfato (DPBS). Coloque um novo sensor de 60 mm para o contador de células automatizado. Segurar o êmbolo para baixo e submergir o sensor na suspensão diluída de células. Lentamente, liberte o êmbolo no balcão da célula. Remova o sensor do cou celularnter quando concluído. Nota: A contagem das células será exibida no contador de células em células / ml. </li></ol></li><li> Semear as células em um volume final de 100 ul de DMEM (em) numa placa de 96 cavidades, com ~ 20% de confluência para permitir espaço para o crescimento de células e a medição da proliferação ao longo de 3-5 dias (ver Tabela 1). Semente todas as linhas de células em triplicado. Nota: Para esta experiência, três densidades celulares diferentes foram avaliados para determinar a densidade celular ideal. Os números de células necessários encontram-se resumidos na Tabela 1. Semear as células a uma densidade mais baixa, se é necessária a medição de crescimento mais longo prazo. <ol><li> Para o hemocitómetro e ensaios à base de luminescência, preparar uma placa por ponto de tempo (isto é, 4 placas por ensaio). Para o ensaio de células Imager, preparar uma única placa para a duração da experiência. </li></ol></li><li> Manter as células a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 24 horas. </li></ol> 2. Determinar celular Contagem Using um hemocitômetro <ol><li> Pré-aquecido tanto médio e tripsina a 37 ° C numa incubadora de cultura de células, forno ou banho-maria. media aspirado de células em um recipiente de resíduos, lave uma vez com 30 mL de tripsina 2x, e aspire a tripsina. </li><li> Lave as células mais uma vez com 30 ul de tripsina 2x, e incubar durante 5 minutos a 37 ° C. Bater levemente borda da placa para desalojar as células da placa. Adicionar 50 ul de DMEM suplementado e misturar as células por pipetagem até que as células formam uma suspensão de célula única. </li><li> Prepare hemocitômetro por superfície e tampa de vidro limpeza com etanol 70%. </li><li> Coloque a tampa do deslizamento de vidro sobre câmaras de contagem e apor até &#39;de Newton anéis refração&#39; pode ser visto entre as bordas da tampa-derrapante eo hemocitômetro. Nota: Estes indicam que a tampa-derrapante tem corretamente aderido à hemocitômetro. </li><li> Gentilmente pipeta 20 ul de suspensão de células sob a tampa-derrapante, enchendo a câmara de contagem pelo movimento capilar.Coloque hemocitï¿½etro em 10x de um microscópio e visualizar as câmaras de contagem no layout grid. </li><li> Contagem de células do 4 quadrados exteriores da disposição da grade. Para melhorar a precisão, número de repetições de quadrados exteriores adicionais, se necessário, ou até a contagem atingiu 70 - 100 células 14,15. <ol><li> Calcule a concentração de células por mL, como se segue: Média da contagem de células por factor de diluição x quadrado (se usado) x 10 4 </li></ol></li><li> Repita os passos de 2,1-2,8 a cada 24 horas para 96 ​​horas pós-semeadura. </li></ol> 3. determinando a proliferação celular utilizando um ensaio à base de luminescência Nota: Esta é uma medida endpoint. Uma vez que o reagente é adicionado às células, a placa só pode ser quantificada uma vez. <ol><li> reagente de luminescência Thaw em um 22 ° C banho de água durante 30 minutos. </li><li> Misturar suavemente reagente, invertendo o frasco para se obter uma mistura homogénea. </li><li> Equilibrar uma placa de células semeadas (da etapa1,5) à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Adiciona-se 100 ul de reagente de luminescência de cada poço. Misturar o conteúdo em um agitador orbital durante 2 min. Permitir que a placa a incubar durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> A criação de um experimento de luminescência utilizando o software leitor de placas multi-modo. <ol><li> Ligue leitor de placas multi-modo e abrir o software. No &#39;gerenciador de tarefas &quot;, selecione&quot; experiências &quot;e&quot; criar new&#39;.Select&#39; file &#39;da barra de ferramentas lateral, e sob &quot;protocolo&quot; guia, selecione &quot;Procedimento&quot;. </li><li> Selecione &#39;Grenier 96 fundo plano &quot;tipo de placa, e marque a caixa&quot; uso tampa&#39;. Selecione a ação &quot;ler&quot; sob a caixa &quot;método lidas &#39;. Selecione método de detecção de &quot;luminescência&quot;. Clique em &#39;OK&#39;. </li><li> Na caixa de etapa ler, selecione os poços a serem digitalizados na guia &quot;prato cheio&quot;, e selecione poços de agir poços como em branco. </li><li> Definir o conjunto de filtros para filtrar vazio (por exemplo, plugue, Em: buraco, espelho: