Name: Geração de organóides testicular porcina com a arquitetura específica do testis usando a cultura de micropoços (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Aprenda a gerar organóides testiculares de suíno com arquitetura específica do testis usando cultura em micropoços. Este método reprodutível permite estudar morfogênese testicular e realizar triagens de drogas e toxicidade.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado por NIH/NICHD HD091068-01 a Dr. ina Dobrinski.

Nota: os testículos de leitões de 1 semana de idade foram obtidos de uma fazenda de suínos comercial como subproduto da castração de suínos comerciais. O sourcing de testículos foi aprovado pelo Comitê de cuidados com animais da Universidade de Calgary.
1. preparação de soluções enzimáticas para digestão tecidual
Nota: são necessárias três soluções enzimáticas diferentes, que incluem duas soluções diferentes de colagenase IV (solução A, B) e uma solução de desoxirribonuclease I (DNase I).
<ol><li>Para preparar a solução a, dissolver 20 mg de colagenase IV S (tabela de materiais) e 40 mg de colagenase IV W (tabela de materiais) em 25 ml de alta glicose Dulbecco ' s Modified Eagle ' s Medium (DMEM). Em seguida, filtrar esterilizar com um filtro de 0,22 μm. Adicionar 0,4 mL de soro fetal bovino (FBS) à solução a para inibir a atividade de tripsina.</li>
	<li>Para preparar a solução B, dissolver 80 mg de colagenase IV W (tabela de materiais) em 40 ml de DMEM. Em seguida, filtrar esterilizar com um filtro de 0,22 μm.</li>
	<li>Para preparar a solução de DNase I (7 mg/mL), dissolver 70 mg de DNase I em 10 mL de DMEM. Em seguida, filtrar esterilizar com um filtro de 0,22 μm. Nota: a concentração enzimática para as soluções de colagenase IV descritas aqui, varia entre as concentrações (2 mg/mL) indicadas no artigo14original. O protocolo atual rende pilhas com viabilidade ligeiramente mais elevada. Entretanto, as pilhas isoladas por ambos os protocolos produzem organóides com arquitetura idêntica do tecido.</li>
</ol>2. digestão enzimática do tecido do testis
<ol><li>Colete os testículos em uma taça estéril e lave com salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 1% de penicilina/estreptomicina (P/S). Após a lavagem, transfira os testículos para um prato de cultura de tecido de 100 mm com PBS contendo 1% P/S e remova a túnica vaginalis e epidídimo usando tesouras e fórceps autoclavados. Transfira os testículos isolados para um novo prato de 100 mm e Lave abundantemente com PBS contendo 1% P/S.</li>
	<li>Para manter a esterilidade, use outro conjunto de tesouras estéreis e fórceps para descascar o parênquima testicular para fora da túnica albuginea. Corte os testículos ao longo do eixo longitudinal diretamente o Tunica. Em seguida, descasque os testículos para fora da túnica usando dois fórceps e coloque em um novo prato de 100 mm contendo 1 mL DMEM com 1% P/S.</li>
	<li>Mince os testículos descascados com tesouras estéreis em partes do tecido de 1-2 milímetros. Depois de cortar, use fórceps estéril para remover fragmentos brancos do tecido conjuntivo.</li>
	<li>Transfira as peças do tecido picado para a solução A e, em cima, até 50 mL com DMEM para obter uma concentração de 0,4 mg/mL para colagenase IV S (tabela de materiais) e uma concentração de 0,8 mg/ml para colagenase IV W (tabela de materiais). Coloc a solução a que contem as partes do tecido em um banho de água do ° c 37 por 30 minutos, inverta delicadamente os tubos cada 5 minutos e verific visualmente para a liberação do ADN.<ol>
<li>Adicionar 500 μL de DNase I se o DNA flutuante livre for observado. Após 30 min, centrifugue o tubo a 90 x g com travões a 25 ° c por 1,5 min e elimine o sobrenadante. Nota: o DNA apareceria como uma substância turva. Quando os tubos são abalados, as peças de tecido se acalmarem enquanto o DNA ficaria à tona.</li>
	</ol></li>
	<li>Adicionar a solução B ao tubo e subir até 50 ml com DMEM para obter uma concentração de 1,2 mg/ml de colagenase IV W (tabela de materiais). Coloque o tubo no banho de água de 37 ° c por 30 min e inverta suavemente o tubo a cada 5 min. adicionar 500 μL de DNase I se o DNA flutuante livre for observado.</li>
	<li>Após 30 min, centrifugue o tubo a 90 x g com travões a 25 ° c por 1,5 min. Depois disso descarte o sobrenadante e lave uma vez com PBS com 1% P/S. Nota: os sobrenadantes descartados da solução A e B conterá principalmente células intersticiais.</li>
