Técnica simples e eficiente para a preparação de suspensões de células testiculares

Neste vídeo, será apresentado um protocolo muito simples e eficiente para obter uma suspensão celular de material testicular de roedores em apenas 15 minutos. O método foi aplicado a testículos de camundongos, ratos e porquinhos-da-índia e utiliza um dispositivo mecânico para desagregar o tecido encapsulado. Após uma etapa de filtração e coloração, a suspensão celular está pronta para citometria de fluxo.

A análise citométrica ou a separação da homogeneidade das populações celulares é um pré-requisito para a análise de eventos bioquímicos e moleculares durante a diferenciação gonadal masculina. Assim, a heterogeneidade testicular, com mais de 30 tipos celulares diferentes, representa um dos principais problemas relacionados ao estudo da base molecular da espermatogênese em mamíferos. Por essa razão, diversos métodos têm sido utilizados para obter populações celulares testiculares enriquecidas ou purificadas, incluindo ultracentrifugação em gradiente de densidade e separação por centrifugação.

O primeiro passo para qualquer método de separação celular é o preparo de uma suspensão celular. No entanto, os protocolos atuais geralmente são demorados e podem implicar perda de moléculas de curta duração, como os RNAs, o que é indesejável para análises de expressão posteriores. A principal vantagem do protocolo aqui apresentado é que elimina etapas entre o sacrifício do animal e estudos moleculares específicos por estágio de esperma, mas ao mesmo tempo garante alta qualidade e excelente representação dos tipos celulares nas suspensões celulares.

Quem demonstrará o procedimento será a Dra. Ana Rodriguez, pesquisadora do Laboratório AL que desenvolveu o método, e Federico San Lopez, especialista em citometria de fluxo, responsáveis pela análise citométrica. O procedimento exige um pequeno equipamento, o sistema meach, com seus acessórios medicon e fcon. No entanto, os acessórios fcon podem ser perfeitamente substituídos por membranas de náilon com o mesmo tamanho de poro.

Os únicos outros materiais e reagentes necessários são uma alça de vidro, dois recipientes, tesoura e pinça, uma câmara de intestino com seringa de três a cinco mililitros, meio de cultura DMM suplementado com 10% de soro fetal e NDA. Se forem planejadas aplicações posteriores que envolvam manipulações de RNA, todos os materiais e soluções devem ser tratados de maneira apropriada para realizar o protocolo. Coloque o testículo dissecado em um recipiente de vidro de 96 milímetros com gelo contendo 10 mililitros de meio DMM suplementado resfriado.

Remova o TAL Virginia, corte o testículo decapitado em pedaços quadrados de dois a três milímetros de cada lado. Coloque quatro a cinco desses pedaços em um medicon descartável desagregado junto com um mililitro de meio suplementado com D e processe no sistema da máquina meta por 50 segundos. Cada unidade médica contém uma tela fixa de aço inoxidável com cerca de cem orifícios hexagonais cercados por seis microlâminas.

O tecido é conduzido para cada orifício por um rotor metálico dentro da câmara medicon e desagregado ao passar pelos orifícios afiados e pela tela metálica, enquanto uma microbomba sob a tela fornece líquido e remove as cascas. Recupere o resultado em suspensão celular da medicon utilizando uma seringa de três a cinco milímetros sem agulha. Posteriormente, umedeça uma peneira de nylon Falcon de 50 micrômetros ou de tamanho equivalente com meio meio mililitro e filtre a suspensão através dela.

Repita o passo, utilizando uma peneira de náilon de 25 micrômetros ou unidade falcon equivalente, e coloque no gelo. Tome uma alíquota do sistema celular para contagem em câmara de Noye e ajuste a concentração celular para um a dois vezes 10 elevado a sete células por mililitro no meio de cultura. Finalmente, adicione NDA até uma concentração final de 0,2% para evitar a formação de agregados celulares e também para prevenir obstrução muscular durante estudos de fluxo subsequentes. Se a viabilidade celular for avaliada, isso pode ser realizado por meio do kit de viabilidade "live/dead" para células animais, seguindo as instruções do fabricante antes da análise por citometria de fluxo, adicionando um corante fluorescente.