nenhum). Definir o ganho para135, com um tempo de integração de 0,5 s por poço e uma altura de 6,5 mm ler. Clique em &quot;OK&quot; para salvar as configurações para a leitura de luminescência. </li></ol></li><li> Executando uma luminescentes Leia <ol><li> Ejectar suporte da placa, selecionando guia &#39;controle de instrumentos&#39; e clique em &#39;placa out&#39;.Place placa de 96 poços no suporte da placa, assegurando a tampa está ligado. Feche o suporte da placa, clicando em &#39;placa em&#39; Guia sob &#39;controle de instrumentos. Clique em &#39;leia agora &quot;na barra de ferramentas para executar leitura luminescente. </li><li> Exportar as medições relativas unidade luminescente (RLU) de cada poço para uma folha de cálculo para análise posterior. </li></ol></li><li> Repita os passos de 3,1-3,6 para gravar a proliferação cada 24 horas até 96 horas após a semeadura células. </li></ol> 4. Determinar contagem de células utilizando um gerador de imagens celular <ol><li> A criação de um experimento de imagens de células usando o software gerador de imagens de células multi-mode <ol><li> Ligue imager célula multi-modo e th abertae software. </li><li> No &#39;gerenciador de tarefas&#39;, selecione a aba &#39;experimentos&#39; e &#39;criar new&#39;.On o&#39; &#39;da barra de ferramentas, clique em&#39; arquivo &#39;guia e aberto&#39; protocolo de procedimento de ajuste de temperatura ação &quot;tab.Select &#39;&#39;. Definir incubadora para &#39;on&#39; e ajustar a temperatura para 37 ° C e verificar &quot;pré-aquecimento&quot; antes de continuar com a caixa próximo passo &#39;. Clique em &quot;OK&quot; para salvar as configurações. </li><li> Selecione a ação &#39;ler&#39;. Clique no método de detecção de &#39;imagem&#39;, selecione &#39;endpoint / cinético &quot;ler tipo e tipo de óptica&quot; Filtros &quot;. Clicar em &#39;OK&#39;.Click em &quot;guia prato cheio&#39; e selecione poços na placa a ser trabalhada. Clique em &quot;OK&quot; para salvar as configurações. </li><li> Selecione o objetivo 2.5X no menu suspenso opções «objectivos». Sob a aba &quot;canais&quot;, selecione dois canais: GFP 469, 525 e Campo brilhante. Verificar a exposição &#39;auto&#39; para ambos os canais e selecione o auto-exposição bem. </li><li> Para determinar auto ajustes de foco, selecione &quot;auto-foco&quot; e clique em &quot;Opções&quot;. Para as opções de foco automático, selecione o método de &quot;digitalizar e foco automático &#39;. Clique em &quot;OK&quot; para salvar as configurações. </li><li> Defina o deslocamento horizontal e vertical do centro de bem (im) para 0.Select para digitalizar várias imagens por poço em uma montagem 3 x 2, com espaçamento horizontal (mm) = 2.881 e espaçamento vertical (mm) = 2.127. Clique em &quot;OK&quot; para salvar as configurações do procedimento. Nota: Consulte a Tabela 2 para os parâmetros de leitura. </li></ol></li><li> Realizando Leia Experiment na placa Selecionado <ol><li> Clique na aba &#39;controle de instrumentos&#39; e selecione o &#39;prato out&#39; function.Place placa de 96 poços no suporte da placa, assegurando a tampa está ligado. No separador &#39;controle de instrumentos &quot;, selecione a opção&#39; placa em &#39;função. Selecione &#39;ler agora &quot;a partir do separador placa. Repita ler cada 24 horas até 96 horas após a semeadura. </li></ol></li><li> Análise da contagem celular utilizando oCelular Software Imager. <ol><li> Para analisar uma imagem, clique na guia &quot;Dados&quot; na placa com imagens, &#39;imagem [GFP 469, 525 + campo Bright] &quot;select. Dê um duplo clique em um bem trabalhada. </li><li> Clique em uma imagem carregada. Selecione &quot;Analisar&quot; e selecionar uma única imagem da montagem a ser analisado. Clique em &#39;OK&#39;.Check o &quot;GFP&quot; canal só, e definir os parâmetros, conforme descrito na Tabela 3. Clique em&#39; Start &#39;para aplicar os parâmetros para as células fotografada. </li><li> Observar a máscara contagem das células colocadas sobre as células fotografadas, que é usado para determinar a contagem de células por imagem. Clique em &quot;Aplicar alterações&quot; e manter essas configurações para cada placa fotografada durante todo o experimento. </li><li> Depois de voltar à placa com imagens, clique sobre a queda de &#39;dados&#39; no menu suspenso e selecione &#39;contagem de células&#39;. Isto irá gerar a contagem total de células por poço. </li><li> Exportar todos os dados para uma planilha, clicando na guia &quot;exportação&quot; para posterior análise of as contagens de células por poço. </li></ol></li></ol>

