Avaliação de replicação e função das células beta no Adenovirally transduzidas isoladas ilhotas de roedores

O objetivo geral deste procedimento é identificar vias de sinalização que regulam as mudanças na massa funcional das células beta. Isso é realizado em ilhós de ratos isolados por meio da superexpressão ou supressão da expressão de um gene usando vetores adenovirais. Após essa manipulação, a função das células beta é avaliada pela secreção de insulina e replicação do ilhó medida pela incorporação de timidina tritiada.

Em última análise, esses ensaios podem mostrar se um gene de interesse regula a proliferação de células beta e/ou funciona in vitro. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia das pálpebras, como um componente específico de uma via de sinalização influencia o crescimento e a função das células beta? Prepare uma placa revestida sem cultura de tecidos de seis poços adicionando dois mililitros de meio modificado ao número necessário de poços.

Por exemplo, um experimento típico pode exigir três poços, um para controle sem vírus, um controle de vírus e o grupo experimental aquece a placa a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de tecidos por pelo menos 30 minutos. Imediatamente após o isolamento do ilhó de rato, coloque de um a 200 ilhós em cada poço da placa preparada. 60 ilhós serão usados para ensaios bioquímicos e os ilhós restantes podem ser usados para estudos de expressão gênica ou immuno blotting inchar suavemente a placa para trazer os ilhós para o centro de cada um.

Bem, então pipete imediatamente o adenovírus diretamente nos ilhós. No centro do prato. Use de uma a 500 multiplicidades de infecção, dependendo da eficácia do adenovírus em expressar ou derrubar sua proteína de interesse.

A penetração eficiente do adenoviral no núcleo da pálpebra aumenta a consistência dos resultados. Transdução das pálpebras imediatamente após a pálpebra. O isolamento é essencial.

Não mexa na placa por cinco minutos e depois leve-a para a incubadora por 24 horas. No dia seguinte, remova a placa da incubadora e inche suavemente os ilhós até os centros dos poços. Transferir os ilhós para um novo poço contendo meios frescos utilizando uma micropipeta de 200 microlitros.

Se os ilhós ficarem presos à placa, eles podem ser desalojados suavemente com a ponta da pipeta. É útil usar um vírus de controle expressando GFP para verificar a eficiência de transdução adequada usando microscopia confocal para visualizar a penetração do adenovírus na cultura do núcleo da ilhota. As ilhotas por mais um a três dias, mudando a mídia diariamente.

O tempo de cultivo deve ser otimizado por estudos-piloto e varia de acordo com os objetivos experimentais. Nas últimas 24 horas, incorporar timidina tritiada no meio a uma concentração de um micro curie por milímetro de meio. Primeiro, prepare 50 mililitros do SAB de trabalho em um tubo cônico de 50 mililitros e aqueça-o em banho-maria a 37 graus Celsius.

Pipete 10 mililitros de SAB de trabalho em um tubo cônico de 15 mililitros e adicione 66,8 microlitros de glicose D 2,5 molar. Para preparar o SAB com alto teor de glicose, adicione 44,8 microlitros de glicose 2,5 monolo D aos 40 mililitros restantes do SAB de trabalho. Para preparar o SAB com baixo teor de glicose, rotule três tubos de microcentrífuga de 1,7 mililitro.

Para cada poço da placa de seis poços e adicione um mililitro de PBS a cada tubo. Não se esqueça de seguir os protocolos institucionais para o manuseio e descarte dos ilhós radioativos. Usando um estereoscópio ou microscópio padrão, selecione e transfira 20 ilhós de tamanho comparável para cada tubo de microcentrífuga.

Por exemplo, cada tubo pode conter cinco ilhós pequenos, 10 médios e cinco grandes. Embora os resultados sejam normalizados para o teor total de proteína no final do experimento, é fundamental que o tamanho combine os ilhós entre os grupos. Depois de permitir que os ilhós se depositem no fundo do tubo por gravidade ou por centrifugação, aspire, pese o PBS com uma micropipeta e, em seguida, prossiga com a preparação dos ilhós para os ensaios bioquímicos.

Para preparar os ilhós para o ensaio de secreção de insulina, eles devem primeiro ser pré-incubados com baixo teor de glicose SAB. Para fazer isso, adicione 400 microlitros de SAB com baixo teor de glicose aos tubos e coloque-os com tampas na incubadora de cultura de tecidos Por 60 minutos após uma hora, aspire o SAB com baixa glicose pré-incubação Para medir a secreção basal de insulina. Repita o procedimento de pré-incubação.

No entanto, para medir a secreção de insulina estimulada, use 400 microlitros de SAB de glicose alta em vez de SAB de baixa glicose e, como antes, incube os ilhós por 60 minutos após a incubação em aspirado de SAB de alta ou baixa glicose e o SAB para o radioimunoensaio de insulina, que será executado de acordo com o protocolo do fabricante. Em seguida, prossiga com o ensaio de incorporação de timidina usando a mesma coleção de ilhós. Comece com os ilhós usados apenas para o ensaio de secreção de insulina.

Adicione um mililitro de PBS e deixe os ilhós assentarem por gravidade. Em seguida, aspire o PBS com uma micropipeta. Descarte e repita esta etapa mais uma vez.

Em seguida, adicione 500 microlitros de ácido tricloroacético gelado aos ilhós e incube-os no gelo por 30 minutos. Centrifugue os tubos a quatro graus Celsius. Em seguida, aspiração, descarte o TCA.

Em seguida, adicione 80 microlitros de hidróxido de sódio normal 0,3 e incube os ilhós por 30 minutos em temperatura ambiente. Durante esta incubação, as amostras são vigorosamente agitadas por cinco a 10 segundos a cada 10 minutos. Paralelamente, adicione quatro mililitros de um coquetel de contagem segura de conno a sete tubos de contagem de cintilação líquida de mililitros.

Quando a incubação dos ilhós terminar, adicione 50 microlitros dos ilhós a um tubo de cintilação. Agitar brevemente o tubo tampado e medir a radioactividade das amostras num contador de cintilação líquida. Também para medir a concentração de proteína, transfira 10 microlitros de vilas para um ensaio comercial de ácido biônico e siga o protocolo do fabricante.

Posteriormente, durante a análise dos dados, normalize os resultados para a concentração de proteína usando os protocolos descritos. Replicação do ilhó e função das células beta. Em ilhós de ratos foi avaliada uma superexpressão adenoviral do gene hipotético seis replicação de ilhós fortemente estimulada sem alterar a função das células beta.

Aumento da expressão do gene seis, aumento da síntese de DNA medida pela incorporação de timidina, porque a maioria das células do ilhó de rato são células beta. Experimentos adicionais podem mostrar que esse aumento na incorporação de timidina se deve a um aumento na replicação das células beta. O ensaio de secreção de insulina demonstrou que a superexpressão do gene seis não alterou uma das funções primárias das células beta: secreção de insulina em glicose baixa e alta.

O aumento da secreção de insulina em concentrações baixas e altas de glicose reflete a saúde dos ilhós após o tratamento com adenovírus. Se o aumento da expressão do gene seis prejudicou a função das células beta, isso provavelmente se refletiria como uma diminuição na insulina secretada em altas concentrações de glicose estimulada. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir a replicação das células beta e a secreção de insulina para determinar se um determinado gene influencia o crescimento ou a função das células beta.