Técnica simples e eficiente para a preparação de suspensões de células testiculares

Neste vídeo, será apresentado um protocolo muito simples e eficiente para obter suspensão celular de material de teste de roedores em apenas 15 minutos. O método foi aplicado para testar o teste de cobaias de camundongos e ratos e usa um dispositivo de metamáquina para desagregar o tecido encapsulado. Após uma filtração e coloração, o íon celular está pronto para o fluxo.

Análise ou classificação de citose A homogeneidade das populações de células é um pré-requisito para a análise de eventos bioquímicos e moleculares durante a diferenciação de GA masculino. Assim, a heterogeneidade testicular com mais de 30 tipos celulares diferentes representa um dos maiores problemas relativos ao estudo das bases moleculares da espermatogênese de mamíferos. Por esse motivo, vários métodos têm sido usados para obter enriquecimento para populações de células testiculares purificadas, incluindo PU e ilustração centrífuga.

O primeiro passo para qualquer método de separação celular é a preparação de uma suspensão celular. No entanto, os protocolos atuais geralmente são demorados e podem implicar na perda de moléculas de vida curta, como RNAs, o que é indesejável para a análise de expressão ulterior. A principal vantagem do protocolo aqui apresentado é que elimina etapas entre o sacrifício de animais e estudos moleculares específicos do estágio de esperma, mas ao mesmo tempo garante boa qualidade e excelente representação do tipo de célula nas suspensões celulares.

Demonstrando o procedimento estará a Dra. Ana Rodriguez, pesquisadora do Laboratório AL que desenvolveu o método e a citometria de fluxo Federico San Lopez que foram responsáveis pela análise citométrica. O procedimento requer um pequeno equipamento, o sistema de lixiviação, com seus acessórios médicos e fcon. No entanto, os acessórios fcon podem ser perfeitamente substituídos por membranas de nylon do mesmo tamanho de poro.

Os únicos outros materiais e reagentes necessários são espalhar vidro, dois pratos, tesouras e fórceps, uma seringa de três a cinco mililitros incomoda a câmara intestinal, meio de cultura DMM suplementado com 10% de soro para tosse fetal e NDA. Se forem planejadas aplicações a jusante envolvendo manipulações de RNA, todos os materiais e soluções devem ser tratados de acordo para executar o protocolo. Coloque o testículo dissecado em um vidro de 96 milímetros de acordo com os dados mostrados de gelo contendo 10 mililitros de gelo suplementado chamado dm.

Remova o TAL Virginia, corte o testículo decapado em pedaços quadrados de dois a três milímetros de cada lado. Coloque quatro a cinco dessas peças em um medicamento descartável dessegregado junto com um mililitro de código suplementado D e processado no sistema de metamáquina por 50 segundos. Cada unidade médica contém uma tela fixa de aço inoxidável com cerca de cem orifícios hexagonais cercados por seis micro lâminas.

O tecido é trazido para cada orifício por um rotor de metal dentro da câmara médica e dessegregado passando sobre os orifícios afiados e através da tela de metal, enquanto uma microbomba sob a tela fornece líquido e libera os cascos. Recupere o resultado em suspensão celular do medicamento usando uma seringa de três a cinco milímetros sem agulha. Em seguida, molhe um falcão de 50 micrômetros ou a mesma malha de náilon de quatro tamanhos com meio mililitro médio e filtre a suspensão através dela.

Repita o passo, mas usando uma malha de náilon de 25 micrômetros ou unidade de falcão equivalente e coloque no gelo, pegue uma cotação ALI da suspensão celular para contar em uma câmara noyer e ajuste a concentração celular para uma a duas vezes 10 elevado a sete células por mililitro em meio de cultura. Finalmente, adicione NDA a uma concentração final de 0,2% para evitar o bombeamento celular e também para evitar o entupimento muscular durante os estudos de fluxo subsequentes. Se a viabilidade celular for avaliada, isso pode ser feito por meio do kit de viabilidade de mortos-vivos para células animais seguindo as instruções do fabricante antes da análise por citometria de fluxo, adicione um corante fluorescente.

