Comparação de três métodos diferentes de determinação da proliferação celular em linhas celulares de cancro da mama
3 de setembro de 2016
Este protocolo descreve o uso de três métodos diferentes para analisar a proliferação celular em linhagens celulares de câncer de mama. Isso inclui o uso de contagem de células convencional, viabilidade celular baseada em luminescência e contagem de células por meio do uso de um gerador de imagens de células. Cada um oferece vantagens para a medição reprodutível da proliferação celular.
O objetivo geral desta demonstração é comparar três ensaios diferentes de proliferação celular e apresentar as vantagens e desvantagens de cada método. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de pesquisa do câncer, como a escolha do método de proliferação celular mais apropriado. O preparo deste método é essencial, pois os passos envolvendo o imageador celular são difíceis de aprender.
É necessário focar nas células antes de aplicar a máscara apropriada para contagem celular. Para iniciar este procedimento, cultive duas linhagens celulares MCF-7 por três dias até atingir 75 a 80% de confluência em frascos de cultura de tecidos de 75 cm² utilizando DMEM sem vermelho de fenol. Após três dias, remova as células dos frascos descartando o meio em um recipiente de resíduos.
Em seguida, lave imediatamente a camada celular com dois mililitros de tripsina pré-aquecida a duas vezes. Aspire a tripsina e adicione outros dois mililitros de tripsina pré-aquecida à camada celular antes de colocá-la em um incubador. Assim que as células se desprendem, lave-as com 10 mililitros de DMEM suplementado fresco aquecido.
Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo estéril de 15 mililitros e centrifugue por cinco minutos em temperatura ambiente. Após cinco minutos, aspire e descarte cuidadosamente o sobrenadante. Posteriormente, re-suspenda o pellet celular em cinco mililitros de DMEM suplementado fresco.
Para realizar uma contagem celular, dilua 100 microlitros da suspensão celular em 900 microlitros de DPBS uma vez. Em seguida, coloque um novo sensor de 60 micrômetros no contador automático de células. Mantenha o êmbolo pressionado e submerja o sensor na suspensão celular diluída.
Solte lentamente o êmbolo do contador de células. Em seguida, remova o sensor do contador de células ao finalizar. Semee as células em um volume final de 100 microlitros em uma placa de 96 poços a cerca de 20% de confluência para permitir espaço para o crescimento celular e a medição da proliferação ao longo de três a cinco dias.
Para determinar a contagem de células utilizando um hemocitômetro, pré-aqueça o meio e a tripsina a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura celular, forno ou banho-maria. Em seguida, aspire o meio das células para um recipiente de resíduos. Depois, lave-as uma vez com 30 microlitros de tripsina duas vezes e aspire novamente o meio para o recipiente de resíduos.
Em seguida, lave novamente as células com 30 microlitros de tripsina duas vezes e incube-as por cinco minutos a 37 graus Celsius. Bata suavemente na borda da placa para desprender as células. Posteriormente, adicione 50 microlitros de DMEM suplementado e misture as células por pipetagem até que seja formada uma suspensão de células simples.
Coloque a lamínula de vidro sobre as câmaras de contagem e fixe-a até que os anéis de refração de Newton sejam vistos entre as bordas da lamínula e o helocitômetro. Em seguida, pipete suavemente 20 microlitros da suspensão celular sob a lamínula e permita que a câmara de contagem seja preenchida por movimento capilar. Posteriormente, visualize as câmaras de contagem no arranjo em grade com aumento de 10x.
Neste procedimento, descongele o reagente de luminiscência em banho-maria a 22 graus Celsius por 30 minutos. Inverta suavemente o frasco para obter uma mistura homogênea. Em seguida, equilibre uma placa de células semeadas à temperatura ambiente por 30 minutos.
Em seguida, adicione 100 microlitros de reagente de luminiscência a cada poço. Misture o conteúdo em um agitador orbital durante dois minutos. Depois, deixe a placa incubando por 10 minutos à temperatura ambiente.
Para configurar um experimento de luminiscência utilizando o software do leitor de placas multimo, ligue o leitor de placas multimo e abra o software. No Gerenciador de Tarefas, selecione Experimentos e Criar Novo. Em seguida, selecione Arquivo na barra lateral, e na guia Protocolo, selecione Procedimento.
Em seguida, selecione Greiner 96 fundo plano como o tipo de placa e marque a caixa Usar Tampa. Selecione a ação Ler na caixa Método de Leitura. Depois, selecione Luminescência como o método de detecção e clique em OK. Na caixa Etapa de Leitura, selecione as poças a serem escaneadas na guia Placa Inteira e selecione as poças que servirão como brancos.
Defina o Conjunto de Filtros como Filtro Vazio. Ajuste o Ganho para 135, com um Tempo de Integração de 5 segundos por poço e uma Altura de Leitura de 6,5 milímetros. Clique em OK para salvar as configurações da leitura de luminiscência.
