Name: Visualizando bactérias em nematóides por microscopia de fluorescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Aprenda a visualizar bactérias Xenorhabdus em nematóides Steinernema por microscopia de fluorescência. Este método permite estudar a localização bacteriana e a frequência de associação em populações de hospedeiros.

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Os autores agradecem a Eugenio Vivas, Kurt Heungens, Eric Martens, Charles Cowles, Darby Açúcar, Eric Stabb, e Todd Ciche por suas contribuições para o desenvolvimento deste protocolo e as ferramentas utilizadas. KEM e JMC foram apoiados pelo National Institutes of Health (NIH) Prêmio Nacional de Serviço de Pesquisa T32 (AI55397 &quot;Micróbios na saúde e na doença&quot;). JMC foi apoiado pela National Science Foundation (NSF) graduação Bolsa de Investigação. Este trabalho foi suportado por concessões do National Science Foundation (IOS-0920631 e IOS-0950873).

<ol><li>Holterman, M., van der Wurff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylum-wide+analysis+of+SSU+rDNA+reveals+deep+phylogenetic+relationships+among+nematodes+and+accelerated+evolution+toward+crown+clades%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Phylum-wide analysis of SSU rDNA reveals deep phylogenetic relationships among nematodes and accelerated evolution toward crown clades.</a> Mol. Biol. Evol. 23, 1792-1800 (2006).</li>
<li>Lambshead, P. J. D., Boucher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+nematode+deep-sea+biodiversity+-+hyperdiverse+or+hype%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biogeogr%22%5BJournal%5D)">Marine nematode deep-sea biodiversity - hyperdiverse or hype.</a> J. Biogeogr. 30, 475-485 (2003).</li>
<li>Poinar, G. O. J., Thomas, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+Achromobacter+nematophilus+Poinar+and+Thomas+%28Achromobacteraceae%3A+Eubacteriales%29+in+the+development+of+the+nematode%2C+DD-136+%28Neoaplectana+sp.+Steinernematidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol%22%5BJournal%5D)">Significance of Achromobacter nematophilus Poinar and Thomas (Achromobacteraceae: Eubacteriales) in the development of the nematode, DD-136 (Neoaplectana sp. Steinernematidae).</a> Parasitol. 56, 385-390 (1966).</li>
<li>Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friend+and+foe%3A+the+two+faces+of+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).</li>
<li>Kaya, H. K., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic nematodes.</a> Annu. Rev. Entomol. 38, 181-206 (1993).</li>
<li>Bird, A. F., Akhurst, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nature+of+the+intestinal+vesicle+in+nematodes+of+the+family+Steinernematidae%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">The nature of the intestinal vesicle in nematodes of the family Steinernematidae.</a> Int. J. Parasitol. 13, 599-606 (1983).</li>
<li>Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Steinernema+carpocapsae+intestinal+vesicle+contains+a+subcellular+structure+with+which+Xenorhabdus+nematophila+associates+during+colonization+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Steinernema carpocapsae intestinal vesicle contains a subcellular structure with which Xenorhabdus nematophila associates during colonization initiation.</a> Cell. Microbiol. 7, 1723-1735 (2005).</li>
<li>Snyder, H. A., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+colonization+and+release+process+of+Xenorhabdus+nematophila+and+the+morphology+and+ultrastructure+of+the+bacterial+receptacle+of+its+nematode+host%2C+Steinernema+carpocapsae%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New insights into the colonization and release process of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 5338-5346 (2007).</li>
<li>Abebe, E., Abebe-Akele, F., Morrison, J., Cooper, V., Thomas, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insect+pathogenic+symbiosis+between+a+Caenorhabditis+and+Serratia%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">An insect pathogenic symbiosis between a Caenorhabditis and Serratia.</a> Virulence. 2, 158-161 (2011).</li>
<li>Abebe, E., Jumba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+entomopathogenic+Caenorhabditis+briggsae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">An entomopathogenic Caenorhabditis briggsae.</a> J. Exp. Biol. 213, 3223-3229 (2010).</li>
