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Regular a temperatura no laboratório: preservando amostras usando frio

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Regulating Temperature in the Lab: Preserving Samples Using Cold

1.13: Introduction to Light Microscopy

1.15: Regulating Temperature in the Lab: Applying Heat

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08:07 min

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April 30, 2023

Overview

A preservação de amostras de laboratório, espécimes e reagentes usando frio extremo é realizada rotineiramente em laboratórios de pesquisa biomédica. Este vídeo discutirá alguns dos métodos para manter as amostras de laboratório frias e explicará o método correto de resfriamento a ser usado para cada requisito experimental.

Por exemplo, agentes de resfriamento, como gelo e gelo seco, são normalmente usados ao manter amostras frias durante experimentos. Este vídeo discute as propriedades físicas dos agentes de resfriamento mais usados, bem como as precauções de segurança para trabalhar com eles.

Quando se trata de manter as amostras frias entre experimentos, equipamentos de resfriamento, incluindo geladeiras de nível de laboratório e freezers podem ser usados para preservar amostras por longo período de tempo. Também são discutidos neste vídeo tipos de amostras e reagentes que podem ser armazenados nos equipamentos de resfriamento de laboratório comumente disponíveis.

Finalmente, o conceito de criopreservação é introduzido como um processo através do qual tecidos, células e biomoléculas são resfriados a temperaturas abaixo de zero, parando efetivamente toda a atividade biológica degradante da amostra. Vários métodos de criopreservação são discutidos que minimizam ou eliminam a formação de cristais de gelo prejudiciais.

Procedure

A preservação de amostras de laboratório, espécimes e reagentes, é uma exigência de laboratórios de pesquisa em todo o mundo. Uma maneira eficiente de preservar a integridade e a viabilidade da amostra ao longo do tempo é mantendo-as a temperaturas frias.

Se você está trabalhando com uma amostra no banco, ou armazenando uma amostra no final de um experimento, diferentes métodos de resfriamento podem ser usados. Este vídeo demonstrará os tipos de agentes de resfriamento e instrumentos tipicamente encontrados no laboratório e ajudará você a entender quais tipos de amostras são armazenadas em que temperaturas.

A escolha do agente de resfriamento depende da natureza do procedimento experimental que está sendo realizado.

O gelo convencional é a escolha lógica para preservar amostras a curto prazo. Você provavelmente sabe que o gelo é água congelada, que tem um ponto de fusão de 0 °C na pressão atmosférica normal como você pode ver neste diagrama de fase. Você pode não saber que às vezes é referido como “gelo molhado”, porque se torna líquido à medida que aquece à temperatura ambiente.

“Gelo Molhado” é ideal para manter amostras e reagentes frios enquanto trabalham ou transportam- ou transportá-los.

Enquanto “gelo molhado” é H2O sólido, “gelo seco” é a forma sólida de dióxido de carbono, que tem um ponto de fusão de -78,5 °C. O gelo seco não derrete em líquido à pressão atmosférica, mas se transforma diretamente em gás dióxido de carbono, através de um processo chamado sublimação. A sublimação refere-se a uma mudança na fase da matéria do sólido diretamente para o gás e ocorre abaixo do ponto triplo em um diagrama de fase.

Use gelo seco, quando estiver trabalhando com espécimes biológicos, como células ou tecidos bacterianos congelados ou mamíferos, que geralmente são armazenados a temperaturas bem abaixo de 0°C.

O gelo seco também é vantajoso, pois não deixa resíduos ao mudar de estado, o que o torna ideal para construir um banho de congelamento derramando líquido sobre gelo seco.

Nitrogênio líquido é gás nitrogênio condensado e é. comumente escrito como “LN2”. Na pressão atmosférica o nitrogênio líquido ferve, ou transições do líquido para um gás, a -196 °C, que você pode ver pelo seu diagrama de fase.

Quando você precisa armazenar espécimes biológicos a temperaturas abaixo do que a maioria dos freezers de laboratório podem obter, o nitrogênio líquido é usado.

O nitrogênio líquido pode ser armazenado em um frasco de de guerra, ou a vácuo, com uma tampa de encaixe solta ou um grande tanque de guerra equipado com uma válvula de alívio para evitar o acúmulo de pressão dentro do sistema.

Embora não tóxico, gelo seco e nitrogênio líquido são materiais perigosos e não devem ser manuseados até que você tenha sido treinado por um membro experiente do laboratório.