Para realizar uma leitura de luminiscência, ejetar o suporte da placa selecionando a guia Controle do Instrumento e clicar em Placa para Fora. Colocar a placa de 96 poços sobre o suporte da placa, garantindo que a tampa esteja colocada. Fechar o suporte da placa clicando em Placa para Dentro na guia Controle do Instrumento.
Em seguida, clique em Ler Agora na barra de ferramentas para realizar uma leitura luminiscente. Depois disso, exporte as medidas de RLU de cada poço para uma planilha para análises posteriores. Para configurar um experimento de imagem celular, ligue o imageador celular multifuncional e abra o software.
No Gerenciador de Tarefas, selecione a guia Experimentos e Crie Novo. Na barra de ferramentas Arquivo, clique na guia Protocolo e depois na guia Procedimento. Selecione a ação Definir Temperatura.
Coloque o incubador em Ligado e defina a temperatura em 37 graus Celsius. Marque Pré-aquecimento e, em seguida, clique em OK para salvar as configurações. Em seguida, selecione a ação Ler.
Clique em Imagem como método de detecção. Em seguida, selecione o tipo de leitura Endpoint/Kinetic e o tipo óptico Filtros e clique em OK. Depois disso, clique na guia Placa Inteira e selecione as poças da placa que serão imageadas. Clique em OK para salvar as configurações.
Agora, selecione o objetivo de 2,5 vezes na opção Objetivos do menu suspenso. Na guia Canais, selecione GFP 469,525 e Campo Claro. Marque Exposição Automática para ambos os canais e selecione o poço de exposição automática.
Para determinar as configurações de foco automático, clique em Opções. Para as opções de foco automático, selecione o método Varredura e depois foco automático. Clique em OK para salvar as configurações.
Em seguida, defina o deslocamento horizontal e vertical a partir do centro do poço como zero. Selecione a opção de escanear múltiplas imagens por poço em um mosaico de três por dois. Depois, clique em OK para salvar as configurações do procedimento.
Para ler o experimento na placa selecionada, clique na guia Controle do Instrumento e selecione a função Placa Fora. Coloque uma placa de 96 poços no suporte da placa, certificando-se de que a tampa esteja colocada. Na guia Controle do Instrumento, selecione a função Placa Dentro.
Em seguida, selecione Ler Agora na guia da placa e repita a leitura a cada 24 horas, até 96 horas após a semeadura. Para analisar uma imagem, clique na guia Dados na placa com imagem e selecione Imagem GFP 469, 525 mais Campo Claro. Depois, clique duas vezes no poço com imagem.
Agora, clique em uma imagem carregada. Selecione Analisar e, em seguida, selecione a imagem única do mosaico a ser analisada. Em seguida, clique em OK. Depois, marque apenas o canal GFP e defina os parâmetros conforme descrito na Tabela 3.
Em seguida, clique em Iniciar para aplicar os parâmetros às células imagiadas. Observe a máscara de contagem de células posicionada sobre as células imagiadas, que é usada para determinar a contagem de células por imagem. Clique em Aplicar Alterações e mantenha essas configurações para cada placa imagiada ao longo do experimento.
Nesta figura, foi realizada uma análise de regressão linear para comparar as relações correlativas entre os diferentes métodos examinados para medir a proliferação celular em células MCF-7-LeGO e células MCF-7-delta 40p53. Foi calculado um coeficiente de correlação de Pearson, e a significância foi determinada entre os diferentes métodos de mensuração da proliferação celular. A correlação mais forte foi observada na comparação entre o ensaio baseado em luminiscência e o analisador celular.
As imagens representativas de células de câncer de mama MCF-7-LeGO e MCF-7-delta 40p53 positivas para GFP são mostradas aqui, capturadas com o imageador de células a cada 24 horas até que as células atinjam quase 100% de confluência. Este método fornece informações celulares úteis, incluindo a possibilidade de monitorar visualmente o crescimento celular ao longo de vários dias e comparar o tamanho celular e a morfologia entre diferentes linhagens celulares. Um resumo das vantagens e desvantagens de cada método testado é apresentado aqui, o que demonstra a versatilidade de cada um dos métodos e ajudará os leitores a escolher o método mais apropriado.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de três ensaios diferentes de proliferação celular e deverá ser capaz de determinar qual deles é o mais adequado para o seu próprio delineamento experimental.
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Visão Geral
Este protocolo descreve a comparação de três métodos diferentes para analisar a proliferação celular em linhagens de células de câncer de mama. Esses métodos incluem contagem convencional de células, viabilidade celular baseada em luminescência e contagem de células utilizando um contador de células, cada um com suas próprias vantagens para medições reprodutíveis.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Pesquisa sobre Câncer
- Ensaios de Proliferação Celular
Contexto
- A compreensão da proliferação celular é fundamental na pesquisa do câncer.