	<li>Top acima do tubo com PBS até 50 mL. Colete cuidadosamente os túbulos da parte superior e coloque em um novo tubo de 50 mL. Nota: os grandes fragmentos de tecido não digeridos se instalam rapidamente na parte inferior, enquanto os túbulos seminiferosos digeridos permanecerão em suspensão. Nenhum fragmento de tecido grande deve ser coletado. Este procedimento pode ser repetido várias vezes até que a solução no tubo original é quase clara e apenas fragmentos de tecido não digeridos permanecem, o que pode ser Descartado.</li>
	<li>Centrifugue os túbulos a 90 x g com travões a 25 ° c por 1,5 min e elimine o sobrenadante. Adicionar PBS fresco e centrifugar novamente. Repita este passo de lavagem duas vezes.</li>
	<li>Após a última lavagem de PBS, retire o sobrenadante e ressuscitem os túbulos seminíferos em 5 mL de PBS. Em seguida, adicione 15 mL de 0,25% de ácido tripsina-etilenodiaminetetraacético (EDTA) aos túbulos. Coloque o tubo no banho de água de 37 ° c e inverta suavemente a cada 2 min. Se for observado um monte de DNA de flutuação livre, adicione 500 μL de DNase I com 5 mL de DMEM.</li>
	<li>Avalie a digestão enzimática de túbulos para células únicas o microscópio (primeiro após 5 min, então a cada 2 min). Se a maioria das células individuais pode ser detectada, parar a reação com 5 mL de FBS e filtrar através de uma malha de 70 μm e, em seguida, através de uma malha de 40 μm. Nota: deve-se tomar cuidado para que os tampões nos tubos de 50 mL utilizados para digestivos (solução A, B e 0,25% tripsina-EDTA) sejam apertados corretamente. Se a contaminação no banho de água é uma preocupação, a película de parafina pode ser envolvida em torno da tampa para assegurar a esterilidade.</li>
	<li>Centrifugue as células individuais a 500 x g com travões a 25 ° c durante 5 min, ressuscitem no meio de enriquecimento (Dulbecco modificado Eagle Medium F/12 (DMEM/F12) contendo 5% de FBS e 1% P/S) e conte o número de células viáveis. Esta é a população de células iniciais. Fixar 100 x 103 células e executar Immunocytochemistry para o marcador de célula germinal UCHL1 (ubiquitin C-terminal hydrolase L1) como descrito12 e determinar a percentagem de células germinativas nesta população de células iniciais. Nota: a proteína do dedo do zinco da leucemia promyelocytic do marcador da célula germinal (PLZF)15 poderia igualmente ser usada como uma alternativa apropriada para UCHL1. Na população de células iniciais, o rendimento da célula esperada é de cerca de 700-800 x 109/g de tecido. A percentagem de células germinativas nesta população de células deve ser de 4-5%.</li>
	<li>Coloque em torno de 20 x 106 desta população de células de partida em dois ultra baixo acessório 100 mm pratos de Petri (10 x 106 células suspensas em 10 ml de DMEM/F12 contendo 1% P/S em cada prato) por 2 dias em uma incubadora de cultura de tecidos (37 ° c , 5% CO2, 21% oxigênio). Realize o enriquecimento da célula germinativa com as células restantes. Nota: para assegurar a viabilidade óptima e a qualidade da pilha, quando o enriquecimento da célula germinal e a quantificação subseqüente tiverem lugar, a população de pilha começar é coloc na cultura em pratos ultra baixos da cultura do tecido do acessório por 2 dias.</li>
</ol>3. enriquecimento de células germinativas
Nota: o procedimento descrito acima produz principalmente células de Sertoli e células germinativas. As propriedades diferentes da adesão permitem a separação de pilhas de Sertoli e de pilhas de germe através do chapeamento diferencial.
<ol><li>Semente 20-25 x 106 células da população de células iniciais por 100 mm de cultura de tecido prato em um volume total de 8 ml de enriquecimento médio (DMEM/F12 com 5% FBS e 1% P/S) para o revestimento diferencial. Coloque as células em uma incubadora (37 ° c, 5% CO2, 21% O2) e após 1,5 h, certifique-se de que a maioria das células de Sertoli anexar à placa.</li>
	<li>Colete e combine o sobrenadante (contendo principalmente células germinativas) de 2 placas para uma nova placa de 100 mm e coloque-a de volta na incubadora. Depois de 1 h, novamente Combine o sobrenadante de 2 placas para uma nova placa de 100 mm. Coloque as placas de volta na incubadora para a noite. Nota: os sobrenadantes combinados irão conter principalmente células germinativas. As células aderiram que são descartadas junto com as placas são principalmente células somáticas testiculares, como Sertoli e células mióides peritubulares.</li>
	<li>Colete as células germinativas enriquecidas em duas frações da seguinte maneira. Nota: as células germinativas enriquecidas aderem de forma diferente, fração não aderente e fração levemente aderida. Ambas as frações formam juntos a população de células germinativas enriquecidas<ol>