A escolha do fluorocromo dependerá dos lasers disponíveis. Nesta demonstração, será mostrado o uso de diferentes corantes que ligam o documento ao DNA. Embora a dieta de propídio yo seja o corante usual para células fixas ou mortas em baixas concentrações, descobrimos que, quando usado em altas concentrações, a ADM entra nas células testiculares não fixadas nas suspensões preparadas pelo método aqui apresentado.

Isso provavelmente se deve ao estresse mecânico implícito, que em combinação com a natureza sensorial do epitélio semial pode levar à quebra das pontes de conexão célula a célula com manipulação mínima Para coloração de iodeto de propídio 10 minutos antes da análise da amostra na solução a uma concentração final de 50 microgramas por mililitro para a suspensão celular e incubar um grau Celsius zero no escuro Para analisar células de coloração de propídio mu. Para posterior classificação, usamos um citômetro de fluxo de fax vantage equipado com um laser de íons targon coerente ajustado para emitir a 488 nanômetros. A potência do laser é ajustada para cem miliwatts e a fluorescência emitida pelo propídio I é coletada por um detector FL dois usando um filtro passa-banda 5 7 5 5 slash 26

Use um bico de 70 micrômetros para medições de citometria de fluxo e software squa para analisar os seguintes parâmetros. Dispersão lateral de dispersão direta, fluorescência total emitida ou área de pulso e duração das emissões fluorescentes ou largura de pulso. Os resultados são apresentados em gramas representando o número de eventos em cada nível fluorescente e em gráficos D exibindo dispersão lateral versus área de pulso fluorescente e área de pulso fluorescente versus sua largura.

Os dupletos são excluídos da análise usando gráficos de OD da área de pulso fluorescente versus sua largura para classificar populações de monócitos SM com o modo de classificação definido de fax em R normal ou C normal e usam três gotas classificadas como envelope. Ajuste o diferencial de amostra para analisar as células a uma taxa de 500 a 1500 por segundo. Mantenha os tubos de amostra e coleta de três a quatro graus Celsius usando uma unidade de refrigeração.

Alternativamente, as células da suspensão podem ser coradas com outros fluorocromos. Por exemplo, o corante vital. O HER 3 3 3 4 2 pode ser usado para uma concentração final de cinco microgramas por mililitro e incubado por pelo menos 10 minutos a 37 graus protegido da luz para Hirsch.

3, 3, 3, 4, 2 amostras de manchas. A análise celular foi realizada por meio de um citômetro de fluxo MO equipado com um laser de comprimento de onda de excitação UV operando a 25 miliwatts e um bico de 70 micrômetros. Use o software Summit 4.3 ou similar para analisar os mesmos parâmetros indicados anteriormente, quando as suspensões celulares são analisadas sob óptica de contraste facial, são observadas suspensões de qualidade de corte.

As principais vantagens deste protocolo são, em primeiro lugar, suspensões de células testiculares preparadas usando muitas máquinas e obtendo apenas 15 minutos, incluindo teste de cesariana, corte de tecido, ach, processamento de máquina e filtração, este período de tempo cerca de um oitavo do tempo normalmente gasto por outros protocolos. A brevidade deste protocolo, juntamente com um manuseio mínimo envolvido, seria responsável pela boa preservação de macromoléculas de vida curta, o que é crítico quando é necessária uma amostra representativa de compostos presentes na população de células original. Como o metano envolve manuseio mínimo, ele é facilmente reproduzível nesta tabela.

As porcentagens relativas das diferentes populações de células testiculares para sete experimentos independentes realizados com ratos adultos e analisados por citometria de fluxo são apresentados como um exemplo para mostrar a reprodutibilidade do método. Ao contrário da maioria das partículas usadas atualmente para preparação de suspensões de células testiculares, o método aqui apresentado não envolve ação enzimática. Embora a colagenase goteje em RNAs, que são as enzimas geralmente incluídas, contribuem para a segregação inadequada do tecido, elas podem afetar a preservação das macromoléculas de interesse.