<li>Torres-Barragan, A., Suazo, A., Buhler, W. G., Cardoza, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+entomopathogenicity+and+bacterial+associates+of+the+nematode+Oscheius+carolinensis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Control%22%5BJournal%5D)">Studies on the entomopathogenicity and bacterial associates of the nematode Oscheius carolinensis.</a> Biol. Control. 59, 123-129 (2011).</li>
<li>Ye, W. M., Torres-Barragan, A., Cardoza, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscheius+carolinensis+n.+sp+%28Nematoda%3A+Rhabditidae%29%2C+a+potential+entomopathogenic+nematode+from+vermicompost%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Oscheius carolinensis n. sp (Nematoda: Rhabditidae), a potential entomopathogenic nematode from vermicompost.</a> Nematology. 12, 121-135 (2010).</li>
<li>Zhang, C., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterorhabditidoides+chongmingensis+gen.+nov.%2C+sp.+nov.+%28Rhabditida%3A+Rhabditidae%29%2C+a+novel+member+of+the+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invertebr.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Heterorhabditidoides chongmingensis gen. nov., sp. nov. (Rhabditida: Rhabditidae), a novel member of the entomopathogenic nematodes.</a> J. Invertebr. Pathol. 98, 153-168 (2008).</li>
<li>Martens, E. C., Heungens, K., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+colonization+events+in+the+mutualistic+association+between+Steinernema+carpocapsae+nematodes+and+Xenorhabdus+nematophila+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Early colonization events in the mutualistic association between Steinernema carpocapsae nematodes and Xenorhabdus nematophila bacteria.</a> J. Bacteriol. 185, 3147-3154 (2003).</li>
<li>Ciche, T. A., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+the+insect+pathogen%2C+Photorhabdus+luminescens%2C+which+end+of+a+nematode+is+out%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">For the insect pathogen, Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).</li>
<li>Ciche, T. A., Kim, K. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Nguyen, K. C., Hall, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+invasion+and+matricide+during+Photorhabdus+luminescens+transmission+by+Heterorhabditis+bacteriophora+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell invasion and matricide during Photorhabdus luminescens transmission by Heterorhabditis bacteriophora nematodes.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 2275-2287 (2008).</li>
<li>Easom, C. A., Joyce, S. A., Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+involved+in+the+mutualistic+colonization+of+the+nematode+Heterorhabditis+bacteriophora+by+the+bacterium+Photorhabdus+luminescens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of genes involved in the mutualistic colonization of the nematode Heterorhabditis bacteriophora by the bacterium Photorhabdus luminescens.</a> BMC Microbiol. 10, 45(2010).</li>
<li>Somvanshi, V. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Kim, K. S., Mallon, S., Ciche, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photorhabdus+phase+variants+express+a+novel+fimbrial+locus%2C+mad%2C+essential+for+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Photorhabdus phase variants express a novel fimbrial locus, mad, essential for symbiosis.</a> Mol. Microbiol. 77, 1021-1038 (2010).</li>
<li>Martens, E. C., Russell, F. M., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Xenorhabdus+nematophila+metabolic+mutants+yields+insight+into+stages+of+Steinernema+carpocapsae+nematode+intestinal+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Xenorhabdus nematophila metabolic mutants yields insight into stages of Steinernema carpocapsae nematode intestinal colonization.</a> Mol. Microbiol. 51, 28-45 (2005).</li>
<li>Sugar, D. R., Murfin, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+variation+and+host+interactions+of+Xenorhabdus+bovienii+SS-2004%2C+the+entomopathogenic+symbiont+of+Steinernema+jollieti+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Env.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic variation and host interactions of Xenorhabdus bovienii SS-2004, the entomopathogenic symbiont of Steinernema jollieti nematodes.</a> Env. Microbiol. 14, 924-939 (2012).</li>