<li>Fração não aderente: colete o sobrenadante.</li>
		<li>Fração ligeiramente aderente: lave suavemente as placas com PBS, trate com 2 mL de 1:20 de diluição de 0,25% de tripsina-EDTA durante 5 min à temperatura ambiente, pare a reacção com 2 mL de meio de enriquecimento e colete no mesmo tubo que a fração não aderente. Nota: 0,25% tripsina-EDTA precisa ser diluído com PBS para produzir uma solução de tripsina 1:20.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Conte o número total de células usando um contador de células, corrija 100 x 103 células e execute Immunocytochemistry para o marcador de célula germinal UCHL1 como descrito12 e determine a porcentagem de células germinativas nesta população de células enriquecidas. Nota: a percentagem de células germinativas nesta população de células deve ser de pelo menos 60-70%. Desde que o Immunocytochemistry para a quantificação exigiria 1 dia, as pilhas enriquecidas devem ser coloc em um prato de Petri ultra baixo do acessório 100 milímetro com DMEM/F12 suplementado com 1% P/S para a duração para assegurar a qualidade e a viabilidade óptimas da pilha.</li>
</ol>4. preparação de células para semeadura
<ol><li>Para colher a preparação da célula inicial, colete o sobrenadante em um tubo de 50 mL a partir do acessório ultra baixo 100 mm pratos. Lave as placas vigorosamente com PBS para recolher as células aderiram. Não é necessária digestão enzimática. Nota: algumas das células testiculares, principalmente células de Sertoli, podem aderir ligeiramente às placas de fixação ultra baixas.</li>
	<li>Combine a preparação da célula inicial e as células germinativas enriquecidas para obter uma preparação de células de trabalho contendo 25% de células germinativas. Centrifugar a 500 x g com travões a 25 ° c durante 5 min, descartar o sobrenadante e ressuscitará as células no meio de formação organoide (DMEM/F12 suplementado com insulina 10 μg/ml, transferrina 5,5 μg/ml, selênio 6,7 ng/ml, 20 ng/ml fator de crescimento epidérmico , 1% P/S). Ajuste a densidade da célula para 2,4 x 106 por ml. Nota: cada poço nas placas de micropoços utilizados13 neste protocolo continha 1.200 micróbicos.</li>
	<li>Use a fórmula abaixo para calcular o número de células por poço, conforme descrito abaixo. Número de células por poço = número de micropoços x número de células a serem agrupadas para cada organóide.</li>
	<li>Para gerar organóides de 1, 000 células cada, cada semente com (1.200 x 1.000 células cada =) 1,2 x 106 células. Ajuste a densidade celular na suspensão celular de forma que as células sejam semeadas em um volume de 0,5 mL de meio. Para organóides formados a partir de 1.000 células cada, use uma densidade de 2,4 x 106 células por ml (1,2 x 106 células em 0,5 ml).</li>
</ol>5. preparação de micropoços para receber células
Nota: para garantir que as células não aderiram à superfície do micropoço, trate com uma solução de enxaguamento de surfactante que está disponível para compra pelo fabricante.
<ol><li>Adicione 0,5 mL de solução de enxaguadela a cada poço. Assegure-se de que nenhuma bolha de ar esteja prendida no poço. Para remover as bolhas de ar, se houver, centrifugue a placa a 2.000 x g com travões a 25 ° c durante 2 min.</li>
	<li>Observe a placa um microscópio invertido da baixo-ampliação, para verificar que as bolhas estiveram removidas dos micropoços. Se forem observadas bolhas presas, centrifugue novamente a 2.000 x g com travões a 25 ° c durante 2 min para remover quaisquer bolhas restantes.</li>
	<li>Cubra a placa com a tampa e incubar por 30 min à temperatura ambiente. Após a conclusão do tratamento, retire a solução de enxaguadela e lave imediatamente a placa com água estéril ou PBS. Assegure-se de que a placa não seque após o tratamento com a solução de enxaguadela.</li>
</ol>6. geração de organóides testiculares
<ol><li>Adicione 0,5 mL de meio de formação organóide (sem células) a cada poço e Centrifugue a 2.000 x g com travões a 25 ° c durante 2 min para remover quaisquer bolhas de ar presas. Observe o poço um microscópio invertido da baixo-ampliação para verificar que as bolhas de ar estiveram removidas. Se forem observadas bolhas presas, centrifugue novamente a 2.000 x g com travões a 25 ° c durante 2 min para remover quaisquer bolhas restantes.</li>
	<li>Adicionar 0,5 mL da suspensão da célula de trabalho e misturar suavemente introduzindo pipetagem para cima e para baixo. Centrifugador a 500 x g com travões a 25 ° c durante 5 min. Use um microscópio invertido para verificar se as células estão agrupadas dentro dos micropoços.</li>