A escolha do fluorocromo dependerá dos lasers disponíveis. Nesta demonstração, será mostrado o uso de diferentes corantes que se ligam ao DNA. Embora o iodeto de propídio seja o corante usual para células fixadas ou mortas em baixas concentrações, descobrimos que, quando usado em altas concentrações, o corante penetra nas células testiculares não fixadas nas suspensões preparadas pelo método apresentado aqui.

Isso provavelmente se deve ao estresse mecânico envolvido, que, em combinação com a natureza sensorial do epitélio semial, poderia levar à ruptura das pontes de conexão entre células com mínima manipulação. Para coloração com iodeto de propídio, adicione 10 minutos antes da análise da amostra na solução uma concentração final de 50 microgramas por mililitro à suspensão celular e incube a zero grau Celsius no escuro. Para analisar células coradas com iodeto de propídio. Para classificação adicional, utilizamos um citômetro de fluxo FAX Vantage equipado com um laser de íons argônio coerente ajustado para emitir em 488 nanômetros. A potência do laser é definida em cem miliwatts e a fluorescência emitida pelo iodeto de propídio é coletada por um detector FL2 utilizando um filtro passa-banda de 575/26.

Utilize um bico de 70 micrômetros para medições de citometria de fluxo e o software squa para analisar os seguintes parâmetros: dispersão para frente, dispersão lateral, fluorescência total emitida ou área do pulso e duração das emissões fluorescentes ou largura do pulso. Os resultados são apresentados em gramas, representando o número de eventos em cada nível de fluorescência, e em gráficos de dispersão que mostram dispersão lateral versus área do pulso fluorescente e área do pulso fluorescente versus sua largura.

Os dupletes são excluídos da análise utilizando gráficos DO de área do pulso fluorescente versus sua largura para separar populações de monócitos SM com o modo de separação definido no fax vantage em R normal ou C normal e usando três gotas separadas como envelope. Ajuste o diferencial da amostra para analisar células a uma taxa de 500 a 1500 por segundo. Mantenha as amostras e os tubos de coleta a três ou quatro graus Celsius utilizando uma unidade de refrigeração.

Alternativamente, as células na suspensão podem ser coradas com outros fluorocromos. Por exemplo, o corante vital Hoechst 33342 pode ser usado numa concentração final de cinco microgramas por mililitro e incubado por pelo menos 10 minutos a 37 graus protegido da luz para Hirsch.

3, 3, 3, 4, 2 amostras coradas. A análise celular foi realizada por meio de um citômetro de fluxo MO equipado com um laser de comprimento de onda de excitação ultravioleta operando a 25 miliwatts e um bocal de 70 micrômetros. Utilize o software Summit 4.3 ou similar para analisar os mesmos parâmetros indicados anteriormente quando as suspensões celulares forem analisadas sob microscopia de contraste de fase, observando-se suspensões de qualidade adequada.

As principais vantagens deste protocolo são, em primeiro lugar, as suspensões celulares testiculares preparadas utilizando a máquina múltipla e obtidas em apenas 15 minutos, incluindo a seção cirúrgica do testículo, corte do tecido, processamento pela máquina e filtração — um período de tempo cerca de oito vezes menor do que o normalmente necessário por outros protocolos. A brevidade deste protocolo, juntamente com a manipulação mínima envolvida, explica a boa preservação de macromoléculas de vida curta, o que é essencial quando se requer uma amostra representativa dos compostos presentes na população celular original. Como o método envolve manipulação mínima, é facilmente reprodutível nesta tabela.

As porcentagens relativas das diferentes populações celulares testiculares de sete experimentos independentes realizados com ratos adultos e analisados por citometria de fluxo são apresentadas como exemplo para demonstrar a reprodutibilidade do método. Diferentemente da maioria das partículas atualmente utilizadas para o preparo de suspensões celulares testiculares, o método aqui apresentado não envolve ação enzimática. Embora a gota de colagenase em RNAs, que são as enzimas geralmente incluídas, contribua de forma inadequada para a segregação do tecido, ela pode afetar a preservação de macromoléculas de interesse.

