Name: Técnicas de processamento Olhos implantados com uma Retinal Prosthesis para localizada análise histopatológica: Parte 2 Epirretiniana implantes com tachas da retina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Aprenda técnicas histológicas para avaliar a saúde ocular adjacente a próteses retinianas epirretinianas com tachas metálicas. Este método permite visualizar a arquitetura celular e a interface tecido-implante in situ.

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Nicole Vella (Macquarie University) pelo fornecimento de reagentes; Alexia Saunder (Instituto de Biônica; BI), Michelle McPhedran (BI), Chris Williams (BI) pelo apoio experimental; a equipe do Centro de Pesquisa Biológica do Royal Victorian Eye and Ear Hospital (RVEEH) para cuidados com os animais; Sue Pierce (RVEEH) por aconselhamento veterinário; Anthony Burkitt (Bionic Vision Austrália; BVA), Tamara Brawn (BVA) e a equipe do BVA pelo apoio administrativo. 
Esta pesquisa foi apoiada pelo Australian Research Council (ARC) por meio de sua concessão Special Research Initiative (SRI) em Bionic Vision Science and Technology para a Bionic Vision Australia (BVA). O Bionics Institute recebe Apoio de Infraestrutura Operacional do Governo de Victoria e também reconhece o apoio do Bertalli Family Trust e do JT Reid Charitable Trust. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito.
Os autores do Bionic Vision Australia Consortia para este manuscrito são (a-z): 
Penelope J. Allen, Owen Burns, Kate E. Fox, Kumaravelu Ganesan, David J. Garret, Hamish Meffin, Joel Villalobos e Jonathan Yeoh.

NOTA: Todos os procedimentos foram aprovados pelo The Royal Victorian Eye and Ear Research &amp; Comitê de Ética do Hospital de animal (RVEEH AEC; # 10-199AB). Os assuntos foram tratados de acordo com o National Health and &quot;Código australiana de Boas Práticas para o cuidado e uso de animais para fins científicos&quot; do Conselho de Pesquisa Médica (2013) e &quot;Prevenção da Crueldade contra os Animais Act&quot; (1986, e alterações). Todos os procedimentos de avaliação e eletrofisiológicas cirúrgicos, clínicos foram realizados sob anestesia e foram feitos todos os esforços para minimizar o sofrimento. 1. A enucleação e Fixação NOTA: Siga o procedimento de enucleação e fixação descritos em detalhes no manuscrito companheiro 16, tomando cuidado extra em torno de cabos de dispositivos ou portas de vitrectomia, se presente. Resumidamente, este envolve: <ol><li> Transcardialmente perfuse o assunto com soro fisiológico morno seguido de buffe neutro frioformalina vermelho. </li><li> Amarre suturas para o globo ocular para servir como pontos de referência. </li><li> Enuclear o olho 16, mantendo os cabos do dispositivo e qualquer apego patches / guias. </li><li> Post-fixar o olho em solução de Davidson para 18 - 36 h. </li><li> Transferir para etanol a 50% para de 6 - 8 horas. </li><li> Transferir para etanol a 70% e refrigerar (4 ° C) até dissecção. </li></ol> 2. remoção do eléctrodo e Dissection. NOTA: Nem todos os implantes epirretiniana terá o mesmo fator de forma, mas, em geral, haverá um conjunto de eletrodos e alguma forma de material de suporte flexível e moldável. Os dispositivos que são pregados à retina apresentam um buraco onde o tack tack de metal penetra na matriz e parte de trás do olho, mantendo-los juntos. <ol><li> Visualize o implante e o ponto em que é fixada à retina. <ol><li> Usando uma lâmina de 15 graus fazer uma incisão trans-corneal circunferencial e retire a tampa da córnea para expose a íris subjacentes e lente. </li><li> Usando uma lâmina de 15 graus, as fibras zonulares disinsert da lente e remover a lente na sua globalidade, a exposição da câmara posterior com o implante epiretiniana e a aderência do metal in situ. </li></ol></li><li> Dependendo do implante e o estudo a ser realizado, remover os componentes estranhas antes de posterior dissecação. NOTA: No presente exemplo, a matriz epiretiniana sendo avaliada consistiu de um pacote hermético eléctrodo diamante e electrónica protótipo alojado dentro de um veículo conformada de silicone (produzida em