	<li>Transfira a placa em uma incubadora e em uma cultura da cultura da pilha por 5 dias. Mude metade do meio a cada dois dias.<ol>
<li>Para mudar o meio sem perder nenhum organoids, toque a ponta da pipeta à parede do poço e abaixe-a delicadamente para tocar no menisco e para extrair lentamente o meio. Certifique-se de seguir o menisco como ele desce. Para adicionar um meio fresco, toque na ponta da pipeta na parede do poço do mesmo lado que a retirada média e adicione um meio fresco suavemente contra a parede do poço, permitindo que ele flua lentamente para baixo da parede.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para recuperar os organóides, gentilmente pipeta o meio para cima e para baixo usando uma pipeta boca larga. Isso permitiria que os organóides saiam dos micropoços.</li>
	<li>Colete os organóides, lave com PBS, corrija e execute Immunocytochemistry para o marcador da célula germinal (UCH-L1), o marcador da pilha de Sertoli (proteína obrigatória 4-GATA4 de GATA), o marcador myoid peritubular da pilha (α-músculo liso Actin-αSMA) e o marcador da pilha de Leydig (cytochrome P450-CYP450) como descrito12 e visualize um microscópio confocal.</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%28%2Bve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> Embo Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li>
<li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).</li>
<li>Quadrato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+diversity+and+network+dynamics+in+photosensitive+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids.</a> Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).</li>
<li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture%3A+biology%27s+new+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell culture: biology's new dimension.</a> Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).</li>
<li>Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+testicular+organoid%3A+a+novel+tool+for+the+study+of+human+spermatogenesis+and+gonadotoxicity+in+vitrodagger%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitrodagger.</a> Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).</li>
<li>Strange, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+testicular+organoid+system+as+a+novel+tool+to+study+Zika+virus+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis.</a> Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 82-82 (2018).</li>
<li>Alves-Lopes, J. P., Soder, O., Stukenborg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testicular+organoid+generation+by+a+novel+in+vitro+three-layer+gradient+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system.</a> Biomaterials. 130, 76-89 (2017).</li>
<li>Baert, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Human+Testicular+Cells+Self-Organize+into+Organoids+with+Testicular+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties.</a> Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).</li>
<li>Sakib, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+organotypic+testicular+organoids+in+microwell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture.</a> Biology of Reproduction. , (2019).</li>
<li>Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Large+Numbers+of+Size-controlled+Tumor+Spheroids+Using+Microwell+Plates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), 50665(2013).</li>
<li>Sakib, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+organotypic+testicular+organoids+in+microwell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture.</a> Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).</li>
<li>González, R., Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+Mouse+Monopoly%3A+Studying+the+Male+Germ+Line+in+Domestic+Animal+Models%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Beyond the Mouse Monopoly: Studying the Male Germ Line in Domestic Animal Models.</a> ILAR Journal. 56 (1), 83-98 (2015).</li>
<li>Oatley, J. M., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+germline+stem+cell+niche+unit+in+mammalian+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The germline stem cell niche unit in mammalian testes.</a> Physiological Reviews. 92 (2), 577-595 (2012).</li>
<li>Chen, L. Y., Willis, W. D., Eddy, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+Gdnf+Gene+in+peritubular+myoid+cells+disrupts+undifferentiated+spermatogonial+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Targeting the Gdnf Gene in peritubular myoid cells disrupts undifferentiated spermatogonial cell development.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 113 (7), 1829-1834 (2016).</li>
</ol>

