Técnicas de Processamento de Olhos implantados com uma prótese de retina para análise histopatológica localizada

O objetivo geral deste procedimento é aprimorar a avaliação da segurança de próteses retinianas. Isso é realizado primeiramente marcando a superfície de um olho enucleado fixado de forma ideal com corantes teciduais para indicar a posição de um eletrodo implantado. Na segunda etapa, o arranjo de eletrodos é removido e o tecido ocular é dissecado em tiras.

Em seguida, as tiras são estabilizadas em ágar e depois embutidas em parafina. Na etapa final, as áreas marcadas de interesse são seccionadas e coletadas em lâminas para coloração. Por fim, a saúde das áreas implantadas adjacentes a cada eletrodo pode ser avaliada por microscopia de campo claro e imunofluorescência.

A principal vantagem desta técnica é que os artefatos relacionados à fixação e a deslaminação podem ser minimizados, enquanto as regiões de tecido adjacentes ao eletrodo podem ser rastreadas com precisão em amostras grandes. Também pode ser utilizada na avaliação da segurança de novos implantes para outras doenças oculares. Em geral, indivíduos novos neste método acharão desafiador, pois a retina é propensa à deslaminação e é necessário um alto nível de destreza para manipular as amostras.

A demonstração visual deste método é importante porque a marcação e o manuseio do tecido frágil são difíceis de aprender. Antes deste estudo, após a implantação com uma matriz de eletrodos supra-coroidea, os olhos eram previamente processados usando uma técnica não ideal, conforme indicado pela estrela. Esta primeira imagem mostra uma seção ortogonal representativa através da cavidade da matriz de eletrodos.

Observe que a retina está destacada do tecido ocular externo. Isso é particularmente evidente abaixo da região implantada, conforme indicado pela seta. Observe também que não é possível determinar qual porção da retina estava adjacente a cada eletrodo individual da matriz.

Nesta ampliação maior, existem diversos artefatos decorrentes da liberação regular nas camadas da retina, conforme indicado pelas cabeças de seta, bem como uma destacamento acentuado da camada em forma de torpedo, a camada reflexiva no olho felino. Ao aumentar ainda mais, pode-se observar que os segmentos externos dos fotorreceptores, assim como o epitélio pigmentado, permanecem intactos, sugerindo que os destacamentos previamente observados ou efeitos colaterais artifatosos do processamento são decorrentes do procedimento de fixação e não de trauma ou patologia in vivo. Assim, a seguinte técnica foi implementada para minimizar esses artefatos relacionados à fixação e a delaminação.

Após a nucleação e fixação, comece removendo o globo ocular implantado do etanol e corte cuidadosamente os tecidos em excesso, incluindo a conjuntiva e a cápsula tendinosa. Reduza o nervo óptico a um comprimento de dois a três milímetros. O arranjo de eletrodos é visível através da esclera semitranslúcida.

Em seguida, utilize um pincel de ponta fina para aplicar cuidadosamente corantes histológicos ao tecido, rotulando os eletrodos com um código de cores predefinido. Tendo o cuidado de não borrar o corante. Pode-se fazer marcações adicionais com corante para definir pontos de interesse ou auxiliar no alinhamento das seções.

Aqui, os eletrodos maximamente estimulados foram marcados com verde. Os outros eletrodos ativos foram marcados com vermelho. Os eletrodos de retorno de diâmetro maior foram coloridos de amarelo, e quaisquer guias adicionais ou marcações anatômicas foram marcados com corante azul.

Após cinco minutos de secagem ao ar, devolva o globo ao etanol 70% para desidratar o corante. Em seguida, após remover o tecido excedente do globo ocular controle não implantado, conforme acabou de ser demonstrado, utilize os oito pontos de náilon fixados durante a nucleação e o passo de fixação para alinhar os olhos controle e implantado como um par espelhado. Em seguida, posicione um molde de silicone com as mesmas dimensões do arranjo de eletrodos em uma posição espelhada no controle I, correspondente à localização do arranjo no olho implantado.

Em seguida, rotule o globo controle conforme acabou de ser demonstrado, de modo que cada local de eletrodo implantado tenha um par controle em uma localização anatomicamente comparável. A seguir, remova a matriz de implante do olho e, então, remova a parte frontal do olho, incluindo a córnea, íris e lente. Em seguida, remova o humor vítreo da cúpula ocular remanescente.

Agora, dissecar o olho implantado em várias tiras com espessura de dois milímetros, cada uma contendo um subconjunto das regiões marcadas com corante. A orientação das tiras deve ser selecionada para auxiliar na avaliação de diversos aspectos da resposta tecidual ao implante; documentar cuidadosamente a posição das marcações do corante nas amostras para referência futura.

Em seguida, coloque a tira com o lado a ser cortado primeiro voltado para baixo em uma camada rasa de ágar liquefeito. Uma vez que o ágar tenha solidificado, corte ao redor da amostra e coloque-a em um cassete para tecidos suportado por inserções de espuma. Após dissecar e emblocar o olho controle, coloque os cassetes em formalina tamponada neutra e processe-os durante a noite por meio de uma técnica padrão automatizada de processamento em parafina de 12 horas.