casa; referem-se a 20). <ol><li> Aqui, extrair cuidadosamente o pacote de eletrodo de diamante por dissecção bem com um bisturi. Deixar o corpo do implante de silicone juntamente com a aderência da retina e os restos da fiação de platina (Figura 2). Se uma matriz / casas incorporado não é parte do projeto do dispositivo sob investigação, então omitir esta etapa (2.2). </li></ol></li><li> Cuidadosamentedissecar uma amostra que inclui a aderência tecido circundante e na orientação desejada. Use tesouras de dissecação fina para cortar tiras de espessura total a partir da parte posterior do olho, incluindo a esclerótica, coróide e retina. Tomar uma amostra, que dá uma secção transversal longitudinal da aderência, que mostra todas as camadas da retina adjacente à aderência (Figura 2) NOTA: A orientação desejada para a amostra pode ser diferente, dependendo do resultado específico desejado. Por exemplo, se se pretende analisar a proximidade dos danos aderência ao disco óptico, em seguida, o disco óptico devem ser incluídos dentro da amostra. </li></ol> 3. A desidratação, a incorporação, montagem, Grinding, coloração, e Imagem <ol><li> Desidratar a amostra ao longo de três dias em estágios progressivos de etanol: <ol><li> Desidratar a amostra em etanol a 70% duas vezes durante 2 horas. </li><li> Desidratar a amostra em etanol a 80% durante 2 horas e, em seguida, duas vezes por S / N. </li><li> Desidratar a amostra em etanol de 90% para 2 hr twice. </li><li> Desidratar a amostra em etanol a 100% durante 2 horas e, em seguida, duas vezes por S / N. </li></ol></li><li> Desidratar a amostra em 100% de acetona, durante 2 horas, duas vezes. <ol><li> Retirar a amostra a acetona e observá-lo sob um microscópio de luz que faça secar em temperatura ambiente. Transferir a amostra para epóxi (consulte o passo 3.4), pouco antes de começar a enrolar / colapso. NOTA: remover líquido dos tecidos moles resulta em células desmoronados e encolhimento. Uma apreciação de quando ocorre a ondulação tecido / colapso é desenvolvido com a experiência. </li></ol></li><li> Prepare resina epoxi de grau médico de acordo com as instruções do fabricante. Para curar a resina, utilizar ou 55 ° C durante 1 h ou 24 horas à temperatura ambiente. Colocar em uma câmara de vácuo durante ~ 5 min a ~ 50 mbar para remoção de bolhas de ar. Regular o vácuo manualmente como um vácuo excessivo fará com que a mistura de epóxi para ferver e desgaseificação não ocorrerá de forma eficaz NOTA: Execute o passo 3.3 concorrentemente com o passo 3.2. </li><li> Incorporar o sample em resina epóxi transparente. Mergulhe o tecido do olho em epóxi desgaseificado em um recipiente lacrado adequada e deixa O / N à temperatura ambiente para a cura. </li><li> Tome cuidado para incorporar a amostra na orientação desejada (Figura 2), redimensionando e re-incorporação ao bloco epoxi curada. Re-incorporar o bloco redimensionada contendo o tecido do olho de modo a que o eixo do comprimento da aderência é orientada paralelamente ao fundo do molde (copo amarelo - Figura 3A). </li><li> Monte a resina em um suporte de amostra de moagem e moagem da amostra (230-250 rpm com água em, moagem manual) usando papel de carboneto de silício (começando com 800 grade; Figuras 3C e 3E). </li><li> Para a coloração, molhe a superfície do solo em toluidine mancha azul por 3-5 min, ou até que a mancha se desenvolve (Figura 3F). </li><li> Enxágüe com água da torneira (Figura 3G). </li><li> Imagem da superfície do solo da amostra com um escopo dissecção de alta potência para visualizar as camadas celulares daretina (Figura 3H). Aplicar uma gota de água destilada sobre a superfície de topo do epóxi em cima da amostra para suavizar o difracção na interface ar-epoxi. Use uma fonte de luz de fibra óptica &quot;pescoço de ganso&quot; para iluminar a amostra. </li><li> Repita os passos 3,6-3,9, cada tempo de moagem de distância uma espessura pré-definido de amostra (incremento exacto e reprodutível mínima moagem de suporte da amostra é de 20 mm). </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar. Irfan Durmo é funcionário da Cochlear Ltd.