Dr. Ungrin tem um interesse financeiro na tecnologia AggreWell como um inventor.

Estabelecemos um método simples que permite a geração consistente e repetível de um grande número de organóides testiculares com arquitetura tecidual que é semelhante ao testis in vivo12. Quando a aproximação foi desenvolvida usando pilhas do testis suínos, é mais extensamente aplicável também ao rato, ao primata não-humano e ao testis humano12. Um número de métodos diferentes foi relatado para produzir organóides testicular8,<sup class="x...

Nos últimos anos, houve um ressurgimento do interesse em três-dimensional (3D) organóides. Os órgãos diferentes tais como o intestine1, o estômago2, o pâncreas3,4, ofígado5, eo cérebro6 foram derivados com sucesso em sistemas organoid 3D. Estes organóides têm semelhanças arquitetônicas e funcionais com os órgãos in vivo e são mais biologicamente relevantes para o estudo do microambiente tecidual do que os sistemas de cultura monocamada7. Como resultado, os organóides testicular começaram a angariar juros, bem como8,9,10,11,12. A maioria dos métodos relatados até o momento são complexos, não-alta taxa de transferência10 e exigem a adição de proteínas ECM8,10. Essa complexidade também leva a problemas de reprodutibilidade. Um método simples e reprodutível é necessário que permite a geração de organóides testiculares com células-associações que são como testis in vivo.
Nós temos relatado recentemente um sistema para endereçar estas exigências12. Usando o porco como modelo, empregamos uma abordagem de agregação forçada centrífuga no sistema de micropoços. No sistema micropoços, cada poço contém um grande número de micropoços menores idênticos13. Isto permite a geração de esferoides numerosos do tamanho uniforme. O sistema de micropoços permitiu a geração de um grande número de organóides uniformes com uma arquitetura específica do testis. O sistema é simples e não requer adição de proteínas ECM.

<table><tbody><tr><td>Placa de cultura de tecidos de ultra baixa fixação de 100 mm</td><td>Corning</td><td>#CLS3262</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de 100 mm</td><td>Corning</td><td>#353803</td><td></td></tr><tr><td>Aggrwell 400</td><td>Stemcell Technologies</td><td>#34411</td><td></td></tr><tr><td>Solução de enxágue antiaderente</td><td>Stemcell Technologies</td><td>#07010</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase tipo IV de Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C5138</td><td>denominada colagenase IV S</td></tr><tr><td>colagenase tipo IV Worthington</td><td>Worthington-Biochem</td><td>#LS004189</td><td>denominada colagenase IV W</td></tr><tr><td>desoxirribonuclease I do pâncreas bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#DN25</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco» s Águia Modificada' s Médio/F12</td><td>Gibco</td><td>#11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águia Modificada' s Média - alta glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#D6429</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfato tamponado solução salina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#D8537</td><td></td></tr><tr><td>Fator de crescimento epidérmico</td><td>R & D Systems</td><td>#236-EG</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de Células Falcon 70 &micro; m</td><td>FisherScientific</td><td>#352350</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de Células Falcon 40 &micro; m</td><td>FisherScientific</td><td>#352340</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-Transferrina-Selênio</td><td>Gibco</td><td>#41400-045</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P4333</td><td></td></tr><tr><td>Tecido testicular suíno</td><td>Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canadá)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriflip-GP Unidade de filtro superior de tubo de centrífuga estéril</td><td>Millipore</td><td>#SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>tripsina-EDTA</td><td>Sigma</td><td>#T4049</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de organóides testicular porcina com a arquitetura específica do testis usando a cultura de micropoços

Generation of Porcine Testicular Organoids with Testis Specific Architecture using Microwell Culture

Os organóides são estruturas tridimensionais compostas de múltiplos tipos de células capazes de recapitular a arquitetura do tecido e as funções dos órgãos in vivo. A formação de organóides abriu diferentes avenidas de pesquisa básica e translacional. Nos últimos anos, os organóides testicular têm ganhou interesse no campo da biologia reprodutiva masculina. Os organóides testiculares permitem o estudo de interações célula-célula, desenvolvimento tecidual, e o microambiente de nicho de células germinativas e facilitam a triagem de drogas e toxicidade de alta taxa de transferência. Um método é necessário para gerar de forma confiável e regerível organóides testiculares com o testículo tecido específico arquitetura. O sistema da cultura do de micropoços contem uma disposição densa de micropoços pirâmide-dados forma. As pilhas testicular derivadas dos testículos pre-pubertal são centrifugadas nestes micropoços e cultivadas para gerar organóides testicular com a arquitetura testis-específica do tecido e as associações da pilha. Milhares de organóides homogêneos podem ser gerados através deste processo. O protocolo aqui relatado será de grande interesse para os pesquisadores que estudam a reprodução masculina.

