Name: Visualizando bactérias em nematóides por microscopia de fluorescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Aprenda a visualizar bactérias Xenorhabdus em nematóides Steinernema por microscopia de fluorescência. Este método permite estudar a localização bacteriana e a frequência de associação em populações de hospedeiros.

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Os autores agradecem a Eugenio Vivas, Kurt Heungens, Eric Martens, Charles Cowles, Darby Açúcar, Eric Stabb, e Todd Ciche por suas contribuições para o desenvolvimento deste protocolo e as ferramentas utilizadas. KEM e JMC foram apoiados pelo National Institutes of Health (NIH) Prêmio Nacional de Serviço de Pesquisa T32 (AI55397 &quot;Micróbios na saúde e na doença&quot;). JMC foi apoiado pela National Science Foundation (NSF) graduação Bolsa de Investigação. Este trabalho foi suportado por concessões do National Science Foundation (IOS-0920631 e IOS-0950873).

<ol><li>Holterman, M., van der Wurff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylum-wide+analysis+of+SSU+rDNA+reveals+deep+phylogenetic+relationships+among+nematodes+and+accelerated+evolution+toward+crown+clades%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Phylum-wide analysis of SSU rDNA reveals deep phylogenetic relationships among nematodes and accelerated evolution toward crown clades.</a> Mol. Biol. Evol. 23, 1792-1800 (2006).</li>
<li>Lambshead, P. J. D., Boucher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+nematode+deep-sea+biodiversity+-+hyperdiverse+or+hype%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biogeogr%22%5BJournal%5D)">Marine nematode deep-sea biodiversity - hyperdiverse or hype.</a> J. Biogeogr. 30, 475-485 (2003).</li>
<li>Poinar, G. O. J., Thomas, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+Achromobacter+nematophilus+Poinar+and+Thomas+%28Achromobacteraceae%3A+Eubacteriales%29+in+the+development+of+the+nematode%2C+DD-136+%28Neoaplectana+sp.+Steinernematidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol%22%5BJournal%5D)">Significance of Achromobacter nematophilus Poinar and Thomas (Achromobacteraceae: Eubacteriales) in the development of the nematode, DD-136 (Neoaplectana sp. Steinernematidae).</a> Parasitol. 56, 385-390 (1966).</li>
<li>Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friend+and+foe%3A+the+two+faces+of+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).</li>
<li>Kaya, H. K., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic nematodes.</a> Annu. Rev. Entomol. 38, 181-206 (1993).</li>
<li>Bird, A. F., Akhurst, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nature+of+the+intestinal+vesicle+in+nematodes+of+the+family+Steinernematidae%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">The nature of the intestinal vesicle in nematodes of the family Steinernematidae.</a> Int. J. Parasitol. 13, 599-606 (1983).</li>
<li>Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Steinernema+carpocapsae+intestinal+vesicle+contains+a+subcellular+structure+with+which+Xenorhabdus+nematophila+associates+during+colonization+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Steinernema carpocapsae intestinal vesicle contains a subcellular structure with which Xenorhabdus nematophila associates during colonization initiation.</a> Cell. Microbiol. 7, 1723-1735 (2005).</li>
<li>Snyder, H. A., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+colonization+and+release+process+of+Xenorhabdus+nematophila+and+the+morphology+and+ultrastructure+of+the+bacterial+receptacle+of+its+nematode+host%2C+Steinernema+carpocapsae%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New insights into the colonization and release process of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 5338-5346 (2007).</li>
<li>Abebe, E., Abebe-Akele, F., Morrison, J., Cooper, V., Thomas, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insect+pathogenic+symbiosis+between+a+Caenorhabditis+and+Serratia%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">An insect pathogenic symbiosis between a Caenorhabditis and Serratia.</a> Virulence. 2, 158-161 (2011).</li>
<li>Abebe, E., Jumba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+entomopathogenic+Caenorhabditis+briggsae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">An entomopathogenic Caenorhabditis briggsae.</a> J. Exp. Biol. 213, 3223-3229 (2010).</li>
