Técnicas de Processamento de Olhos implantados com uma prótese de retina para análise histopatológica localizada

O objetivo geral deste procedimento é melhorar a avaliação da segurança da prótese de retina. Isso é feito rotulando primeiro a superfície de um olho enucleado fixado de maneira ideal com corantes de tecido para indicar a posição de um eletrodo implantado. Na segunda etapa, o feixe de eletrodos é removido e o tecido ocular é dissecado em tiras.

Em seguida, as tiras são estabilizadas em ágar e depois embebidas em parafina. Na etapa final, as áreas de interesse marcadas são seccionadas e coletadas em lâminas para coloração. Em última análise, a saúde das áreas implantadas adjacentes a cada eletrodo pode ser avaliada por microscopia de campo claro e imunofluorescência.

A principal vantagem dessa técnica é que o artefato relacionado à fixação e a delaminação podem ser minimizados, enquanto as regiões de tecido adjacentes ao eletrodo podem ser rastreadas com precisão em grandes amostras. Também pode ser usado na avaliação da segurança de novos implantes para outras doenças oculares. Geralmente, os indivíduos novos neste método acharão desafiador porque a retina é propensa à delaminação e um alto nível de destreza é necessário para manusear as amostras.

A demonstração visual desse método é importante porque a marcação e o manuseio do tecido frágil são difíceis de aprender. Antes deste estudo, após o implante com um feixe de eletrodos supracoroidais, os olhos foram previamente processados usando uma técnica não ideal, conforme indicado pela estrela. Esta primeira imagem mostra uma seção ortogonal representativa através da cavidade do feixe de eletrodos.

Observe que a retina é descolada do tecido externo do olho. Isso é particularmente evidente abaixo da região implantada, conforme indicado pela ponta da seta. Observe também que não é possível determinar qual parte da retina estava adjacente a cada eletrodo individual da matriz.

Nesta ampliação maior, existem vários artefatos baseados em liberação regular nas camadas da retina, conforme indicado pelas pontas das setas, bem como um grande descolamento da camada de torpedo, a camada reflexiva do olho felino. Após maior ampliação, pode-se observar que os segmentos externos dos fotorreceptores, bem como o epitélio pigmentado, no entanto, permanecem intactos, sugerindo que descolamentos observados anteriormente ou efeitos colaterais artificiais do processamento em oposição a resultantes de trauma ou patologia in vivo. Assim, a seguinte técnica foi implementada para minimizar esses artefatos relacionados à fixação e delaminação.

Depois de nuclear e fixar os olhos, comece removendo um globo ocular implantado do etanol e aparando cuidadosamente o excesso de tecido, incluindo a conjuntiva e a cápsula do tendão. Apare o nervo óptico para um comprimento de dois a três milímetros. O feixe de eletrodos é visível através da esclera semitranslúcida.

Em seguida, use um pincel de ponta fina para aplicar cuidadosamente corantes histológicos no tecido para rotular os eletrodos com um código de cores predefinido. Tomando cuidado para não borrar o corante. Marcação extra de corante pode ser feita para definir pontos de interesse ou ajudar a alinhar seções.

Aqui, os eletrodos estimulados ao máximo foram marcados com verde. Os outros eletrodos ativos foram marcados em vermelho. Os eletrodos de retorno de diâmetro maior foram coloridos de amarelo e quaisquer guias adicionais ou marcações anatômicas foram rotuladas com corante azul.

Após cinco minutos de secagem ao ar, retorne o globo ao etanol 70% para desidratar o corante. Então, depois de aparar o excesso de tecido do globo ocular de controle não plantado, como acabamos de demonstrar, use as oito suturas de náilon anexadas durante a etapa de nucleação e fixação para alinhar os olhos de controle e implantados como um par espelhado. Em seguida, coloque um gabarito de silicone com as mesmas dimensões do feixe de eletrodos em um local espelhado no controle I correspondente à localização do arranjo no olho implantado.

Em seguida, rotule o globo de controle como acabamos de demonstrar, de modo que cada local do eletrodo implantado tenha um par de controle em um local anatomicamente comparável. Em seguida, remova a matriz de implantes do olho e, em seguida, remova a frente do olho, incluindo a córnea, a íris e o cristalino. Em seguida, remova o fluido vítreo da ocular restante.

Agora disseque o olho implantado em várias tiras de dois milímetros de espessura. Cada um contendo um subconjunto das regiões marcadas com matrizes. A orientação das tiras deve ser selecionada para auxiliar na avaliação de vários aspectos da resposta do tecido ao implante, documentar cuidadosamente a posição das marcações da matriz nas amostras para referência futura.

Em seguida, coloque a tira com o lado a ser cortado primeiro voltado para baixo em uma piscina rasa de ágar liquefeito. Assim que o ágar endurecer, corte ao redor da amostra e coloque-a em um de tecido suportado por inserções de espuma. Depois de dissecar e incorporar o olho de controle, coloque os em forma tamponada neutra e processe-os durante a noite por meio de uma técnica padrão automatizada de processamento de parafina de 12 horas.