<li>Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenorhabdus+nematophila+nilABC+genes+confer+the+ability+of+Xenorhabdus+spp.+to+colonize+Steinernema+carpocapsae+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Xenorhabdus nematophila nilABC genes confer the ability of Xenorhabdus spp. to colonize Steinernema carpocapsae nematodes.</a> J. Bacteriol. 190, 4121-4128 (2008).</li>
<li>Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Xenorhabdus+nematophila+genes+required+for+mutualistic+colonization+of+Steinernema+carpocapsae+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes.</a> Mol. Microbiol. 45, 1337-1353 (2002).</li>
<li>Goetsch, M., Owen, H., Goldman, B., Forst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+PixA+inclusion+body+protein+of+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the PixA inclusion body protein of Xenorhabdus nematophila.</a> J. Bacteriol. 188, 2706-2710 (2006).</li>
<li>Bhasin, A., Chaston, J. M., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+Analyses+Reveal+Overall+Topology+and+Functional+Regions+of+NilB%2C+a+Bacterial+Outer+Membrane+Protein+Required+for+Host+Association+in+a+Model+of+Animal-Microbe+Mutualism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Mutational Analyses Reveal Overall Topology and Functional Regions of NilB, a Bacterial Outer Membrane Protein Required for Host Association in a Model of Animal-Microbe Mutualism.</a> J. Bacteriol. 194, 1763-1776 (2012).</li>
<li>Ciche, T. A., Goffredi, S. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCiche%2C+TA+%22Methods+in+General+and+Molecular+Microbiology%22">Methods in General and Molecular Microbiology</a>. Reddy, C. A. , ASM Press. 394-419 (2007).</li>
<li>Goodrich-Blair, H., Clarke, D., Grewal, P. S., Ciche, T. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoodrich-Blair%2C+H+%22Insect+Pathogens%2C+Molecular+Approaches+and+Techniques%22">Insect Pathogens, Molecular Approaches and Techniques</a>. Stock, S. P., Boemare, N., Vandenberg, J., Glazar, I. , CABI Publishing. 239-269 (2009).</li>
<li>Stock, S. P., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStock%2C+SP+%22Manual+of+Techniques+in+Invertebrate+Pathology%22">Manual of Techniques in Invertebrate Pathology</a>. Lacey, L. A. , Elsevier Press. 375-425 (2012).</li>
<li>Martens, E. C., Gawronski-Salerno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenorhabdus+nematophila+requires+an+intact+iscRSUA-hscBA-fdx+locus+to+colonize+Steinernema+carpocapsae+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Xenorhabdus nematophila requires an intact iscRSUA-hscBA-fdx locus to colonize Steinernema carpocapsae nematodes.</a> J. Bacteriol. 185, 3678-3682 (2003).</li>
<li>Vivas, E. I., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenorhabdus+nematophilus+as+a+model+for+host-bacterium+interactions%3A+rpoS+is+necessary+for+mutualism+with+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Xenorhabdus nematophilus as a model for host-bacterium interactions: rpoS is necessary for mutualism with nematodes.</a> J. Bacteriol. 183, 4687-4693 (2001).</li>
<li>White, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+obtaining+infective+nematode+larvae+from+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A method for obtaining infective nematode larvae from cultures.</a> Science. 66, 302-303 (1927).</li>
<li>Ciche, T. A., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+the+insect+pathogen+Photorhabdus+luminescens%2C+which+end+of+a+nematode+is+out%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">For the insect pathogen Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).</li>
<li>Sicard, M., Brun, N. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+native+Xenorhabdus+on+the+fitness+of+their+Steinernema+hosts%3A+contrasting+types+of+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of native Xenorhabdus on the fitness of their Steinernema hosts: contrasting types of interaction.</a> Parasitol. Res. 91, 520-524 (2003).</li>
<li>Lambertsen, L., Sternberg, C., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-Tn7+transposons+for+site-specific+tagging+of+bacteria+with+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mini-Tn7 transposons for site-specific tagging of bacteria with fluorescent proteins.</a> Environ. Microbiol. 6, 726-732 (2004).</li>