<li>Torres-Barragan, A., Suazo, A., Buhler, W. G., Cardoza, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+entomopathogenicity+and+bacterial+associates+of+the+nematode+Oscheius+carolinensis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Control%22%5BJournal%5D)">Studies on the entomopathogenicity and bacterial associates of the nematode Oscheius carolinensis.</a> Biol. Control. 59, 123-129 (2011).</li>
<li>Ye, W. M., Torres-Barragan, A., Cardoza, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscheius+carolinensis+n.+sp+%28Nematoda%3A+Rhabditidae%29%2C+a+potential+entomopathogenic+nematode+from+vermicompost%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Oscheius carolinensis n. sp (Nematoda: Rhabditidae), a potential entomopathogenic nematode from vermicompost.</a> Nematology. 12, 121-135 (2010).</li>
<li>Zhang, C., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterorhabditidoides+chongmingensis+gen.+nov.%2C+sp.+nov.+%28Rhabditida%3A+Rhabditidae%29%2C+a+novel+member+of+the+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invertebr.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Heterorhabditidoides chongmingensis gen. nov., sp. nov. (Rhabditida: Rhabditidae), a novel member of the entomopathogenic nematodes.</a> J. Invertebr. Pathol. 98, 153-168 (2008).</li>
<li>Martens, E. C., Heungens, K., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+colonization+events+in+the+mutualistic+association+between+Steinernema+carpocapsae+nematodes+and+Xenorhabdus+nematophila+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Early colonization events in the mutualistic association between Steinernema carpocapsae nematodes and Xenorhabdus nematophila bacteria.</a> J. Bacteriol. 185, 3147-3154 (2003).</li>
<li>Ciche, T. A., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+the+insect+pathogen%2C+Photorhabdus+luminescens%2C+which+end+of+a+nematode+is+out%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">For the insect pathogen, Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).</li>
<li>Ciche, T. A., Kim, K. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Nguyen, K. C., Hall, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+invasion+and+matricide+during+Photorhabdus+luminescens+transmission+by+Heterorhabditis+bacteriophora+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell invasion and matricide during Photorhabdus luminescens transmission by Heterorhabditis bacteriophora nematodes.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 2275-2287 (2008).</li>
<li>Easom, C. A., Joyce, S. A., Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+involved+in+the+mutualistic+colonization+of+the+nematode+Heterorhabditis+bacteriophora+by+the+bacterium+Photorhabdus+luminescens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of genes involved in the mutualistic colonization of the nematode Heterorhabditis bacteriophora by the bacterium Photorhabdus luminescens.</a> BMC Microbiol. 10, 45(2010).</li>
<li>Somvanshi, V. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Kim, K. S., Mallon, S., Ciche, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photorhabdus+phase+variants+express+a+novel+fimbrial+locus%2C+mad%2C+essential+for+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Photorhabdus phase variants express a novel fimbrial locus, mad, essential for symbiosis.</a> Mol. Microbiol. 77, 1021-1038 (2010).</li>
<li>Martens, E. C., Russell, F. M., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Xenorhabdus+nematophila+metabolic+mutants+yields+insight+into+stages+of+Steinernema+carpocapsae+nematode+intestinal+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Xenorhabdus nematophila metabolic mutants yields insight into stages of Steinernema carpocapsae nematode intestinal colonization.</a> Mol. Microbiol. 51, 28-45 (2005).</li>
<li>Sugar, D. R., Murfin, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+variation+and+host+interactions+of+Xenorhabdus+bovienii+SS-2004%2C+the+entomopathogenic+symbiont+of+Steinernema+jollieti+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Env.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic variation and host interactions of Xenorhabdus bovienii SS-2004, the entomopathogenic symbiont of Steinernema jollieti nematodes.</a> Env. Microbiol. 14, 924-939 (2012).</li>