Células isoladas de 1 semana de testes porcina de idade que foram cultivadas nos micropoços autoorganizados em esferóides (Figura 1A, Figura 2), com exterior delineado e distinto (epitélio seminífero) e compartimentos interiores ( interstício) (Figura 1B, Figura 2). Os dois compartimentos foram separados por um colágeno IV+ ve...

Aqui, nós apresentamos um protocolo para a geração reprodutível de organóides testicular suínos com a arquitetura específica do tecido do testis usando o sistema comercialmente disponível da cultura do de micropoços.

Geração de organóides testicular porcina com a arquitetura específica do testis usando a cultura de micropoços

Organoids are three dimensional structures composed of multiple cell types that are capable of recapitulating tissue architecture and functions of organs ...

Este protocolo é significativo porque permite a geração de organoides testículos, que podem ser usados como plataforma para estudar morotegênese testículo e para exames de alta droga de tropo e toxicidade. A principal vantagem desta técnica é que ela é altamente reprodutível, requer um número relativamente baixo de células e pode ser usada para gerar um grande número de organoides testiculares com arquitetura específica de testis. Esse método pode ser aplicado para estudar outros sistemas, como células-tronco pluripotentes ou células de ilhotas pancreáticas com as otimizações necessárias.Demonstrando o procedimento de digestão enzimática do tecido testicular será Anna Voigt, uma estudante de doutorado do meu laboratório. Colete o testío em um béquer estéril e lave com PBS contendo estreptomicina de penicilina de 1%. Após a lavagem, transfira o testímetro para um prato de cultura de tecido de 100 milímetros com PBS contendo estreptomicina de penicilina de 1%.Use tesouras autoclavadas e fórceps para remover a tunica vaginalis e epidídicos. Transfira o testímetro isolado para um novo prato de 100 milímetros e lave bem com PBS contendo estreptomicina de penicilina de 1%. Corte o testis ao longo do eixo longitudinal diretamente sob a tunica.Em seguida, retire o testé da tunica usando dois fórceps e coloque-o em um novo prato de 100 milímetros contendo 1 mililitro de DMEM com estreptomicina de penicilina de 1%. Pique o testímetro descascado com uma tesoura estéril em pedaços de tecido de um a dois milímetros. Depois de cortar use fórceps estéreis para remover os fragmentos brancos do tecido conjuntivo.Transfira os pedaços de tecido picado para a solução A em um tubo de 50 mililitros e cubra-os até 50 mililitros com DMEM para obter uma concentração de 0,4 miligramas por mililitro para colagenase 4S e uma concentração de 0,8 miligramas por mililitro para colagenase 4W. Coloque o tubo contendo os pedaços de tecido em um banho de água de 37 graus Celsius por 30 minutos. Inverta suavemente o tubo a cada cinco minutos.Após 30 minutos, centrifugar o tubo a 90 vezes G com quebras a 25 graus Celsius por 1,5 minutos. Descarte o supernasce, ad 40 mililitros da solução B, e cubra até 50 mililitros com DMEM para obter uma concentração de 1,2 miligramas por mililitro de colagenase 4W. Coloque o tubo em um banho de água de 37 graus Celsius por 30 minutos e inverta suavemente o tubo a cada cinco minutos.Centrifugar o tubo a 90 vezes G com quebras a 25 graus Celsius por 1,5 minutos. Depois disso descarte o supernasciante, e lave uma vez com PBS com estreptomicina de penicilina de 1%. Colecione cuidadosamente os túbulos de cima e coloque em um novo tubo de 50 mililitros.Cubra o tubo com PBS até 50 mililitros. Centrifugar os túbulos a 90 vezes G com quebras a 25 graus Celsius por 1,5 minutos. Descarte o supernatante e adicione PBS fresco para lavar duas vezes adicionais.Após a última lavagem pbs remova o supernasciente e suspenda-os derretro os túbulos seminiferos em cinco mililitros de PBS. Em seguida, adicione 15 mililitros de 0,25% Trypsin EDTA aos túbulos. Coloque o tubo em um banho de água de 37 graus Celsius e inverta suavemente a cada dois minutos.Após cinco minutos avalie a digestão enzimática dos túbulos para células únicas sob o microscópio com 10 microlitros de amostra em uma placa de cultura tecidual. A cada dois minutos coloque a amostra sob o microscópio para observar. Se a maioria das células únicas pode ser detectada parar a reação com cinco mililitros de FBS e filtrar através de uma malha de 70 mícrons e, em seguida, através de uma malha de 40 mícrons.Centrifugar as células únicas a 500 vezes G com quebras a 25 graus Celsius por cinco minutos. Suspenda-se em 50 mililitros de meio de enriquecimento, e conte o número de células viáveis usando um hemótmetro. Transfira 20 milhões dessa população celular inicial para cada uma das duas placas de Petri de apego ultra-baixa de 100 milímetros e incuba em uma incubadora de cultura tecidual a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 21% de oxigênio por dois dias.Cede 20 a 25 milhões de células da população de células iniciais restantes por prato de cultura tecidual de 100 