<li>Miller, W. G., Leveau, J. H., Lindow, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+gfp+and+inaZ+broad-host-range+promoter-probe+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Int%22%5BJournal%5D)">Improved gfp and inaZ broad-host-range promoter-probe vectors.</a> Mol. Plant Microbe Int. 13, 1243-1250 (2000).</li>
<li>Teal, T. K., Lies, D. P., Wold, B. J., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiometabolic+stratification+of+Shewanella+oneidensis+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatiometabolic stratification of Shewanella oneidensis biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 7324-7330 (2006).</li>
<li>Bao, Y., Lies, D. P., Fu, H., Roberts, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+Tn7-based+system+for+the+single-copy+insertion+of+cloned+genes+into+chromosomes+of+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">An improved Tn7-based system for the single-copy insertion of cloned genes into chromosomes of Gram-negative bacteria.</a> Gene. 109, 167-168 (1991).</li>
<li>Woodring, J. L., Kaya, H. K. Steinernematid and Heterorhabditid Nematodes: A Handbook of Biology and Techniques. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWoodring%2C+JL+%22Southern+Cooperative+Series+Bulletin+331%22">Southern Cooperative Series Bulletin 331</a>. , Arkansas Agricultural Experiment Station. (1988).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O protocolo aqui descrito proporciona um método para a detecção óptica de bactérias dentro de um hospedeiro de nemátodos (Figura 1). Este método tira vantagem da transparência óptica dos nemátodos e a capacidade de bactérias fluorescentes de etiquetas, permitindo a análise in vivo das bactérias dentro do hospedeiro nematóide (Figura 3). Especificamente, esta abordagem identifica a localização de bactérias dentro de seu hospedeiro. Ao contar uma população de nemátodos e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Agar lipídico (Estéril) </td><td></td><td></td><td> 8 gramas de caldo nutriente, 15 gramas de agar de extracto de levedura, 5 gramas de água, 890 ml, 10 ml 0,2 g / ml de MgCl2. 6H 2 0, 96 ml de solução de xarope de milho *, 4 ml de óleo de milho * Mexa mídia ao derramar placas * Adicionar ingrediente estéril após a autoclavagem </td></tr><tr><td> Solução Xarope de milho (Estéril) </td><td></td><td></td><td> 7 ml de xarope de milho, 89 ml de água mistura e autoclave </td></tr><tr><td> Solução ovo </td><td></td><td></td><td> 16,6 ml de hipoclorito de sódio a 12%, 5 ml de KOH 5M, 80 ml de água </td></tr><tr><td> Lisogenia Caldo (Estéril) </td><td></td><td></td><td> 5 gramas de extrato de levedura, triptona 10 gramas, 5 gramas de sal, 1 L de água mistura e autoclave </td></tr><tr><td> Microcentrifugue </td><td> Pescador </td><td> 13-100-675 </td><td> Qualquer microcentrífuga que contém tubos de microcentrífuga funcionará </td></tr><tr><td> Centrifugador </td><td> Beckman </td><td> 366802 </td><td> Centrífuga de topo grande tabela que contém 15 ml e 50 ml, tubos cónicos </td></tr><tr><td> Estéril 60 mm x 15 milímetros prato de Petri </td><td> Pescador </td><td> 0875713 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml tubos de centrífuga </td><td> Pescador </td><td> 05-539-6 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml tubos de centrífuga </td><td> Pescador </td><td> 05-531-6 </td><td></td></tr><tr><td> Estéril 100 mm x 20 milímetros prato de Petri </td><td> Pescador </td><td> 0875711Z </td><td> Mais profundo do padrão pratos de Petri </td></tr><tr><td> Placa de 24 poços </td><td> Greiner Bio-One &lt;/ Td&gt; <td> 662000-06 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio </td><td></td><td></td><td> O microscópio fluorescente necessita de capacidades compatíveis com o fluoróforo </td></tr><tr><td> Paraformaldeído </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15710 </td><td></td></tr><tr><td> PBS (Estéril) </td><td></td><td></td><td> 8 g de NaCl 0,2 g de KCL 1,44 g de Na 2 HPO 4 0,24 g de KH 2 PO 4 1 L de água Ajustar a um pH de 7,4 e 1 L de água a autoclave e </td></tr><tr><td> Tubos de microcentrífuga </td><td> Pescador </td><td> 05-408-138 </td><td> 2 ml ou 1,5 ml tubos </td></tr><tr><td> Sacudidor </td><td></td><td></td><td> Qualquer agitador que faz com que o líquido se mova suavemente vai trabalhar </td></tr><tr><td> Ácido Diaminopimélico </td><td> Sigma </td><td&gt; D-1377 </td><td> Se for necessário, meios de comunicação para completar uma concentração de 1 mM ou </td></tr></tbody></table>