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 <a target="_blank" href="https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSVerse_CellCycleAnalysis_AppNote.pdf">https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSVerse_CellCycleAnalysis_AppNote.pdf</a> 1-12 (2011).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Neste protocolo foram examinados três diferentes métodos de medição da proliferação celular em células em cultura. Cada método foi capaz de medições reprodutíveis e precisos de proliferação de células durante 96 h, e os resultados foram comparáveis ​​entre cada um dos métodos testadas (Figura 2 e 3). Tanto o ensaio à base de luminescência e método de imagem de células produzido os resultados mais robustos, mostrando um aumento linear na proliferação de células após 96 horas (Figura 2b, ...

O gene supressor do tumor, p53, é um regulador essencial de um número de processos celulares, incluindo a paragem do ciclo celular, apoptose e senescência 1. Ela é responsável pela manutenção da estabilidade genómica, e é, portanto, crucial para manter o equilíbrio de morte celular e o crescimento celular. As mutações em p53 são comuns no cancro e são a principal causa de inactivação de p53 que conduz à proliferação descontrolada de células de cancro 2. Curiosamente, as mutações em p53 representam apenas cerca de 25% dos cancros da mama 3, sugerindo que outros mecanismos são responsáveis ​​pela perda de função de p53. As isoformas p53 recentemente descobertos têm sido mostrados para ser sobre-expresso num certo número de cancros humanos, e são capazes de modular a função de p53 4,5. Nós mostramos anteriormente que a isoforma p53, Δ40p53, é a isoforma mais altamente expresso em cancro da mama, e é significativamente regulada positivamente em células de cancro da mama, quando comparado com tiss normal adjacenteue 6. Após isso, transduzida de forma estável a linha de células do cancro da mama humano MCF-7 para sobre-expressar Δ40p53 usando o LEGO-IG2-Puro + vector (GFP +) 7. Estas células foram utilizadas para investigar se a expressão elevada Δ40p53 aumenta as taxas de proliferação celular em células de cancro da mama. Existem muitos métodos diretos e indiretos de medição da proliferação celular de células cultivadas in vitro 8,9. Estes podem ser realizadas tanto como medições contínuas ao longo do tempo, ou como ensaios de ponto final 10. Os métodos convencionais são ainda úteis, tais como contagem de células utilizando um hemocitómetro. Este ensaio é um baixo custo e medida direta do número de células, mas não contam com grandes contagens de células e formação altamente qualificada para minimizar desvios de erro e um grande padrão de as contagens. A necessidade de se realizar medidas compatíveis com os formatos de alto rendimento tem levado ao desenvolvimento de ensaios com vários poços de placa. Estes ensaios baseados em luminescência measure número de células com base em um sinal luminescente que é proporcional à actividade metabólica da célula 11,12. Mais recentemente, a introdução de plataformas de imagem de alta conteúdo tem permitido novas ferramentas que monitoram a proliferação de células, proporcionando a coleta de dados fenotípicos quantitativa e qualitativa, e inclui uma variedade de sistemas 13. Todos estes métodos fornecem avenidas para medir o crescimento celular, quer por ensaios de medição ou de ponto de extremidade contínuas, e cada um possui uma série de vantagens e desvantagens no que diz respeito à sensibilidade, taxa de transferência dos dados da amostra, e informações de célula, todas as quais podem ser ponderados em conformidade dependendo sobre a questão de pesquisa. Este protocolo descreve três métodos diferentes para medir a proliferação celular in vitro, com cada método utilizando diferentes gamas de sensibilidade, reprodutibilidade e formatos de placas multi-poços. Este protocolo teve como objetivo comparar a utilização de um cha hemocitï¿½etro contagemmber, um ensaio de luminescência à base de viabilidade celular, e gerador de imagens de células, na medição da proliferação de células ao longo de um curso de tempo de 96 horas. Para fazer isso, o crescimento de células transduzidas por vetores (MCF-7-LEGO) foi comparada com as células transduzidas para sobre-expressar Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), utilizando três diferentes densidades celulares. A proliferação celular foi medida a cada 24 h durante até 96 h. Cada método verificou-se ter as suas próprias vantagens e desvantagens, e, dependendo do objectivo da experiência, cada um ainda é um método valioso para fornecer informação sobre a taxa de proliferação.

