Visualizando bactérias em nematóides por microscopia de fluorescência

O objetivo geral deste procedimento é observar a simbiância bacteriana marcada com fluorescência dentro de seu hospedeiro nematóide. Isso é feito primeiro marcando as bactérias com uma proteína fluorescente por meio de conjugação. O segundo passo é isolar os nematóides AIC colhendo ovos.

Em seguida, os nematóides AIC são cultivados em combinação com seu simbiante bacteriano marcado com fluorescência para permitir a associação natural, em última análise, a localização do simbiante bacteriano dentro do hospedeiro nematóide. E a frequência dessa associação dentro da população de nematóides pode ser determinada por microscopia de fluorescência. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da simbiose, como onde as bactérias se localizam dentro de seu hospedeiro e qual é a distribuição do transporte bacteriano em uma população hospedeira?

Após o crescimento noturno das cepas bacterianas, subcultura, receptor doador e cepas auxiliares em meios de crescimento ricos em nutrientes sem antibióticos em uma proporção de um para 100 de cultura para meio, em seguida, cultive as culturas na temperatura apropriada para cada cepa até atingirem o estágio médio de crescimento logarítmico. Em seguida, combine as cepas em um único tubo de microcentrífuga e centrifugue as culturas mistas por dois minutos A 17.900 Gs, decantar o sobrenadante e penear o pellet em 30 microlitros de meio fresco. Em seguida, coloque a suspensão em uma placa de mídia rica em nutrientes sem antibióticos e deixe a mancha secar quando a suspensão secar.

Incubar a placa invertida durante a noite a uma temperatura ideal para a bactéria receptora e permitida para o dador e ajudante, se aplicável. Agora, raspe o local e a faixa para colônias únicas em uma placa de antibiótico seletivo para obter uma cultura pura de bactérias, uma única colônia para isolamento. Finalmente, certifique-se de que as colônias resultantes sejam o receptor simbiante e não a cepa doadora.

Rastreando a presença de fenótipos específicos do receptor. Por exemplo, a bactéria cino abdi pode ser distinguida da e coli realizando um teste de catalisador rastreado para a presença do plasmídeo, confirmando a fluorescência sob o comprimento de onda correspondente à proteína do plasmídeo fluorescente. Depois de cultivar o simbiante bacteriano natural durante a noite, espalhe 600 microlitros da cultura bacteriana em oito a 10, 10 milímetros de lipídio e, em seguida, incube as placas no escuro sem umidade a 25 graus Celsius.

Após dois dias, adicione 5.000 nematóides juvenis infecciosos em 500 microlitros de meio aos gramados bacterianos. Depois de incubar as placas a 25 graus Celsius por mais três dias, coloque 20 microlitros de água em uma lâmina de microscópio. Em seguida, use um bastão estéril para raspar uma pequena quantidade de nematóides do gramado de bactérias.

Coloque o bastão na água para permitir que os nematóides nadem para fora. Olhe para este slide em baixa ampliação. Se os ovos e as fêmeas estiverem visíveis, continue quando as fêmeas contiverem ovos, coloque alguns mililitros de água na superfície das placas, gire suavemente as placas e despeje a água em um tubo cônico de 50 mililitros.

Os nematóides devem sair das placas e não ser mais visíveis na superfície da placa. Deixe os nematóides se depositarem no fundo do tubo, depois canalize o excesso de água do topo do tubo e encha novamente o tubo com água limpa. Depois de permitir que os nematóides adultos se assentem e pipetar o excesso de água mais uma vez, encha os tubos cônicos com solução de ovo.

Em seguida, misture os tubos por inversão suave por exatamente 10 minutos em temperatura ambiente. Depois de agitar imediatamente centrifugar os tubos cónicos durante exactamente 10 minutos a 1 250 Gs e à temperatura ambiente com a ruptura ligada. Em seguida, decantar rapidamente o sobrenadante, ressuspender o pellet com solução de ovo pipetando e encher o tubo cónico com solução de ovo fresco.

Misture bem a suspensão de ovos invertendo o tubo três a cinco vezes e, em seguida, peletizando imediatamente os ovos e decantando o sobrenadante como acabamos de mostrar. Ressuspenda o pellet em misoginia, caldo ou LB pipetagem e, em seguida, transfira a suspensão do ovo para um tubo cônico de 15 mililitros. Agora encha o tubo de 15 mililitros com lb, lave os ovos três vezes no caldo usando a mesma técnica de passo rápido que acabamos de demonstrar e, em seguida, dilua os ovos de nematóides P ressuspensos para pelo menos 10 ovos por microlitro.

