Visualização de Caenorhabditis elegans Estruturas cutícula Usando o Dye lipofílicos Vital, DII

O objetivo geral deste procedimento é visualizar a cutícula na elegância transparente do mar vivo usando o olho de corante lipofílico fluorescente vermelho. Isso é feito preparando uma população de nematóides para coloração. Em seguida, o olho de corante diluído é adicionado à população e eles podem incubar.

Em seguida, os animais são recuperados da solução de coloração. A imagem de fluorescência da cutícula corada com Dai mostra detalhes na superfície, incluindo estruturas reprodutivas dos olhos de Ailey e Ann e outras características morfológicas externas. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes para visualizar a cutícula neste organismo transparente, como imagem direta, fluorescência, expressão transgênica, coloração de anticorpos, microscopia eletrônica e aglutinina de gérmen de trigo marcada, é que esta técnica é fácil de executar relativamente rápido e barato, e produz uma bela resolução de estruturas cuticulares em animais vivos.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave em muitos campos que usam o sistema modelo de elegância do mar e sua cutícula, como secreção celular e organização da cutícula, desenvolvimento de células epidérmicas, vias gênicas heterocrônicas, imunidade inata, desenvolvimento de características morfológicas e evolução de nematóides. Demonstrando o procedimento estará Robbie Schultz, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Ao trabalhar com o D Eye, lembre-se de que ele é sensível à luz.

Sempre proteja o olho D da luz envolvendo-o em papel alumínio. Use também luvas e jaleco, pois o DMF é tóxico e o DAI é um carro. O cianeto Dai é muito poderoso.

Uma diluição de trabalho de força padrão é de 30 microgramas por mililitro de DII em M nove, e uma única população requer apenas 400 microlitros de diluição de trabalho. Comece com uma placa de 60 milímetros povoada com nematóides não contaminados. Lave os animais do prato em 1,5 mililitros de 0,5% Triton X 100.

No tampão M nove, agite suavemente o líquido em movimentos circulares para soltar todas as larvas e animais adultos e, em seguida, transfira a lavagem para um tubo de 1,5 mililitro. Gire imediatamente os animais a 2000 RRP M por 30 segundos para coletar os animais no fundo do tubo. Descarte o máximo de sobrenadante possível sem perturbar os animais.

Tenha cuidado, não ganancioso. Lave os animais com um mililitro de M nove. Gire para baixo e remova o sobrenadante.

Repita a lavagem. Gire para baixo novamente e remova o sobrenadante. Em seguida, a 400 microlitros de 30 microgramas por mililitro de Dai em M nove para o tubo.

Vortex o tubo brevemente para ressuspender os animais. Em seguida, agite o tubo a 20 graus Celsius na posição horizontal por três a 16 horas a 350 RP M em um ambiente protegido contra luz. O momento dessas últimas etapas é importante.

Primeiro, o Triton X deve ser lavado antes de remover os lipídios que o dai liga. Em segundo lugar, os animais devem ser corados em solução de corante para os olhos por tempo suficiente para permitir que a cutícula seja uniformemente corada. Um pouco mais tarde, os animais devem se recuperar com comida por tempo suficiente para remover o olho solto.

No final da coloração, gire os animais e remova a solução de corante. Lave os animais com um mililitro de M nove. Para remover o corante não ligado, gire os animais e remova o sobrenadante.

Suspenda novamente os animais em 400 microlitros de tampão M nine e despeje-os em uma porção livre de bactérias de uma microplaca NGM. Semeadas com OP 50 E Coli permitem que os animais se recuperem no escuro por pelo menos 30 minutos, mas não mais do que um dia, porque a fluorescência do corante desaparece durante o tempo de recuperação. Os animais devem rastejar para longe do líquido de coloração do corante e para a comida.

Esses animais são mais fáceis de visualizar, pois têm menos fluorescência de fundo do olho de corante livre. Comece preparando uma almofada agri em uma lâmina Para garantir a espessura uniforme da almofada agri usada. Dois espaçadores.

Um espaçador é feito colocando dois pedaços de fita adesiva em uma lâmina de vidro. Os espaçadores podem ser usados indefinidamente. Em seguida, arrume uma lâmina de vidro limpa longitudinalmente entre duas corrediças espaçadoras, pipete cerca de 150 microlitros de quatro ágares fundidos.

No centro da lâmina de vidro limpa. Cubra rapidamente o AER fundido com uma lâmina adicional colocada perpendicularmente sobre o AER e ambos os espaçadores para formar uma almofada de ágar. Deslize cuidadosamente a corrediça da tampa, mantendo a almofada centralizada na parte superior da corrediça de montagem.

Agora pipete cinco microlitros de anestésico nematóide na almofada, monte de oito a 12 animais no anestésico e cubra suavemente com uma lamínula de microscópio. Observar os animais utilizando um microscópio composto ou confocal equipado com, pelo menos, uma objetiva de 40 x e um filtro trissy ou outro filtro compatível. O máximo de excitação fluorescente do olho do corante é de 549 nanômetros e seu máximo de emissão é de 565 nanômetros.

Para matriz vinculada, a imagem é a parte mais desafiadora deste protocolo. Mostramos como montar animais para imagens, mas você precisa ser devidamente treinado no composto ou no escopo confocal que usará. Descobrimos que usar uma objetiva com pelo menos 60 x de ampliação é melhor para resolver os detalhes iluminados pelo método de coloração.

Cada uma das imagens nesta seção foi tirada usando uma objetiva de 63 x na elegância do selo embrionário do pôster. A superfície da cutícula contém anualmente separadas por sulcos circunferenciais e, em alguns estágios, cristas longitudinais chamadas ailey. Cada uma das imagens nesta seção foi tirada com uma objetiva de 63 x na elegância C pós-embrionária.

A superfície da cutícula contém anualizada separada por sulcos circunferenciais e, em alguns estágios, cristas longitudinais chamadas aley. Cada estágio de desenvolvimento tem estruturas de cutícula com composições e padrões distintos, sulcos ou sulcos de aley e Aly Fluorescentemente. Dependendo da composição da superfície.

Ao longo de todos os estágios larvas e adultos usando este método de suporte de corante, eles permanecem visíveis por até um dia após a recuperação. Manchas fluorescentes de fundo às vezes são observadas, mas não rotineiramente. Esta é a cutícula de animais mutantes adultos que apresentam defeitos moderados de organização da cutícula.

As cristas de Ailey são descontínuas e supranumerárias. As cristas de Ailey são fundidas e ramificadas ou bifurcadas, um marcador transgênico comum. Um alelo dominante do rolo seis causa torção da cutícula, que pode ser vista no ailey e pode fazer com que os anéis sejam padronizados irregularmente.

Dai também mancha outras estruturas de cutícula externa, incluindo o hermafrodita adulto, vulva e cauda masculina adulta e fan dai também pode destacar defeitos sutis na morfologia externa, como esta cauda bifurcada, coloração insuficiente. Por exemplo, uma coloração de duas horas leva a uma coloração cuticular irregular, embora os neurônios expostos ao ambiente possam manchar Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em quatro horas, sem incluir imagens se for realizada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como manchar a elegância do mar com o olho para observação da cutícula e outras estruturas morfológicas externas.