<table><tbody><tr><td>Meio Eagle Modificado de Dulbecco, sem fenol-vermelho</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21063-045</td><td>Suplementado com 10% de FBS, 200 mM L-glutamina, 2 &micro; g/ml de insulina e 1 &micro; g / ml solução de puromicina</td></tr><tr><td>L-glutamina (100x)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Solução de insulina humana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td> <td>Bovogen Biologicals</td><td>SFBS-F-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de puromicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>0,5% solução de tripsina-EDTA (10x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15400-054</td><td>Diluir para 2x em DPBS</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) (1x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>30028-02</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de cultura de tecidos, área > 75 cm2 </supgrowth Contador de</td> células <td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Scepter 2.0 Contador</td> de células <td>Merck Millipore</td><td></td><td>Contador de células automatizado</td></tr><tr><td>de 96 poços, fundo plano</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>Melhorado Neubauer Hemocitômetro</td><td>BOECO Alemanha</td><td>BOE 01</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido Olympus IX51 Olympus IX51</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 2.0 Ensaio</td><td>Promega</td><td>G9242</td><td>Ensaio baseado em luminescência</td></tr><tr><td>Leitor multimodo de imagem celular de citação 3 Leitor de</td> placas <td>BioTek</td><td></td> para <td>luminescência, fluorescência e imagem de células de campo claro</td></tr><tr><td>Gen5 Software de análise de dados</td><td>BioTek</td><td>GEN5</td><td></td></tr></tbody></table>

comparação de três métodos diferentes de determinação da proliferação celular em linhas celulares de cancro da mama

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

A medição da proliferação celular pode ser realizada por vários métodos diferentes, cada um com níveis variados de sensibilidade, reprodutibilidade e compatibilidade com formatação de alto rendimento. Este protocolo descreve o uso de três métodos diferentes para medir a proliferação celular in vitro, incluindo a câmara de contagem de hemocitômetros convencional, um ensaio baseado em luminescência que utiliza a mudança na atividade metabólica de células viáveis como uma medida do número relativo de células e um gerador de imagens celular multimodo que mede o número de células usando um algoritmo de contagem. Cada método apresenta suas próprias vantagens e desvantagens para a medição da proliferação celular, incluindo tempo, custo e compatibilidade de alto rendimento. Este protocolo demonstra que cada método pode medir com precisão a proliferação celular ao longo do tempo e foi sensível para detectar o crescimento em diferentes densidades celulares. Além disso, a medição da proliferação celular usando um gerador de imagens celular foi capaz de fornecer mais informações, como morfologia, confluência e permitiu um monitoramento contínuo da proliferação celular ao longo do tempo. Em conclusão, cada método é capaz de medir a proliferação celular, mas o método escolhido é dependente do usuário.

Para estudar diferentes métodos de medição da proliferação de células em cultura, a proliferação de células de MCF-7-Δ40p53 células transduzidas foi comparado com o MCF-7-LEGO não transduzidas linha celular de cancro da mama. Os três métodos que foram comparados - o método de imagiologia hemocitómetro convencional, ensaio de luminescência a viabilidade das células, e células Análisis- são descritas no diagrama esquemático (Figura 1). Cada método tem vantagens e desvantag...

Este protocolo descreve o uso de três métodos diferentes para analisar a proliferação celular em linhagens celulares de câncer de mama. Isso inclui o uso de contagem de células convencional, viabilidade celular baseada em luminescência e contagem de células por meio do uso de um gerador de imagens de células. Cada um oferece vantagens para a medição reprodutível da proliferação celular.