<li>Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenorhabdus+nematophila+nilABC+genes+confer+the+ability+of+Xenorhabdus+spp.+to+colonize+Steinernema+carpocapsae+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Xenorhabdus nematophila nilABC genes confer the ability of Xenorhabdus spp. to colonize Steinernema carpocapsae nematodes.</a> J. Bacteriol. 190, 4121-4128 (2008).</li>
<li>Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Xenorhabdus+nematophila+genes+required+for+mutualistic+colonization+of+Steinernema+carpocapsae+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes.</a> Mol. Microbiol. 45, 1337-1353 (2002).</li>
<li>Goetsch, M., Owen, H., Goldman, B., Forst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+PixA+inclusion+body+protein+of+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the PixA inclusion body protein of Xenorhabdus nematophila.</a> J. Bacteriol. 188, 2706-2710 (2006).</li>
<li>Bhasin, A., Chaston, J. M., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+Analyses+Reveal+Overall+Topology+and+Functional+Regions+of+NilB%2C+a+Bacterial+Outer+Membrane+Protein+Required+for+Host+Association+in+a+Model+of+Animal-Microbe+Mutualism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Mutational Analyses Reveal Overall Topology and Functional Regions of NilB, a Bacterial Outer Membrane Protein Required for Host Association in a Model of Animal-Microbe Mutualism.</a> J. Bacteriol. 194, 1763-1776 (2012).</li>
<li>Ciche, T. A., Goffredi, S. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCiche%2C+TA+%22Methods+in+General+and+Molecular+Microbiology%22">Methods in General and Molecular Microbiology</a>. Reddy, C. A. , ASM Press. 394-419 (2007).</li>
<li>Goodrich-Blair, H., Clarke, D., Grewal, P. S., Ciche, T. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoodrich-Blair%2C+H+%22Insect+Pathogens%2C+Molecular+Approaches+and+Techniques%22">Insect Pathogens, Molecular Approaches and Techniques</a>. Stock, S. P., Boemare, N., Vandenberg, J., Glazar, I. , CABI Publishing. 239-269 (2009).</li>
<li>Stock, S. P., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStock%2C+SP+%22Manual+of+Techniques+in+Invertebrate+Pathology%22">Manual of Techniques in Invertebrate Pathology</a>. Lacey, L. A. , Elsevier Press. 375-425 (2012).</li>
<li>Martens, E. C., Gawronski-Salerno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenorhabdus+nematophila+requires+an+intact+iscRSUA-hscBA-fdx+locus+to+colonize+Steinernema+carpocapsae+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Xenorhabdus nematophila requires an intact iscRSUA-hscBA-fdx locus to colonize Steinernema carpocapsae nematodes.</a> J. Bacteriol. 185, 3678-3682 (2003).</li>
<li>Vivas, E. I., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenorhabdus+nematophilus+as+a+model+for+host-bacterium+interactions%3A+rpoS+is+necessary+for+mutualism+with+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Xenorhabdus nematophilus as a model for host-bacterium interactions: rpoS is necessary for mutualism with nematodes.</a> J. Bacteriol. 183, 4687-4693 (2001).</li>
<li>White, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+obtaining+infective+nematode+larvae+from+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A method for obtaining infective nematode larvae from cultures.</a> Science. 66, 302-303 (1927).</li>
<li>Ciche, T. A., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+the+insect+pathogen+Photorhabdus+luminescens%2C+which+end+of+a+nematode+is+out%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">For the insect pathogen Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).</li>
<li>Sicard, M., Brun, N. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+native+Xenorhabdus+on+the+fitness+of+their+Steinernema+hosts%3A+contrasting+types+of+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of native Xenorhabdus on the fitness of their Steinernema hosts: contrasting types of interaction.</a> Parasitol. Res. 91, 520-524 (2003).</li>