A ausência de tratamentos enzimáticos não apenas favorece a preservação de RNA e proteínas, mas também torna o protocolo mais barato. Embora já tenha sido relatado anteriormente que suspensões celulares preparadas mecanicamente agregam com maior facilidade do que as tratadas com tripsina, verificamos que este protocolo resulta em suspensões celulares bem desagregadas na ausência de ação enzimática. A inclusão de NDA mostrou-se muito útil para prevenir a agregação celular.

A boa qualidade das suspensões também é evidenciada quando as amostras são submetidas à análise citométrica, conforme julgado pelo mínimo de detritos celulares observados. De acordo com informações publicadas, cerca de 13% dos espermatozoides redondos são encontrados como multinucleados, seja quando as suspensões celulares são preparadas por um método exclusivamente mecânico ou na presença de tripsina. No entanto, muitas suspensões preparadas mecanicamente apresentam multinucleados em quantidade muito escassa, muito provavelmente devido à menor aglomeração, já que foi afirmado que os multinucleados são produzidos principalmente como consequência da manipulação do tecido.

Um exemplo de uma suspensão celular preparada por muitas máquinas a partir de testículo de rato é observado nesta imagem. Como pode ser visto, os citoplasmas estão bem preservados e as porcentagens relativas das populações celulares C dois C e quatro C em suspensões testiculares preparadas por muitas máquinas para diferentes roedores reconstituíram aquelas dos PEs intactos.

Isso sustenta a suposição de que o método descrito aqui não danifica seletivamente nenhum tipo celular específico. Surpreendentemente, a representação dos tipos celulares em muitas suspensões preparadas por máquinas é muito melhor mantida do que com os métodos clássicos de preparação por gotejamento. Como pode ser observado, os citogramas obtidos para as suspensões celulares testiculares processadas por mim não diferem substancialmente dos já relatados anteriormente.

Na verdade, os histogramas e os gráficos de dispersão obtidos exibem as três populações celulares testiculares características de quatro C a C e C, com base no conteúdo de DNA, bem como a população aparentemente sub-haplóide, que representa os espermatozoides haploides altamente condensados. Esses perfis foram observados tanto para suspensões coradas com hercínio quanto com iodeto de propídio, respectivamente, e isso é válido tanto para espécimes adultos quanto juvenis. A separação de células espermatogênicas foi realizada com sucesso com pureza superior a 98%, tanto para populações testiculares selecionadas com base no conteúdo de DNA quanto para subpopulações com o mesmo conteúdo de DNA, mas com diferentes níveis de condensação da cromatina, como espermátides e miócitos.

Como pudemos observar em suspensões testiculares de porquinho-da-índia, como o protocolo não inclui tratamento com RNA, as populações classificadas apresentam boa qualidade de RNA e permitem estudos de expressão gênica diferencial, mesmo para populações coradas com iodeto de propídio. Nesse sentido, vale lembrar que, diferentemente de outros corantes, o iodeto de propídio cora tanto o DNA quanto o RNA de fita dupla. No entanto, neste gráfico de análise de suspensão testicular de porquinho-da-índia, os perfis semelhantes obtidos utilizando iodeto de propídio em paralelo com o Cycle Orange Vibrant, que é um corante vital específico para DNA, mostram que a coloração de RNA não influencia significativamente os padrões dos histogramas citométricos.

Esta lista resume as principais vantagens do protocolo descrito. O método otimizado aqui apresentado permite acelerar o preparo de suspensões celulares testiculares adequadas para análise citométrica de diferentes estágios espermáticos de roedores em apenas 15 minutos, incluindo a dissecação testicular, o corte do tecido e o processamento pelo sistema da máquina ME. A brevidade, a maior qualidade de reprodutibilidade e as proporções de tipos celulares nas suspensões celulares tornam-no uma boa alternativa a outras técnicas de preparo próprio, mais trabalhosas e demoradas, atualmente em uso.

Além disso, como este método envolve manipulação mínima e evita enzimas e detergentes, é uma escolha ideal para aplicações delicadas em etapas posteriores, como estudos de expressão gênica.