- Diferentes ensaios podem gerar resultados e informações variados.
- A preparação e execução desses ensaios exigem habilidades específicas.
- As linhagens celulares MCF-7 são comumente utilizadas em estudos de câncer de mama.
Objetivo do Estudo
- Comparar a eficácia de três métodos de proliferação celular.
- Identificar o método mais apropriado para necessidades específicas de pesquisa.
- Fornecer um protocolo detalhado para pesquisadores.
Métodos Utilizados
- Contagem convencional de células
- Ensaio de viabilidade celular baseado em luminescência
- Contagem de células utilizando um imageador celular
- Preparação de linhagens celulares MCF-7 em cultura
Resultados Principais
- Cada método possui vantagens e desvantagens distintas.
- O imageamento celular exige preparação cuidadosa e foco.
- A contagem convencional é simples, mas pode apresentar baixa sensibilidade.
- Os ensaios de luminiscência fornecem dados quantitativos sobre viabilidade.
Conclusões
- Escolher o ensaio de proliferação adequado é essencial para obter resultados precisos.
- Os pesquisadores devem considerar os requisitos específicos de seus estudos.
- Recomenda-se o treinamento no uso de métodos avançados, como o imageamento celular.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação confiável da proliferação celular é fundamental para a descoberta precoce em oncologia, permitindo a validação robusta de alvos e a avaliação comparativa dos efeitos de compostos em modelos de câncer de mama. A seleção do ensaio de proliferação ideal influencia a confiança preditiva, a escalabilidade do ensaio e a reprodutibilidade entre estudos, afetando diretamente o triagem de portfólios e os fluxos de trabalho de triagem downstream. O rigor metodológico na medição da proliferação celular sustenta decisões de avanço ajustadas ao risco e a padronização de ensaios em toda a empresa.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação quantitativa de hipóteses terapêuticas em linhagens celulares de câncer de mama.
- Apóia a validação funcional de alvos mediante a medição de alterações na proliferação em resposta a perturbações genéticas ou farmacológicas.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas por meio da análise comparativa dos resultados de proliferação entre métodos.
- Fornece continuidade dos dados para confiança preditiva na tomada de decisões em estágios iniciais.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Estabelece ensaios validados e reprodutíveis de proliferação para campanhas de triagem de compostos.
- Apoia a padronização e escalabilidade dos ensaios, especialmente com plataformas baseadas em luminescência e em imagem.
- Permite prontidão para alto rendimento e reutilização da plataforma para diversas bibliotecas de compostos.
- Fornece saídas quantitativas adequadas para comparações robustas entre diferentes condições.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha métricas de proliferação in vitro com modelos de câncer de mama relevantes para a doença.
- Fornece dados morfológicos e de confluência por meio de imagens, apoiando a exploração de biomarcadores translacionais.
- Permite continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, por meio do suporte ao monitoramento longitudinal.
- Reduz a ambiguidade biológica na seleção de candidatos pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Esses ensaios de proliferação integram-se desde a descoberta inicial até a identificação de compostos promissores, apoiando tanto testes de hipóteses quanto fluxos de triagem nas pesquisas e desenvolvimentos em oncologia.
- Biologia da Descoberta: A medição quantitativa da proliferação esclarece a atividade da via e valida o engajamento do alvo.
- Triagem: A reprodutibilidade e escalabilidade do ensaio permitem a avaliação confiável de compostos e a triagem de hits.
- Análises: Resultados estatísticos, incluindo análises de correlação e regressão, facilitam a comparação de métodos e decisões baseadas em dados.
- Pesquisa Translacional: Métodos baseados em imagem fornecem insights morfológicos relevantes para modelos de doenças.
- Reutilização Corporativa: Protocolos padronizados apoiam a implantação de ensaios entre programas e a harmonização de dados.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em leituras baseadas na proliferação.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e produtividade do ensaio entre equipes de P&D.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir ou não prosseguir e otimiza a alocação de recursos ao permitir análises comparativas robustas.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização e o avanço ajustados ao risco dos ativos em oncologia.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência técnica em cultura celular, microscopia e configuração de ensaios de luminiscência.
- Exige acesso a leitores multifuncionais de microplacas, sistemas de imagem celular e infraestrutura de software analítico.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de ensaio e dos fluxos de análise de dados.
- A adaptação em diferentes linhagens celulares ou modelos de doenças pode exigir otimização do protocolo.
- Cada método apresenta compromissos entre sensibilidade, produtividade e riqueza de dados, que devem ser ajustados às necessidades do projeto.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Title
0:38
Preparing Cells for Proliferation Assays
2:49
Determining Cell Count Using a Hemocytometer
4:21
Determining Cell Proliferation Using Luminescence-based Assay
7:02
Determining Cell Count Using a Cell Imager
10:40
Results: Comparison of Three Different Methods Measuring Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines
12:10
Conclusion