<li>Lambertsen, L., Sternberg, C., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-Tn7+transposons+for+site-specific+tagging+of+bacteria+with+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mini-Tn7 transposons for site-specific tagging of bacteria with fluorescent proteins.</a> Environ. Microbiol. 6, 726-732 (2004).</li>
<li>Miller, W. G., Leveau, J. H., Lindow, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+gfp+and+inaZ+broad-host-range+promoter-probe+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Int%22%5BJournal%5D)">Improved gfp and inaZ broad-host-range promoter-probe vectors.</a> Mol. Plant Microbe Int. 13, 1243-1250 (2000).</li>
<li>Teal, T. K., Lies, D. P., Wold, B. J., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiometabolic+stratification+of+Shewanella+oneidensis+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatiometabolic stratification of Shewanella oneidensis biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 7324-7330 (2006).</li>
<li>Bao, Y., Lies, D. P., Fu, H., Roberts, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+Tn7-based+system+for+the+single-copy+insertion+of+cloned+genes+into+chromosomes+of+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">An improved Tn7-based system for the single-copy insertion of cloned genes into chromosomes of Gram-negative bacteria.</a> Gene. 109, 167-168 (1991).</li>
<li>Woodring, J. L., Kaya, H. K. Steinernematid and Heterorhabditid Nematodes: A Handbook of Biology and Techniques. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWoodring%2C+JL+%22Southern+Cooperative+Series+Bulletin+331%22">Southern Cooperative Series Bulletin 331</a>. , Arkansas Agricultural Experiment Station. (1988).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O protocolo aqui descrito proporciona um método para a detecção óptica de bactérias dentro de um hospedeiro de nemátodos (Figura 1). Este método tira vantagem da transparência óptica dos nemátodos e a capacidade de bactérias fluorescentes de etiquetas, permitindo a análise in vivo das bactérias dentro do hospedeiro nematóide (Figura 3). Especificamente, esta abordagem identifica a localização de bactérias dentro de seu hospedeiro. Ao contar uma população de nemátodos e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Agar lipídico (Estéril) </td><td></td><td></td><td> 8 gramas de caldo nutriente, 15 gramas de agar de extracto de levedura, 5 gramas de água, 890 ml, 10 ml 0,2 g / ml de MgCl2. 6H 2 0, 96 ml de solução de xarope de milho *, 4 ml de óleo de milho * Mexa mídia ao derramar placas * Adicionar ingrediente estéril após a autoclavagem </td></tr><tr><td> Solução Xarope de milho (Estéril) </td><td></td><td></td><td> 7 ml de xarope de milho, 89 ml de água mistura e autoclave </td></tr><tr><td> Solução ovo </td><td></td><td></td><td> 16,6 ml de hipoclorito de sódio a 12%, 5 ml de KOH 5M, 80 ml de água </td></tr><tr><td> Lisogenia Caldo (Estéril) </td><td></td><td></td><td> 5 gramas de extrato de levedura, triptona 10 gramas, 5 gramas de sal, 1 L de água mistura e autoclave </td></tr><tr><td> Microcentrifugue </td><td> Pescador </td><td> 13-100-675 </td><td> Qualquer microcentrífuga que contém tubos de microcentrífuga funcionará </td></tr><tr><td> Centrifugador </td><td> Beckman </td><td> 366802 </td><td> Centrífuga de topo grande tabela que contém 15 ml e 50 ml, tubos cónicos </td></tr><tr><td> Estéril 60 mm x 15 milímetros prato de Petri </td><td> Pescador </td><td> 0875713 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml tubos de centrífuga </td><td> Pescador </td><td> 05-539-6 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml tubos de centrífuga </td><td> Pescador </td><td> 05-531-6 </td><td></td></tr><tr><td> Estéril 100 mm x 20 milímetros prato de Petri </td><td> Pescador </td><td> 0875711Z </td><td> Mais profundo do padrão pratos de Petri </td></tr><tr><td> Placa de 24 poços </td><td> Greiner Bio-One &lt;/ Td&gt; <td> 662000-06 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio </td><td></td><td></td><td> O microscópio fluorescente necessita de capacidades compatíveis com o fluoróforo </td></tr><tr><td> Paraformaldeído </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15710 </td><td></td></tr><tr><td> PBS (Estéril) </td><td></td><td></td><td> 8 g de NaCl 0,2 g de KCL 1,44 g de Na 2 HPO 4 0,24 g de KH 2 PO 4 1 L de água Ajustar a um pH de 7,4 e 1 L de água a autoclave e </td></tr><tr><td> Tubos de microcentrífuga </td><td> Pescador </td><td> 05-408-138 </td><td> 2 ml ou 1,5 ml tubos </td></tr><tr><td> Sacudidor </td><td></td><td></td><td> Qualquer agitador que faz com que o líquido se mova suavemente vai trabalhar </td></tr><tr><td> Ácido Diaminopimélico </td><td> Sigma </td><td&gt; D-1377 </td><td> Se for necessário, meios de comunicação para completar uma concentração de 1 mM ou </td></tr></tbody></table>