visualizando bactérias em nematóides por microscopia de fluorescência

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Simbioses, a convivência de dois ou mais organismos, são comuns em todos os reinos da vida. Como dois dos organismos mais ubíquos na Terra, nemátodos e bactérias formam uma grande variedade de associações simbióticas que vão desde benéfico para patogénico 1-3. Uma associação como é o relacionamento mutuamente benéfico entre as bactérias e nematóides Steinernema Xenorhabdus, que emergiu como um sistema modelo de simbiose 4. Nematóides entomopatogênicos Steinernema são, usando seu simbionte bacteriano para matar insetos 5. Para a transmissão entre os hospedeiros de insetos, as bactérias colonizam o intestino do nematóide juvenil fase infecciosa 6-8. Recentemente, várias outras espécies de nematóides foram mostrados para utilizar as bactérias para matar insectos 9-13, e começaram investigações examinar as interacções entre os nemátodos e bactérias nestes sistemas &lt;sup&gt; 9. Descreve-se um método para a visualização de um simbionte bacteriano dentro ou sobre um hospedeiro de nematóides, tirando partido da transparência óptica de nemátodos, quando vistas através de microscopia. As bactérias são manipuladas para expressar uma proteína fluorescente, permitindo a sua visualização por microscopia de fluorescência. Estão disponíveis muitos plasmídeos que transportam genes que codificam proteínas que fluorescem a diferentes comprimentos de onda (ou seja, verde ou vermelha), e de conjugação de plasmídeos a partir de uma estirpe de Escherichia coli doador em um receptor symbiont bacteriana é bem sucedida para uma ampla gama de bactérias. Os métodos descritos foram desenvolvidos para investigar a associação entre Steinernema carpocapsae e nematophila Xenorhabdus 14. Métodos semelhantes têm sido utilizados para investigar outros nematóides bactéria associações de 9, 15-18 e, portanto, o método é geralmente aplicável. O Method permite a caracterização da presença de bactérias e de localização dentro de nemátodos em diferentes fases de desenvolvimento, proporcionando insights sobre a natureza da associação e do processo de colonização 14, 16, 19. A análise microscópica revela tanto a frequência dentro de uma população de colonização e localização de bactérias aos tecidos do hospedeiro 14, 16, 19-21. Esta é uma vantagem sobre os outros métodos de monitorização de bactérias dentro das populações de nematóides, tais como a sonicação ou a trituração 22 23, o qual pode fornecer níveis médios de colonização, mas não pode, por exemplo, discriminar populações com uma alta frequência de baixa carga simbióticas de populações com uma baixa freqüência de cargas simbióticas elevados. Discriminando a freqüência ea carga de bactérias colonizadoras pode ser especialmente importante quando a seleção ou caracterização de bactérias mutantes para os fenótipos de colonização 21, 24. Com efeito, a microscopia de fluorescência tem sido utilizada na pesquisa de alto rendimento de mutantes bacterianos para defeitos de colonização 17, 18, ​​e é menos trabalhosa do que outros métodos, incluindo a sonicação 22, 25-27 e dissecção de nemátodos individuais 28, 29.

Para estudar o mutualismo entre<em&gt; Xenorhabdus</em&gt; Bactérias e<em&gt; Steinernema</em&gt; Nemátodos, foram desenvolvidos métodos para monitorizar a presença de bactérias e localização no interior de nemátodos. A abordagem experimental, a qual pode ser aplicada a outros sistemas, implica bactérias engenharia para expressar a proteína fluorescente verde e visualização, por meio de bactérias de microscopia de fluorescência dentro do nemátodo transparente.

Visualizando bactérias em nematóides por microscopia de fluorescência

As simbioses, a convivência de dois ou mais organismos, são generalizadas em todos os reinos da vida. Como dois dos organismos mais onipresentes em...

O objetivo geral deste procedimento é observar simbiontes bacterianos marcados com fluorescência dentro de seu hospedeiro nematoide. Isso é realizado primeiramente marcando as bactérias com uma proteína fluorescente por meio de conjugação. O segundo passo é isolar nematoides AIC coletando ovos.Em seguida, os nematoides AIC são cultivados em combinação com seu simbionte bacteriano marcado com fluorescência para permitir a associação natural e, por fim, a localização do simbionte bacteriano dentro do hospedeiro nematoide. A frequência dessa associação dentro da população de nematoides pode ser determinada por microscopia de fluorescência. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de simbiose, como onde as bactérias se localizam dentro de seus hospedeiros e qual é a distribuição do transporte bacteriano ao longo de uma população de hospedeiros?Após o crescimento noturno das cepas bacterianas, subcultive as cepas doadoras, receptoras e auxiliares em meio de crescimento rico em nutrientes, sem antibióticos, numa proporção de um para 100 de cultura para meio, e então cultive as culturas na temperatura apropriada para cada cepa até atingirem o estágio de crescimen

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Biology

Biologia

Nós apresentamos um método para visualizar cutícula ao...

Visualização de Caenorhabditis elegans Estruturas cutícula Usando o Dye lipofílicos Vital, DII

Fonte: Chetrit, D., et al. Aplicação de imagens de células vivas e tomografia crioeletrônica para resolver características espaçotemporais do sistema de secreção Dot/ICM da Legionella pneumophila . J. Vis. Exp. (2020).Este vídeo demonstra a preparação e a imagem de bactérias patogênicas marcadas com fluorescência. As almofadas de agarose são primeiro preparadas e posicionadas dentro de uma moldura adesiva. Uma suspensão de bactérias geneticamente modificadas que expressam uma proteína...