A falta de tratamentos enzimáticos não só favorece a preservação do RNA e das proteínas, como também barateia o protocolo. Embora tenha sido relatado anteriormente que as suspensões celulares preparadas mecanicamente se aglomeram mais prontamente do que as tripsizadas, descobrimos que esse protocolo leva a suspensões celulares bem desagregadas na ausência de ação enzimática. A inclusão de NDA provou ser muito útil na prevenção da aglomeração celular.

A boa qualidade das suspensões também é evidenciada quando as amostras são submetidas à análise citométrica, a julgar pelo mínimo de debris celulares observados. De acordo com informações publicadas, cerca de 13% dos espermatozoides redondos são encontrados como multinucleados quando as suspensões celulares são preparadas por um método exclusivamente mecânico ou na presença de tripsina. No entanto, muitas suspensões preparadas por máquina tornam muito escassas as multinucleadas, provavelmente devido à redução do emaranhamento, uma vez que foi afirmado que as multinucleadas são produzidas principalmente como consequência da manipulação do tecido.

Um exemplo de uma suspensão celular preparada por máquina de testículos de rato é observado nesta foto. Como pode ser visto. Os citoplasmas estão bem preservados, as porcentagens relativas de populações de células C, duas C e quatro C em muitas suspensões testiculares preparadas por máquina para diferentes roedores remontaram as dos PEs intactos.

Isso apóia a suposição de que o método descrito aqui não danifica seletivamente nenhum tipo de célula específica. Surpreendentemente, a representação do tipo de célula em muitas suspensões preparadas à máquina é muito melhor mantida do que com os métodos clássicos de preparação por gotejamento. Como pode ser visto, os gráficos citográficos obtidos para suspensões de células testiculares processadas por meine não diferem substancialmente dos relatados anteriormente.

De fato, os histogramas obtidos e os gráficos de pontos exibem as três populações características de quatro células testiculares C a C e C com base no conteúdo de DNA, bem como a população aparentemente subha, que representa os espermatozóides haplóides altamente condensados. Esses perfis foram observados para suas suspensões sustentadas ou de iodeto de propídio, respectivamente, e isso também vale para espécimes adultos e juvenis. A classificação de células mitogênicas sper foi alcançada com sucesso com mais de 98% de pureza, seja para populações testiculares selecionadas com base no conteúdo de DNA ou mesmo para subpopulações com o mesmo conteúdo de DNA, mas diferentes níveis de condensação da cromatina, como miócitos de dentes e dentes do sono.

Como pudemos observar em suspensões de teste de cobaias, como o protocolo não inclui tratamento com RNA, as populações classificadas apresentam boa qualidade de RNA e permitem estudos diferenciais de expressão gênica mesmo para populações coradas com iodeto de propídio. Nesse sentido, vale lembrar que, ao contrário de outros corantes, o iodeto de propídio cora, o DNA e o RNA de fita dupla, no entanto, neste gráfico de uma análise de suspensão testicular de cobaia, os perfis semelhantes obtidos usando iodeto de propídio em paralelo com o ciclo vibrante laranja. Esse é um corante específico de DNA vital que mostra que a coloração de RNA não influencia significativamente os padrões de histograma citométrico.

Esta lista resume as principais vantagens do protocolo percentual. O método otimizado descrito aqui permite acelerar a preparação de suspensões de células testiculares adequadas para análise citométrica de diferentes estágios de espermatozoides de roedores em apenas 15 minutos, incluindo dissecção testicular, corte de tecido e processamento através do sistema de máquina ME. A brevidade, a maior qualidade de reprodutibilidade e as proporções do tipo de célula nas suspensões celulares o tornam uma boa alternativa para outras técnicas de auto-preparação mais tediosas e demoradas atualmente em uso.

Além disso, como esse método envolve muito pouca manipulação e evita enzimas e detergentes, é a escolha ideal para aplicações delicadas a jusante, como estudos de expressão gênica.