visualizando bactérias em nematóides por microscopia de fluorescência

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Simbioses, a convivência de dois ou mais organismos, são comuns em todos os reinos da vida. Como dois dos organismos mais ubíquos na Terra, nemátodos e bactérias formam uma grande variedade de associações simbióticas que vão desde benéfico para patogénico 1-3. Uma associação como é o relacionamento mutuamente benéfico entre as bactérias e nematóides Steinernema Xenorhabdus, que emergiu como um sistema modelo de simbiose 4. Nematóides entomopatogênicos Steinernema são, usando seu simbionte bacteriano para matar insetos 5. Para a transmissão entre os hospedeiros de insetos, as bactérias colonizam o intestino do nematóide juvenil fase infecciosa 6-8. Recentemente, várias outras espécies de nematóides foram mostrados para utilizar as bactérias para matar insectos 9-13, e começaram investigações examinar as interacções entre os nemátodos e bactérias nestes sistemas &lt;sup&gt; 9. Descreve-se um método para a visualização de um simbionte bacteriano dentro ou sobre um hospedeiro de nematóides, tirando partido da transparência óptica de nemátodos, quando vistas através de microscopia. As bactérias são manipuladas para expressar uma proteína fluorescente, permitindo a sua visualização por microscopia de fluorescência. Estão disponíveis muitos plasmídeos que transportam genes que codificam proteínas que fluorescem a diferentes comprimentos de onda (ou seja, verde ou vermelha), e de conjugação de plasmídeos a partir de uma estirpe de Escherichia coli doador em um receptor symbiont bacteriana é bem sucedida para uma ampla gama de bactérias. Os métodos descritos foram desenvolvidos para investigar a associação entre Steinernema carpocapsae e nematophila Xenorhabdus 14. Métodos semelhantes têm sido utilizados para investigar outros nematóides bactéria associações de 9, 15-18 e, portanto, o método é geralmente aplicável. O Method permite a caracterização da presença de bactérias e de localização dentro de nemátodos em diferentes fases de desenvolvimento, proporcionando insights sobre a natureza da associação e do processo de colonização 14, 16, 19. A análise microscópica revela tanto a frequência dentro de uma população de colonização e localização de bactérias aos tecidos do hospedeiro 14, 16, 19-21. Esta é uma vantagem sobre os outros métodos de monitorização de bactérias dentro das populações de nematóides, tais como a sonicação ou a trituração 22 23, o qual pode fornecer níveis médios de colonização, mas não pode, por exemplo, discriminar populações com uma alta frequência de baixa carga simbióticas de populações com uma baixa freqüência de cargas simbióticas elevados. Discriminando a freqüência ea carga de bactérias colonizadoras pode ser especialmente importante quando a seleção ou caracterização de bactérias mutantes para os fenótipos de colonização 21, 24. Com efeito, a microscopia de fluorescência tem sido utilizada na pesquisa de alto rendimento de mutantes bacterianos para defeitos de colonização 17, 18, ​​e é menos trabalhosa do que outros métodos, incluindo a sonicação 22, 25-27 e dissecção de nemátodos individuais 28, 29.

Para estudar o mutualismo entre<em&gt; Xenorhabdus</em&gt; Bactérias e<em&gt; Steinernema</em&gt; Nemátodos, foram desenvolvidos métodos para monitorizar a presença de bactérias e localização no interior de nemátodos. A abordagem experimental, a qual pode ser aplicada a outros sistemas, implica bactérias engenharia para expressar a proteína fluorescente verde e visualização, por meio de bactérias de microscopia de fluorescência dentro do nemátodo transparente.

Visualizando bactérias em nematóides por microscopia de fluorescência

As simbioses, a convivência de dois ou mais organismos, são generalizadas em todos os reinos da vida. Como dois dos organismos mais onipresentes em...