milímetros em um volume total de oito mililitros de meio de enriquecimento. Coloque o prato em uma incubadora e depois de 1,5 horas certifique-se de que a maioria das células Sertoli estão presas à placa. Incline ligeiramente duas placas para coletar e combinar os supernantes em uma nova placa de 100 milímetros e colocá-la de volta na incubadora.Depois de uma hora, novamente combine os supernacantes de duas placas a uma nova placa de 100 milímetros. Coloque as placas de volta na incubadora durante a noite. Em seguida, colete as células germinativas enriquecidas em duas frações, fração não aderente e fração ligeiramente aderente.Colete o supernatante como a fração não aderente. Para a fração ligeiramente aderente lave as placas suavemente com PBS e trate com dois mililitros de uma diluição de 0,25% Trypsin EDTA por cinco minutos à temperatura ambiente. Pare a reação adicionando dois mililitros de meio de enriquecimento e colete no tubo de fração não aderente.Combine a preparação das células iniciais e as células germinativas enriquecidas em um tubo para obter uma preparação celular de trabalho contendo células germinativas de 25%. Centrífuga a 500 vezes G com quebras a 25 graus Celsius por cinco minutos. Descarte o supernasce e suspenda as células em 20 mililitros de meio de formação organoide para atingir uma concentração de 2,4 milhões de células por mililitro.Em um novo tubo adicione um mililitro da solução que contém células. Adicione 0,5 mililitros de solução de lavagem de surfactante para cada poço em uma placa de micro poço. Certifique-se de que nenhuma bolha de ar está presa no poço.Para remover bolhas de ar centrifugar a placa a 2.000 vezes G com quebras a 25 graus Celsius por dois minutos. Observe a placa sob um microscópio invertido de baixa ampliação para verificar se as bolhas foram removidas dos micro poços. Cubra a placa com uma tampa e incubar por 30 minutos em temperatura ambiente.Após o tratamento ser concluído, remova a solução de lavagem e lave imediatamente a placa com água estéril ou PBS. Adicione 0,5 mililitros de formação organoides médios a cada poço e centrífuga a 2.000 vezes G com quebras a 25 graus Celsius por dois minutos para remover quaisquer bolhas de ar presas. Observe o poço sob um microscópio invertido de baixa ampliação para verificar se as bolhas de ar foram removidas.Adicione 0,5 mililitros da suspensão da célula de trabalho e misture suavemente por pipetar para cima e para baixo. Centrífuga a 500 vezes G com quebras a 25 graus Celsius por cinco minutos. Use um microscópio invertido para verificar se as células se aglomeraram dentro dos micro poços.Transfira a placa para uma incubadora de cultura celular e cultura por cinco dias. Troque metade do meio dia não. Para recuperar os organoides use uma pipeta de boca larga para gentilmente pipetizar o meio para cima e para baixo.Isso permite que os organoides saiam dos micro poços. Colete os organoides, corrija e realize a citoquímica imuno para marcador de células germinativas, marcador celular sertoli, marcador celular myóide peritubular e marcador celular Leydig e visualize sob um microscópio confocal. Neste estudo, células isoladas de testículas porcinas de uma semana de idade que foram cultivadas em micro poços auto-organizados em esferoides com compartimentos exteriores e interiores delineados e distintos.Os dois compartimentos foram separados por uma membrana de porão positiva de colágeno IV. GATA4 células sertoli positivas e células germinativas positivas UCHL1 estavam no compartimento externo na membrana do porão. as células myóides peri-tubulares positivas da ASMA foram localizadas ao longo do interior da membrana do porão, enquanto as células leydig positivas CYP450 estavam no centro do interstício.Esta estrutura é semelhante às condições in situ, onde as células leydig, células myóides peri-tubulares, estão localizadas no interstício, no compartimento intersticial e células germinativas, as células sertoli estão localizadas no epitélio seminifero. É importante garantir que as células que estão sendo usadas para gerar organoides tenham a melhor qualidade. Deve-se prestar atenção cuidadosa durante a fase de experimentação da digestão enzimática.Após este procedimento, os organoides podem ser cultivados a longo prazo para estudar a diferenciação de células germinativas ou analisar para expressão genética e proteínas ou hormônios secretos. A capacidade de criar organoides com associações celulares específicas de testis fornece um novo sistema in vitro para estudar interações célula-células importantes para o desenvolvimento de testis e função de células germinativas.

generation-porcine-testicular-organoids-with-testis-specific

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Nós mostramos um método para a necropsia e a dissecção de modelos do cancro da próstata do rato, focalizando na dissecção do tumor da próstata. Um protocolo passo a passo para a geração de organóides do tumor da próstata do rato é apresentado igualmente.