Devido às temperaturas extremamente baixas de nitrogênio líquido e gelo seco, danos graves nos tecidos podem ocorrer após o contato com a pele. Use sempre proteção adequada, incluindo luvas criogênicas e um jaleco. Use ferramentas para manipular amostras para evitar contato com a pele.

Além disso, recipientes herméticos nunca devem ser usados para armazenar gelo seco ou nitrogênio líquido, uma vez que esses agentes de resfriamento transformam o estado em gás. Sob condições herméticas, a pressão pode aumentar levando a uma explosão.

E agora para os instrumentos que mantêm as amostras frias… Geladeiras de laboratório e freezers regulam a temperatura com mais força do que as encontradas em casa para garantir uma temperatura uniforme em toda a unidade.

Eles são geralmente equipados com sistemas de monitoramento de temperatura e alarmes que disparam após mudanças significativas de temperatura.

Nunca guarde alimentos ou bebidas em geladeiras de laboratório ou freezers, pois isso pode resultar em contaminação com produtos químicos tóxicos ou bactérias. Você terá que encontrar outro lugar para guardar seu almoço.

Os refrigeradores são mantidos a 4°C e geralmente utilizados para armazenamento temporário de amostras, especialmente quando o congelamento pode afetar a integridade da amostra.

Muitos reagentes e soluções são armazenados a 4°C para estender sua vida útil, incluindo mídia de cultura tecidual e placas de cultura celular derramadas, que são aquecidas antes do uso.

As câmaras frias são ideais para armazenamento de equipamentos maiores que devem operar a baixas temperaturas, como unidades de cromatografia líquida.

Os freezers de grau laboratorial variam em temperatura de -20° C a -196 °C para freezers criogênicos.

Para armazenamento de ácidos nucleicos e reagentes, como enzima de restrição, -20 °C é a escolha apropriada. Após a remoção do congelador, amostras e reagentes devem ser mantidos no gelo.

-80°C e freezers criogênicos são adequados para armazenamento de tecido e células congeladas por um longo período de tempo após a criopreservação em nitrogênio líquido. O gelo seco é geralmente usado para transportar amostras retiradas de congeladores de -80 °C.

Criopreservação é um termo que se refere ao armazenamento a longo prazo de tecidos, ou mesmo células vivas. A temperaturas abaixo de zero toda atividade biológica, incluindo reações que degradam a amostra é efetivamente interrompida.

Ao congelar células vivas e tecidos, cristais de gelo podem se formar, levando à desidratação e danos celulares, bem como ao acúmulo de moléculas de soluto a concentrações prejudiciais.

Snap-ou flash-freezing é o processo pelo qual as amostras biológicas são rapidamente submersas em nitrogênio líquido, ou uma mistura de gelo seco e etanol, de modo que grandes cristais de gelo não podem se formar e danificar as células. Os crioprotetores também podem ser usados como aditivos para reduzir a formação de gelo.

Como alternativa ao congelamento de flash, as máquinas podem ser usadas para controlar lentamente o processo de congelamento, que é necessário para criopreservar os embriões de ovelhas que você vê aqui.

Recentemente, a vitrificação foi introduzida como um método para criopreservar células e tecidos sem qualquer dano devido a cristais de gelo. Este processo transforma o líquido na amostra em um sólido não cristalino e vidrado através de um rápido resfriamento na presença de certos crioprotetores.

Você acabou de assistir a introdução do JoVE a espécimes de laboratório de resfriamento e reagentes.

Neste vídeo revisamos diferentes tipos de agentes de resfriamento e equipamentos, e exemplos de quando usar cada método de resfriamento. Também introduzimos várias maneiras de criopreservar espécimes biológicos. Obrigado por assistir.

Transcript

Preservation of laboratory samples, specimens and reagents, is a requirement of research laboratories worldwide. An efficient way to preserve sample integrity and viability over time is by maintaining them at cold temperatures.

Whether you are working with a sample at the bench, or storing a sample at the end of an experiment, different methods of cooling can be used. This video will demonstrate the types of cooling agents and instruments typically found in the lab and will help you understand what types of samples are stored at which temperatures.

The choice of cooling agent is dependent on the nature of experimental procedure being performed.