Comparação de três métodos diferentes de determinação da proliferação celular em linhas celulares de cancro da mama

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

O objetivo geral desta demonstração é comparar três ensaios diferentes de proliferação celular e apresentar as vantagens e desvantagens de cada método. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de pesquisa do câncer, como a escolha do método de proliferação celular mais apropriado. O preparo deste método é essencial, pois os passos envolvendo o imageador celular são difíceis de aprender.É necessário focar nas células antes de aplicar a máscara apropriada para contagem celular. Para iniciar este procedimento, cultive duas linhagens celulares MCF-7 por três dias até atingir 75 a 80% de confluência em frascos de cultura de tecidos de 75 cm² utilizando DMEM sem vermelho de fenol. Após três dias, remova as células dos frascos descartando o meio em um recipiente de resíduos.Em seguida, lave imediatamente a camada celular com dois mililitros de tripsina pré-aquecida a duas vezes. Aspire a tripsina e adicione outros dois mililitros de tripsina pré-aquecida à camada celular antes de colocá-la em um incubador. Assim que as células se desprendem, lave-as com 10 mililitros de DMEM suplementado fresco aquecido.Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo estéril de 15 mililitros e centrifugue por cinco minutos em temperatura ambiente. Após cinco minutos, aspire e descarte cuidadosamente o sobrenadante. Posteriormente, re-suspenda o pellet celular em cinco mililitros de DMEM suplementado fresco.Para realizar uma contagem celular, dilua 100 microlitros da suspensão celular em 900 microlitros de DPBS uma vez. Em seguida, coloque um novo sensor de 60 micrômetros no contador automático de células. Mantenha o êmbolo pressionado e submerja o sensor na suspensão celular diluída.Solte lentamente o êmbolo do contador de células. Em seguida, remova o sensor do contador de células ao finalizar. Semee as células em um volume final de 100 microlitros em uma placa de 96 poços a cerca de 20% de confluência para permitir espaço para o crescimento celular e a medição da proliferação ao longo de três a cinco dias.Para determinar a contagem de células utilizando um hemocitômetro, pré-aqueça o meio e a tripsina a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura celular, forno ou banho-maria. Em seguida, aspire o meio das células para um recipiente de resíduos. Depois, lave-as uma vez com 30 microlitros de tripsina duas vezes e aspire novamente o meio para o recipiente de resíduos.Em seguida, lave novamente as células com 30 microlitros de tripsina duas vezes e incube-as por cinco minutos a 37 graus Celsius. Bata suavemente na borda da placa para desprender as células. Posteriormente, adicione 50 microlitros de DMEM suplementado e misture as células por pipetagem até que seja formada uma suspensão de células simples.Coloque a lamínula de vidro sobre as câmaras de contagem e fixe-a até que os anéis de refração de Newton sejam vistos entre as bordas da lamínula e o helocitômetro. Em seguida, pipete suavemente 20 microlitros da suspensão celular sob a lamínula e permita que a câmara de contagem seja preenchida por movimento capilar. Posteriormente, visualize as câmaras de contagem no arranjo em grade com aumento de 10x.Neste procedimento, descongele o reagente de luminiscência em banho-maria a 22 graus Celsius por 30 minutos. Inverta suavemente o frasco para obter uma mistura homogênea. Em seguida, equilibre uma placa de células semeadas à temperatura ambiente por 30 minutos.Em seguida, adicione 100 microlitros de reagente de luminiscência a cada poço. Misture o conteúdo em um agitador orbital durante dois minutos. Depois, deixe a placa incubando por 10 minutos à temperatura ambiente.Para configurar um experimento de luminiscência utilizando o software do leitor de placas multimo, ligue o leitor de placas multimo e abra o software. No Gerenciador de Tarefas, selecione Experimentos e Criar Novo. Em seguida, selecione Arquivo na barra lateral, e na guia Protocolo, selecione Procedimento.Em seguida, selecione Greiner 96 fundo plano como o tipo de placa e marque a caixa Usar Tampa. Selecione a ação Ler na caixa Método de Leitura. Depois, selecione Luminescência como o método de detecção e clique em OK. Na caixa Etapa de Leitura, selecione as poças a serem escaneadas na guia Placa Inteira e selecione as poças que servirão como brancos.Defina o Conjunto de Filtros como Filtro Vazio. Ajuste o Ganho para 135, com um Tempo de Integração de 5 segundos por poço e uma Altura de Leitura de 6,5 