Geração de organóides tumorais de modelos de camundongo geneticamente modificados de câncer de próstata

A glândula mamária é uma estrutura bicamada, composta por células epiteliais mioepiteleliais externas e internas. Apresentado é um protocolo para preparar organóides utilizando a tripspsinização diferencial. Este método eficiente permite que os pesquisadores manipulem separadamente esses dois tipos de células para explorar questões sobre seus papéis na forma e função da glândula mamária.

Geração de Organóides Mammary mosaicos por Trypsinização Diferencial

Aqui, são descritos quatro métodos para a geração de organoides testiculares testiculares de células testiculares neonatais primárias, ou seja, matriz extracelular (ECM) e ambientes de cultura 2D e 3D livres de ECM. Essas técnicas possuem múltiplas aplicações de pesquisa e são especialmente úteis para estudar desenvolvimento testicular e fisiologia in vitro.

Geração extra-baseada em matriz celular e extra-celular livre de organoides testiculares de murina

Este trabalho apresenta um protocolo de fabricação para um novo tipo de substrato de cultura com centenas de microrecipientes por mm2, no qual organoides podem ser cultivados e observados por microscopia de alta resolução. Os protocolos de semeadura celular e imunocoloração também são detalhados.

Uma plataforma de alto rendimento para cultura e imagem 3D de organoides

Neste trabalho, descrevemos um protocolo de cultivo de organoides 3D intestinais de suínos a partir de criptas epiteliais criopreservadas. Descrevemos também um método para estabelecer monocamadas celulares derivadas de organoides 3D, permitindo o acesso ao lado apical de células epiteliais.

Cultura de Organoides 3D Intestinais de Leitões a partir de Criptas Epiteliais Criopreservadas e Estabelecimento de Monocamadas Celulares

Este protocolo apresenta um método para geração de organoides vasculares utilizando células-tronco pluripotentes humanas.

Geração de Organoides Vasculares a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos

Este estudo descreve um protocolo para gerar monocamadas 2D de organoides suínos derivados dos intestinos delgado e grosso. O crescimento dessas monocamadas é marcado pelo aumento dos valores de TEER, indicando integridade epitelial robusta. Além disso, essas monocamadas exibem respostas secretoras fisiológicas em experimentos de câmara de Ussing após a aplicação de forscolina.

Organoides intestinais suínos bidimensionais refletindo as propriedades fisiológicas do intestino nativo

Este estudo apresenta uma metodologia econômica e eficiente para gerar estruturas celulares 3D usando um sistema baseado em carimbos para criar micropoços em moldes de agarose. O sistema promove a formação de esferóides/organoides uniformes, melhorando assim as interações celulares. Essa abordagem reduz a variabilidade experimental e oferece suporte a aplicações em testes de medicamentos e engenharia de tecidos.

Geração de esferoides/organoides tridimensionais a partir de culturas de células bidimensionais usando um novo dispositivo de carimbo

Descrevemos métodos para isolar células somáticas ovarianas de camundongos a partir de uma fração rica em estroma do ovário e para gerar organoides somáticos ovarianos de camundongos usando uma abordagem sem andaimes.

Sondando o Microambiente Ovariano: Métodos para Isolamento, Cultura 2D e Cultura Organoide de Células Somáticas Ovarianas de Camundongos

As células pluripotentes humanas estaminais (hPSCs) têm o potencial para tratar uma miríade de diferentes doenças. A utilidade destas células reside no facto de que eles podem diferenciar-se em qualquer tipo de célula no corpo. Descrevemos aqui o ensaio teratoma, que é usado para demonstrar a pluripotência das hPSCs.

Geração Teratoma na Cápsula do Testículo

Aprenda a gerar organóides testiculares de suíno com arquitetura específica do testis usando cultura em micropoços. Este método reprodutível permite estudar morfogênese testicular e realizar triagens de drogas e toxicidade.

Geração de organóides testicular porcina com a arquitetura específica do testis usando a cultura de micropoços

Explorar mais vídeos