Preparação de amostras e imagem de bactérias marcadas com fluorescência

Este vídeo demonstra a avaliação dos efeitos neurodegenerativos de um produto químico em Caenorhabditis elegans com neurônios marcados com fluorescência. Os neurônios normais mostram fluorescência brilhante do soma e processos intactos, enquanto a fluorescência diminuída, o soma inchado e os processos pontuados indicam neurodegeneração.

Estudando o efeito de pesticidas nos neurônios de Caenorhabditis elegans

Este vídeo demonstra o procedimento para imagens in vivo de C. elegans expressando proteínas semelhantes a príons marcadas com proteína fluorescente vermelha. O protocolo envolve a imobilização de nematóides em uma almofada de agarose para microscopia confocal de lapso de tempo, revelando agregação e transporte de proteínas dentro e entre as células. Essa técnica é crucial para o estudo da agregação de proteínas relacionadas a doenças neurodegenerativas.

Imagens de lapso de tempo para monitorar a disseminação transcelular de proteínas semelhantes a príons em nematóides transgênicos

O transparente c. elegans intestino pode servir como uma"em vivo câmara de tecido" para estudar a biogênese de membrana e lúmen apicobasal nível unicelular e subcellular durante tubulogenesis multicelulares. Este protocolo descreve como combinar padrão de rotulagem, genética/perda--função de RNAi e abordagens microscópicas para dissecar esses processos em um nível molecular.

O c. elegans intestino como um modelo para intercelular Lumen morfogênese e In Vivo biogênese de membrana polarizada no nível de célula única: rotulagem por anticorpos, RNAi perda--função de análise e de imagem

A fluorescência de imagens ao longo da vida monitora, quantifica e distingue as tendências de agregação de proteínas em modelos de doença susturais de C. elegans vivos, envelhecidos e estressados.

Caracterização de estruturas amilóides em Envelhecimento C. Elegans usando imagem de fluorescência ao longo da vida

Apresentado aqui é um protocolo para monitorar a degradação da proteína huntingtin fundida ao fluorohore fotoconvertível Dendra2.

In Vivo Quantificação do Volume de Negócios de Proteínas no Envelhecimento C. Elegans usando Dendra2 Fotoconvertível

Os nematoides de caenorhabditis para jovens adultos são expostos a diferentes concentrações de pesticidas comerciais ou outros tóxicos por 2-24 h. Em seguida, diferentes neurônios podem ser visualizados usando cepas fluorescentes. Este artigo demonstra como expor nematoides a pesticidas e avaliar danos aos neurônios.

Examinando o efeito dos pesticidas em Caenorhabditis elegans Neurônios

Micróbios intestinais, incluindo bactérias extracelulares e patógenos intracelulares como o vírus Orsay e microsporídios (fungos), são frequentemente associados a nematoides selvagens de Caenorhabditis . Este artigo apresenta um protocolo para detecção e quantificação de micróbios que colonizam e/ou infectam nematoides de C. elegans e para medir a carga de patógenos após infecções controladas em laboratório.

Hibridização in situ por fluorescência de RNA (FISH) para visualizar colonização microbiana e infecção em intestinos de Caenorhabditis elegans

Este protocolo descreve uma interrupção de 96 poços de caenorhabditis colonizada individualmente elegans após paralisia fria e branqueamento superficial para remover bactérias externas. A suspensão resultante é emplacada em placas de ágar para permitir quantificação precisa e média de carga bacteriana em um grande número de vermes individuais.

Usando dados de verme único para quantificar a heterogeneidade em Interações elegans-bacterianas de Caenorhabditis

O artigo descreve a otimização dos parâmetros de aquisição da microscopia de fluorescência para visualizar o transporte axonal de cargas marcadas endógenas com resolução de neurônio único em um nematóide vivo.

Otimizando a visualização do transporte axonal de carga endógena por microscopia de fluorescência em Caenorhabditis elegans vivos

Aprenda a visualizar bactérias Xenorhabdus em nematóides Steinernema por microscopia de fluorescência. Este método permite estudar a localização bacteriana e a frequência de associação em populações de hospedeiros.

Visualizando bactérias em nematóides por microscopia de fluorescência

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