O objetivo geral deste procedimento é observar simbiontes bacterianos marcados com fluorescência dentro de seu hospedeiro nematoide. Isso é realizado primeiramente marcando as bactérias com uma proteína fluorescente por meio de conjugação. O segundo passo é isolar nematoides AIC coletando ovos.Em seguida, os nematoides AIC são cultivados em combinação com seu simbionte bacteriano marcado com fluorescência para permitir a associação natural e, por fim, a localização do simbionte bacteriano dentro do hospedeiro nematoide. A frequência dessa associação dentro da população de nematoides pode ser determinada por microscopia de fluorescência. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de simbiose, como onde as bactérias se localizam dentro de seus hospedeiros e qual é a distribuição do transporte bacteriano ao longo de uma população de hospedeiros?Após o crescimento noturno das cepas bacterianas, subcultive as cepas doadoras, receptoras e auxiliares em meio de crescimento rico em nutrientes, sem antibióticos, numa proporção de um para 100 de cultura para meio, e então cultive as culturas na temperatura apropriada para cada cepa até atingirem o estágio de crescimento logarítmico médio. Em seguida, combine as cepas em um único tubo de microcentrífuga e centrifugue as culturas mistas por dois minutos a 17.900 ×g, decante o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 30 microlitros de meio fresco. Depois, aplique a suspensão em uma placa de meio rico em nutrientes sem qualquer antibiótico e deixe a gota secar; quando a suspensão estiver seca,Incube a placa invertida durante a noite em uma temperatura ideal para a bactéria receptora e permissível para o doador e o auxiliar, se aplicável. Em seguida, raspe o inóculo e faça o estriamento para colônias isoladas em uma placa com antibiótico seletivo para obter uma cultura pura de bactérias estriadas, uma única colônia para isolamento. Por fim, certifique-se de que as colônias resultantes sejam o simbionte receptor e não a linhagem doadora.Ao realizar triagem para a presença de fenótipos específicos do receptor. Por exemplo, bactérias cino abdi podem ser diferenciadas de e coli mediante um teste de catalase, com triagem para a presença do plasmídeo por meio da confirmação da fluorescência sob o comprimento de onda correspondente à proteína fluorescente do plasmídeo. Após cultivar o simbionte bacteriano natural durante a noite, espalhe 600 microlitros da cultura bacteriana em oito a dez ágar-lipídio de 10 milímetros e, em seguida, incube as placas no escuro, sem umidade, a 25 graus Celsius.Após dois dias, adicione 5.000 nematoides juvenis infectivos em 500 microlitros de meio às áreas bacterianas. Após incubação das placas a 25 graus Celsius por mais três dias, coloque 20 microlitros de água sobre uma lâmina de microscópio. Em seguida, use um palito estéril para raspar uma pequena quantidade de nematoides da área bacteriana.Coloque o bastão na água para permitir que os nematóides nadem para fora. Observe este lâmina em baixa ampliação. Se ovos e fêmeas estiverem visíveis, continue quando as fêmeas contiverem ovos; coloque alguns mililitros de água sobre a superfície das placas, gire suavemente as placas e, em seguida, despeje a água em um tubo cônico de 50 mililitros.Os nematoides devem sair das placas e não ser mais visíveis na superfície da placa. Deixe os nematoides sedimentarem no fundo do tubo, então aspire a água em excesso do topo do tubo e reencha o tubo com água limpa. Após deixar os nematoides adultos sedimentarem e remover a água em excesso com pipeta mais uma vez, preencha os tubos cônicos com a solução de ovos.Em seguida, misture os tubos por inversão suave durante exatamente 10 minutos à temperatura ambiente. Após agitar, centrifugue imediatamente os tubos cónicos durante exatamente 10 minutos a 1.250 Gs e à temperatura ambiente, com o freio ligado. Em seguida, decante rapidamente o sobrenadante, ressuspenda o pellet com a solução de ovo por pipetagem e complete o tubo cónico com solução de ovo fresca.Agite bem a suspensão de ovos invertendo o tubo de três a cinco vezes e, em seguida, centrifugue imediatamente os ovos e despreze o sobrenadante conforme mostrado anteriormente. Re-suspenda o pellet em caldo misogyno, caldo ou LB por pipetagem e, então, transfira a suspensão de ovos para um tubo cônico de 15 mililitros. Agora, complete o tubo de 15 mililitros com