Conventional ice is the logical choice for preserving samples over the short-term. You probably know that ice is frozen water, which has a melting point of 0 °C at normal atmospheric pressure as you can see in this phase diagram. You might not know that it is sometimes referred to as “wet ice”, because it becomes liquid as it warms at room temperature.

“Wet Ice’ is ideal for keeping samples and reagents cold while working with- or transporting them.

While “wet ice’ is solid H2O, “dry ice’ is the solid form of carbon dioxide, which has a melting point of -78.5 ˚C. Dry ice does not melt into liquid at atmospheric pressure but rather transforms directly into carbon dioxide gas, through a process called sublimation. Sublimation refers to a shift in the phase of matter from solid directly to gas and occurs below the triple point in a phase diagram.

Use dry ice, when you are working with biological specimens such as frozen bacterial or mammalian cells or tissue, which are generally stored at temperatures well below 0˚C.

Dry ice is also advantageous as it leaves no residue upon changing state, which makes it ideal for constructing a freezing bath by pouring liquid over dry ice.

Liquid nitrogen is condensed nitrogen gas and is. commonly written as “LN2”. At atmospheric pressure liquid nitrogen boils, or transitions from liquid to a gas, at -196 °C, which you can see by its phase diagram.

When you need to store biological specimens at temperatures below what most laboratory freezers can obtain, liquid nitrogen is used.

Liquid Nitrogen can be stored in a dewar, or vacuum flask, with a loose fitting lid or a large tank dewar equipped with a relief valve to prevent pressure build-up within the system.

Though non-toxic, dry ice and liquid nitrogen are dangerous materials and should not be handled until you have been trained by an experienced member of the lab.

Due to the extremely low temperatures of liquid nitrogen and dry ice, severe tissue damage can occur upon contact with skin. Always wear proper protection, including cryogenic gloves and a lab coat. Use tools to manipulate samples to avoid contact with skin.

Also, airtight containers should never be used to store either dry ice or liquid nitrogen, since these cooling agents change state into gas. Under airtight conditions, pressure can build leading to an explosion.

And now for the instruments that keep samples cold… Laboratory refrigerators and freezers regulate temperature more tightly than those found in the home to ensure a uniform temperature throughout the unit.

They are generally equipped with temperature monitoring systems and alarms that go off following significant temperature change.

Never store food or drink in lab fridges or freezers, as this could result in contamination with toxic chemicals or bacteria. You’ll have to find another place to store your lunch.

Refrigerators are maintained at 4°C and generally used for temporary storage of samples especially when freezing can affect sample integrity.

Many reagents and solutions are stored at 4°C to extend their shelf life, including tissue culture media and poured cell culture plates, which are warmed before use.

Cold rooms are ideal for storage of larger equipment that should operate at low temperatures, such as liquid chromatography units.

Laboratory grade freezers range in temperature from -20° C to -196 °C for cryogenic freezers.

For storage of nucleic acids and reagents, such as restriction enzyme, -20 °C is the appropriate choice. Upon removal from the freezer, samples and reagents should be kept on ice.

-80°C and cryogenic freezers are suitable for storage of frozen tissue and cells over an extended period of time following cryopreservation in liquid nitrogen. Dry ice is generally used to transport samples taken out of -80 ˚C freezers.

Cryopreservation is a term that refers to the long-term storage of tissues, or even living cells. At sub-zero temperatures all biological activity, including reactions that degrade the sample is effectively stopped.

When freezing living cells and tissue, ice crystals can form, leading to cell dehydration and damage, as well as accumulation of solute molecules to harmful concentrations.

Snap- or flash-freezing is the process by which biological samples are rapidly submerged in liquid nitrogen, or a mixture of dry ice and ethanol, so that large ice crystals cannot form and damage the cells. Cryoprotectants can also be used as an additive to reduce the formation of ice.

As an alternative to flash freezing, machines can be used to slowly control the freezing process, which is needed to cryopreserve the sheep embryos you see here.

Recently, vitrification has been in introduced as a method to cryopreserve cells and tissue without any damage due to ice crystals. This process transforms the liquid in the sample to a non-crystalline, glassy solid through rapid cooling in the presence of certain cryoprotectants.

You’ve just watched JoVE’s introduction to cooling laboratory specimens and reagents.

In this video we reviewed different types of cooling agents and equipment, and examples of when to use each cooling method. We also introduced several ways to cryopreserve biological specimens. Thanks for watching.