milímetros. Clique em OK para salvar as configurações da leitura de luminiscência.Para realizar uma leitura de luminiscência, ejetar o suporte da placa selecionando a guia Controle do Instrumento e clicar em Placa para Fora. Colocar a placa de 96 poços sobre o suporte da placa, garantindo que a tampa esteja colocada. Fechar o suporte da placa clicando em Placa para Dentro na guia Controle do Instrumento.Em seguida, clique em Ler Agora na barra de ferramentas para realizar uma leitura luminiscente. Depois disso, exporte as medidas de RLU de cada poço para uma planilha para análises posteriores. Para configurar um experimento de imagem celular, ligue o imageador celular multifuncional e abra o software.No Gerenciador de Tarefas, selecione a guia Experimentos e Crie Novo. Na barra de ferramentas Arquivo, clique na guia Protocolo e depois na guia Procedimento. Selecione a ação Definir Temperatura.Coloque o incubador em Ligado e defina a temperatura em 37 graus Celsius. Marque Pré-aquecimento e, em seguida, clique em OK para salvar as configurações. Em seguida, selecione a ação Ler.Clique em Imagem como método de detecção. Em seguida, selecione o tipo de leitura Endpoint/Kinetic e o tipo óptico Filtros e clique em OK. Depois disso, clique na guia Placa Inteira e selecione as poças da placa que serão imageadas. Clique em OK para salvar as configurações.Agora, selecione o objetivo de 2,5 vezes na opção Objetivos do menu suspenso. Na guia Canais, selecione GFP 469,525 e Campo Claro. Marque Exposição Automática para ambos os canais e selecione o poço de exposição automática.Para determinar as configurações de foco automático, clique em Opções. Para as opções de foco automático, selecione o método Varredura e depois foco automático. Clique em OK para salvar as configurações.Em seguida, defina o deslocamento horizontal e vertical a partir do centro do poço como zero. Selecione a opção de escanear múltiplas imagens por poço em um mosaico de três por dois. Depois, clique em OK para salvar as configurações do procedimento.Para ler o experimento na placa selecionada, clique na guia Controle do Instrumento e selecione a função Placa Fora. Coloque uma placa de 96 poços no suporte da placa, certificando-se de que a tampa esteja colocada. Na guia Controle do Instrumento, selecione a função Placa Dentro.Em seguida, selecione Ler Agora na guia da placa e repita a leitura a cada 24 horas, até 96 horas após a semeadura. Para analisar uma imagem, clique na guia Dados na placa com imagem e selecione Imagem GFP 469, 525 mais Campo Claro. Depois, clique duas vezes no poço com imagem.Agora, clique em uma imagem carregada. Selecione Analisar e, em seguida, selecione a imagem única do mosaico a ser analisada. Em seguida, clique em OK. Depois, marque apenas o canal GFP e defina os parâmetros conforme descrito na Tabela 3.Em seguida, clique em Iniciar para aplicar os parâmetros às células imagiadas. Observe a máscara de contagem de células posicionada sobre as células imagiadas, que é usada para determinar a contagem de células por imagem. Clique em Aplicar Alterações e mantenha essas configurações para cada placa imagiada ao longo do experimento.Nesta figura, foi realizada uma análise de regressão linear para comparar as relações correlativas entre os diferentes métodos examinados para medir a proliferação celular em células MCF-7-LeGO e células MCF-7-delta 40p53. Foi calculado um coeficiente de correlação de Pearson, e a significância foi determinada entre os diferentes métodos de mensuração da proliferação celular. A correlação mais forte foi observada na comparação entre o ensaio baseado em luminiscência e o analisador celular.As imagens representativas de células de câncer de mama MCF-7-LeGO e MCF-7-delta 40p53 positivas para GFP são mostradas aqui, capturadas com o imageador de células a cada 24 horas até que as células atinjam quase 100% de confluência. Este método fornece informações celulares úteis, incluindo a possibilidade de monitorar visualmente o crescimento celular ao longo de vários dias e comparar o tamanho celular e a morfologia entre diferentes linhagens celulares. Um resumo das vantagens e desvantagens de cada método testado é apresentado aqui, o que demonstra a versatilidade de cada um dos métodos e ajudará os leitores a escolher o método mais apropriado.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de três ensaios diferentes de proliferação celular e deverá ser capaz de determinar qual deles é o mais adequado para o seu próprio delineamento experimental.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

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