LB, lave os ovos três vezes no caldo utilizando a mesma técnica rápida demonstrada anteriormente e, em seguida, dilua os ovos de P. nematode a pelo menos 10 ovos por microlitro.Transfira os ovos para uma placa de Petri de seis centímetros contendo cinco mililitros de LB e antibióticos contra bactérias colonizadoras. A placa pode ser armazenada envolta em perfil por até quatro dias após o crescimento noturno e seleção das bactérias fluorescentes. Use um bastão estéril para espalhar 600 microlitros da cultura bacteriana sobre aeróis lipídicos de 10 milímetros e incubar a cultura a 25 graus Celsius.Após dois dias, distribua de 500 a 5.000 ovos de nematoides em cada placa de lipídio. Se a placa tiver sido armazenada, lave os ovos em 15 mililitros de LB, conforme acabou de ser demonstrado, pelo menos uma vez antes de inocular os ovos nas estrias bacterianas previamente preparadas. Em seguida, incube as culturas co-cultivadas de nematoides e bactérias no escuro e sem umidade a 25 graus Celsius até que as formas juvenis infectivas apareçam como um anel branco difuso na borda da placa.Quando os juvenis infectantes forem observados, remova a tampa da placa de ágar lipídico e coloque o fundo da placa no interior do fundo de uma placa de Petri vazia de 100 milímetros por 20 milímetros. Em seguida, encha a placa de Petri com água suficiente para atingir cerca de metade da altura da placa menor e incube a armadilha de água até que os juvenis infectantes descendentes tenham emergido na água.Após coletar os nematoides da água ou do estágio de vida desejado no gramado bacteriano apropriado, dissolva alguns grãos de ole em 30 microlitros de água e adicione um a dois microlitros deste agente paralisante para cada 50 microlitros da amostra de nematoide. Em seguida, transfira cerca de 20 a 30 microlitros da amostra de nematoide paralisado para uma lâmina de microscopia e coloque uma lamínula sobre a amostra. Observe os nematoides usando microscopia de luz para garantir que os nematoides estejam no campo de visão.Para identificar a localização bacteriana. Fotografe os nematoides em microscopia fluorescente, além da configuração de microscopia de luz, e depois sobreponha as imagens. Pode ser necessário testar várias ampliações e vistas do nematoide para localizar as bactérias.Uma população de nematoides provenientes de dois meios foi contada e avaliada quanto à colonização pelo simbionte bacteriano. Para obter estatísticas robustas, é recomendável contar pelo menos 100 nematoides por amostra, com pelo menos 30 em cada categoria, conforme mostrado na tabela. Esses nematoides apresentam níveis de colonização de aproximadamente 14,6% quando cultivados em ágar lipídico e de 68,6% quando cultivados em ágar fígado-rim.Mostrou-se que outras espécies de nematoides e bactérias apresentam diferentes níveis de colonização. Este esquema ilustra a aparência geral de fêmeas de Steiner NEMA. O detalhe mostra a imagem de contraste de interferência diferencial de uma fêmea S fot gráfica com ampliação de 20 x.A seta preta no detalhe indica a vulva, enquanto as setas brancas indicam ovos visíveis. Esta imagem mostra um ovo desenvolvido, mas não eclodido, de nematóide volt a 40 x de ampliação, e esses ovos isolados de nematóides s Volta foram visualizados com 10 x de ampliação. Aqui, imagens representativas de microscopia de nematóides Steiner Nima associados a bactérias Xeno aptus são mostradas nesta primeira imagem.Os nematoides de Alvin estavam associados ao seu simbionte bacteriano expo que expressa GFP, criando esta imagem composta. Uma imagem de contraste de fase foi sobreposta a uma imagem fluorescente. A seta indica as bactérias presentes dentro do nematoide juvenil infectivo.Esta imagem mostra um nematódeo juvenil de S carpa capsi com X nla expressando GFP. A imagem foi construída de maneira semelhante à imagem anterior e retrata o nematódeo juvenil com bactérias marcadas com proteína verde fluorescente visualizadas como bastonetes verdes localizados ao longo do lúmen intestinal do nematódeo. Além do procedimento descrito, outros métodos, como a manipulação genética do simbionte bacteriano antes da associação com o hospedeiro nematódeo, podem ser incorporados para responder perguntas adicionais, como quais são os mecanismos moleculares necessários para a associação entre o microrganismo e o hospedeiro.

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