No dia seguinte, inclua o tecido processado em parafina com o lado a ser cortado primeiro voltado para baixo. Em seguida, corte os blocos de parafina em seções de cinco mícrons. Depois, monte as seções de cada uma das regiões coradas em lâminas.

Para localizar a região DY, verifique regularmente as lâminas ao microscópio. As regiões imediatamente adjacentes a cada ponto corado da esclera serão aquelas que estiveram em mais próxima proximidade com o eletrodo correspondente da matriz. Por fim, cora as seções conforme desejado.

Alta faixa dinâmica. São apresentadas fotografias macro de um olho felino enucleado com uma matriz de eletrodos supraocoroidais in situ após fixação com fixador de Davidson e antes da remoção da matriz. A esclera translúcida permite a visualização dos eletrodos individuais na matriz.

Conforme indicado pela ponta de seta, os eletrodos são marcados com um esquema predefinido de cores de corante. Essas marcações com corante, posicionadas com espaçamento regular a partir de marcos anatômicos, são utilizadas para manter a consistência entre os experimentos. Após a remoção do arranjo de eletrodos, o olho é dissecado manualmente em tiras amostrais.

As setas indicam dois dos sítios adjacentes ao eletrodo na esclera. A linha tracejada indica o plano de secionamento nesta seção representativa obtida a partir do corte da amostra da figura anterior, sendo a forma geral da tira da amostra preservada com mínimos artefatos teciduais diferenciais. Ambas as marcações com corante ainda são visíveis na esclera, conforme indicado pelas setas.

Embora o corante verde tenha sido mais resistente do que o vermelho, a localização do corante indica a posição de um eletrodo. Portanto, o tecido retiniano adjacente pode ser avaliado quanto a danos, se houver, causados pela estimulação elétrica, como visto nesta ampliação; as camadas retinianas adjacentes ao corante verde observadas na imagem anterior não estavam efetivamente destacadas, e a morfologia retiniana foi preservada aqui. Nesta primeira imagem, são mostradas colorações especiais representativas e imunohistoquímica de secções de tecido retiniano processadas de acordo com o presente protocolo.

A hematina corou os núcleos celulares de azul, enquanto a eosina corou o citoplasma celular, o colágeno e os tecidos de sustentação em diversos tons de rosa. Nesta imagem, o azul rápido luxol corou a mielina de azul. A contracoloração violeta cresteal foi utilizada para identificar as células ganglionares, corando os corpos celulares no peric azul e destacando as células satélites ao redor. Nesta seção tratada com trionato de azul de Mason, a solução de fusão escarlate ácida BRIC corou as fibras musculares de vermelho, enquanto o azul lin corou o colágeno.

Neste caso, a esclera azul nesta seção corada pelo ácido periódico de Schiff mostra os componentes glicoproteicos da membrana basal e os componentes do tecido conjuntivo em roxo, enquanto os núcleos celulares contra-colorados pela hematoxilina aparecem azuis. A seção subescleral mostrada nesta imagem foi tratada com azul da prússia de Pearl no local da hemorragia. A formação de hemossiderina a partir de glóbulos vermelhos degradados e a liberação de complexos de ferro produziram uma coloração roxa.

A adição de vermelho neutro corou os lisossomos de vermelho nesta imagem, enquanto a anti-glutamina sintetase foi corada. Esta enzima degradadora de neurotransmissores encontrada nas células de Müller em verde se estende em ambas as direções, com os corpos das células de Müller na camada nuclear interna e as terminações das células de Müller formando a membrana limitante interna para a marcação da proteína neurofilamento. Esta proteína citoesquelética da cadeia pesada foi marcada em verde, localizada no corpo celular e nos prolongamentos; a proteína neurofilamento se liga covalentemente a outros neurofilamentos para manter a estrutura dos neurônios.

As células ganglionares e seus axônios podem ser observados nas camadas de células ganglionares e de fibras nervosas, enquanto os axônios das células horizontais localizadas na borda externa da camada nuclear interna na retina felina aparecem verdes. Nesta imagem final, a proteína ácida fibrilar glial é mostrada – esta proteína do citoesqueleto em vermelho – que prolifera nas células de Müller e nos astrócitos durante a gliose e pode ser vista revestindo a camada de fibras nervosas, com as células de Müller formando finas extensões que atravessam as camadas retinianas internas até as externas. A coloração de contraste com DPI em azul permite a visualização das camadas retinianas.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de visualizar um fluxo de trabalho amostral em três dimensões e considerar regularmente a orientação das amostras durante todo o procedimento. Após este procedimento, todos os métodos histológicos podem ser utilizados para responder a questões adicionais relacionadas à segurança após o seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para que pesquisadores no desenvolvimento de olhos biónicos avaliassem os níveis seguros de estimulação a longo prazo para pacientes cegos.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como avaliar a segurança de um implante de olho biônico.