Transfira os ovos para uma placa de Petri de seis centímetros contendo cinco mililitros de LB e antibióticos contra bactérias colonizadoras. A placa pode ser armazenada embrulhada em perfil por até quatro dias após o crescimento noturno e a seleção das bactérias fluorescentes. Use um bastão estéril para espalhar 600 microlitros da cultura bacteriana em aerados lipídicos de 10 milímetros e incubar a cultura a 25 graus Celsius.

Após dois dias, dispense 500 a 5.000 ovos de nematóides em cada placa lipídica. Se o prato tiver sido armazenado, lave os ovos em 15 mililitros de LB, conforme demonstrado, pelo menos uma vez antes de inocular os ovos nos gramados bacterianos previamente preparados. Em seguida, incube as bactérias nematóides no escuro sem umidade a 25 graus Celsius até que os juvenis infectantes apareçam como um anel branco difuso na borda da placa.

Quando os juvenis infectantes foram observados. Remova a tampa da placa de ágar lipídico e coloque o fundo da placa no fundo de uma placa de Petri vazia de 100 milímetros por 20 milímetros. Em seguida, encha a placa de Petri com água suficiente para atingir cerca de metade da altura da placa menor e incube a armadilha de água até que os juvenis infectantes da progênie tenham emergido na água.

Depois de coletar os nematóides da água ou no estágio de vida desejado do gramado bacteriano apropriado, dissolva alguns grãos de ole em 30 microlitros de água e em um a dois microlitros desse agente paralisante para cada 50 microlitros de amostra de nematóide. Em seguida, transfira cerca de 20 a 30 microlitros da amostra de nematóide paralisado para uma lâmina de microscópio e coloque uma lamínula em cima da amostra. Visualize os nematóides usando microscopia de luz para garantir que os nematóides estejam no campo de visão.

Para identificar a localização bacteriana. Fotografe os nematóides sob microscopia fluorescente, além da configuração de microscopia de luz e, em seguida, sobreponha as imagens. Pode ser necessário tentar várias ampliações e visualizações do nematóide para encontrar a bactéria.

Uma população de nematóides de dois meios foi contada e pontuada para colonização pelo simbiante bacteriano. Para estatísticas robustas, é melhor contar pelo menos 100 nematóides por amostra, com pelo menos 30 se enquadrando em cada categoria, conforme visto na tabela. Esses nematóides são colonizados em um nível de aproximadamente 14,6% quando cultivados em ágar lipídico e 68,6% quando cultivados em ágar fígado e rim.

Outras espécies de nematóides e bactérias demonstraram ter diferentes níveis de colonização. Este esquema ilustra a aparência geral das fêmeas Steiner NEMA. A inserção mostra a imagem de contraste de interferência diferencial de uma fêmea gráfica S fot com ampliação de 20x.

A seta preta na inserção indica a vulva, enquanto as setas brancas indicam ovos visíveis. Esta imagem mostra um ovo de nematóide volt desenvolvido, mas não eclodido, com ampliação de 40 x, e esses ovos isolados de nematóides Volta foram fotografados com ampliação de 10 x. Aqui, imagens de microscópio representativas de nematóides Steiner Nima associados à bactéria Xeno aptus são mostradas nesta primeira imagem.

Os nematóides de Alvin foram associados à sua exposição de simbiantes bacterianos expressando GFP para criar esta imagem composta. Uma imagem de contraste de fase foi sobreposta com uma imagem fluorescente. A seta indica a bactéria presente no nematóide juvenil infeccioso.

Esta imagem mostra um nematóide juvenil S carpa capsi com GFP expressando X nla. A imagem foi construída de maneira semelhante à imagem anterior e mostra o nematóide juvenil com bactérias marcadas com proteína fluorescente verde visualizadas como os bastonetes verdes localizados em todo o lúmen intestinal do nematóide. Além do procedimento descrito, outros métodos, como a manipulação genética do simbiante bacteriano antes da associação com o hospedeiro nematóide, podem ser incorporados para responder a perguntas adicionais, como quais são os mecanismos moleculares necessários para a associação do micróbio hospedeiro.