No dia seguinte, embutir o tecido processado em parafina com o lado a ser cortado primeiro voltado para baixo. Agora, corte os blocos de parafina em seções de cinco mícrons. Em seguida, monte as seções de cada uma das regiões tingidas em slides.

Para localizar a região DY regularmente, verifique as lâminas ao microscópio. As regiões imediatamente adjacentes a cada ponto tingido da esclera serão aquelas que estavam mais próximas do eletrodo correspondente da matriz. Por fim, manche as seções conforme desejado.

Alta faixa dinâmica. Fotografias macro de um olho felino enucleado com um feixe de eletrodos supracoroidal in situ são mostradas após a fixação com o fixador de Davidson e antes da remoção do arranjo. A esclera translúcida permite a visualização dos eletrodos individuais na matriz.

Conforme indicado com a ponta da seta, os eletrodos são marcados com um esquema de cores de corante predefinido. Essas marcações de corante colocadas com espaçamento regular de marcos anatômicos são usadas para manter a consistência entre os experimentos. Após a remoção do feixe de eletrodos, o olho é dissecado manualmente em tiras de amostra.

As pontas das setas indicam dois dos locais adjacentes do eletrodo na esclera. A linha tracejada indica o plano de seccionamento nesta seção representativa obtida a partir do corte da amostra da figura anterior, a forma bruta da tira de amostra foi preservada com artefatos de tecido diferencial mínimos. Ambas as marcas de corante ainda são visíveis na esclera, conforme indicado pelas pontas das setas.

Embora o corante verde fosse mais resistente que o vermelho, a localização do corante indica a posição de um eletrodo. Portanto, o tecido retiniano adjacente pode ser avaliado quanto ao dano, se houver, causado pela estimulação elétrica, pois visto nesta ampliação, as camadas retinianas adjacentes ao corante verde visto na imagem anterior não foram factualmente destacadas e a morfologia da retina foi preservada aqui. Coloração especial representativa e imuno-histoquímica de seções de tecido da retina processadas de acordo com o protocolo atual são mostradas nesta primeira imagem.

A hematina corou os núcleos celulares de azul enquanto a eoína corou o citoplasma celular, colágeno e tecido de suporte, vários tons de rosa Nesta imagem, o azul rápido luxal corou o azul de mielina. A contra-coloração violeta da crista foi usada para identificar as células ganglionares, colorindo os corpos dos mísseis dentro do azul périco e destacando as células satélites circundantes. Nesta seção tratada com azul de trione de pedreiro, a solução de fusão de ácido escarlate BRIC corou as fibras musculares de vermelho, enquanto o azul de lin corou o colágeno.

Neste caso, o azul da esclera para esta seção corada por ácido periódico shiff os componentes da glicoproteína da membrana basal e os componentes do tecido conjuntivo aparecem roxos, enquanto os núcleos das células de contracoloração hemat toin aparecem em azul. O corte subescleral mostrado nesta imagem foi tratado com azul da Prússia pérola no local da hemorragia. A formação de hemossiderina a partir de glóbulos vermelhos degradados e a liberação de complexos de ferro produziram uma cor roxa.

A adição de vermelho neutro corou os lisossomos de vermelho nesta imagem, anti glutamina Synthes foi corado. Esta enzima degradadora de neurotransmissores encontrada nas células de Mueller em verde se estende em ambas as direções com os corpos celulares de Mueller dentro da camada nuclear interna e a alimentação final da célula de Mueller formando a membrana limitante interna para a coloração da proteína do neurofilamento. Essa proteína do citoesqueleto de cadeia pesada foi rotulada em verde encontrada no soma celular e processa as ligações cruzadas da proteína do neurofilamento com outros neurofilamentos para manter a estrutura dos neurônios.

As células ganglionares e seus axônios podem ser observados nas camadas de células ganglionares e fibras nervosas, enquanto os axônios das células horizontais localizadas na borda externa da camada nuclear interna da retina felina aparecem verdes. Nesta imagem final, a proteína glial fibrilar ácida é mostrada em vermelho, prolifera nas células de Mueller e astrócitos durante a gliose e pode ser vista revestindo a camada de fibras nervosas com células de Mueller formando extensões finas através das camadas internas para as externas da retina. A contracoloração com um DPI em azul permite a visualização das camadas da retina.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de visualizar um fluxo de trabalho de amostra em três dimensões e considerar regularmente a orientação das amostras ao longo do procedimento. Seguindo este procedimento, todos os métodos histológicos podem ser usados para responder a perguntas adicionais relacionadas à segurança após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no desenvolvimento de olhos biônicos avaliarem os níveis seguros de estimulação a longo prazo para pacientes cegos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar a segurança de um implante ocular biônico.