Técnicas histológicas padrão são incapazes de processar implantes de metal duro em situ devido às limitações na corte desses objetos com metal, vidro ou até mesmo lâminas de diamante. Em nosso companheiro papel 16, nós mostramos que o uso de uma técnica de fixação de olhos toda modificada poderia reduzir a delaminação da retina artificial. No manuscrito actual, os já estabelecidos afiação e polimento técnica de visualização implantes cocleares 21-23 in situ foi modificada para próteses de retina. A aderência de titânio, usado para proteger um conjunto de eletrodos na retina, epiretinally, foi incorporado em epóxi, juntamente com o tecido do olho ao redor. Este bloco de resina foi então orientada de forma adequada e terreno progressivamente / polido, a fim de revelar a morfologia do tecido adjacente ao tack metal. Imagens da superfície polida do bloco em diversas profundidades foram tomados com um microscópio de dissecção poderoso. Esta técnica é útil para: visualização e Avaliado coming a resposta do tecido adjacente ao implante epirretiniana; para avaliar o trauma cirúrgico associado com a implantação do implante; para determinar a reacção biológica para os componentes de metal duro; e para medir a distância entre o implante e a superfície da retina. Esta técnica será útil em estudos de segurança futuras para visualização em situ da região adjacente a um tack retinal ou outros (por exemplo, metálico) objetos duros no olho. Isto tem aplicação direta na avaliação da segurança pré-clínica de próteses pregado na retina epiretinally. Também pode ser útil para avaliar o dano no tecido da retina em regiões em contacto com os implantes localizados na localização sub-retiniana. Existem várias maneiras de verificar se a técnica foi realizado corretamente. Em cada fase, a retina deve permanecer ligado ao das camadas exteriores do olho. Se houver descolamento de retina artifactual bruto, isto pode índicoscomeram um problema com a fixação. Quando a amostra é incorporado e re-orientada na resina final bloquear a retina, deve ser quase ortogonal com a cara de moagem do bloco; isso vai minimizar o corte oblíquo. É útil para verificar que o número de etapas de moagem incrementais (de tamanho conhecido passo) necessário para percorrer um objecto (tal como uma aderência da retina) correlacionar em conformidade com as dimensões do objecto. A técnica pode ser optimizada de várias maneiras. Arranhões na superfície do bloco de epóxi associado com o processo de moagem pode ser reduzida progressivamente com polimento grau mais fino. Para o presente estudo, foram utilizados 800, 1000, 1200, 2400, 4000 e papel de carboneto de silício de grau. Pasta de diamante, também poderia ser usado para melhorar o acabamento da superfície. Um acabamento de superfície mais fino dá uma imagem de qualidade superior, mas ao custo de tempo de polimento adicional. Outra consideração importante para melhorar o resultado desta técnica é a escolha e qualidade do optics e iluminação utilizada para a captura de imagem. Outras manchas histológicas básicas - particularmente manchas de Nissl, pode ser usado no lugar do azul de toluidina, mas podem exigir uma maior optimização. Algumas manchas irá manchar a resina, bem como o tecido (por exemplo, eosina), por conseguinte, um polonês raso pode ser necessário após a coloração de fundo para remover a descoloração. Manchas especializadas, corantes fluorescentes e de coloração imuno-histoquímica não foi tentada, mas a menos que um resultado muito específico for desejado, o tempo necessário para realizar estas manchas em cada nível de moagem é susceptível de ser proibitivo. No entanto, pode ser possível marcar o tecido como um todo, antes da etapa de incorporação (passo 3.4) 24. A principal limitação desta técnica é que uma vez que a região de interesse foi moído distância, ele não pode ser reactivado, por conseguinte, é prudente capturar muitas imagens (possivelmente redundantes) com uma variedade de ampliações em cada fase de rectificação e polimento. Étambém importante o uso de pequenos incrementos para cada ajuste de profundidade de moagem. Outra limitação desta técnica é que o aumento de resolução óptica e comparado com o tecido montada sobre uma lâmina de vidro e visualizados com um padrão (transmissão) microscópio de luz. Para efeitos de criação de protótipos e avaliar a segurança de um dispositivo de implante novela, a avaliação patológica bruta é de interesse primário. Esta técnica proporciona um método eficiente para a observação de danos clinicamente relevantes associados com uma aderência da retina. Com a prática, o tempo total necessário para coletar moagem, polonês e fotografar uma dada amostra (uma vez incorporados) é comparável ao tempo que seria necessário para a seção de um bloco de parafina ou de congelação. Há também a possibilidade de as técnicas actuais para ser alargado a outras aplicações fora do âmbito dos implantes de retina. Esta técnica é adequado para avaliar o tecido adjacente a um implante de disco, onde a extracção do implante é não feasible ou prejudicaria a interface. Por exemplo, esta técnica poderia ser expandida para avaliar implantes feitos a partir de metal (por exemplo, a platina, o nitinol, etc.) que não podem ser cortados com as técnicas histológicas convencionais, tais como alguns cerebral profunda ou eléctrodos de nervos periféricos, cânulas para administração de fármaco, os stents vasculares ou próteses ortopédicas.

Retinite pigmentosa (RP) é uma doença hereditária que provoca a perda generalizada de fotorreceptores, que são as células na camada mais externa da retina responsável pela transdução de luz, sob a forma de fotões, em actividade neural. É importante ressaltar que pacientes com RP normalmente têm neurônios residuais das outras camadas de sua retina que ainda são funcionais. Próteses de retina são capazes de restaurar alguma visão limitada a esses pacientes, orientando esses neurônios sobreviventes com estimulação elétrica para ativar seu 1,2 via visual. Resultados da Percepção de ensaios clínicos têm mostrado resultados promissores início e, recentemente, alguns dispositivos foram aprovados para uso comercial. Atualmente, existem três principais localizações anatômicas em que as próteses de retina clínicos foram posicionados: epiretinally 3,4, 5,6 e subretinally suprachoroidally 7,8. Diferentes dispositivos utilizam diferentes materiais e sua forma é personalizadopara o local em que estão implantados. No entanto, todos eles criar percepções visuais ativando os neurônios remanescentes da retina com pulsos elétricos. Existe o potencial para qualquer próteses médicas para danificar o tecido circundante devido a efeitos mecânicos da colocação inicial ou forças permanente subsequentes. No caso de estimuladores implantáveis, tais como as próteses da retina, há a consideração adicional, que os parâmetros eléctricos devem situar-se dentro dos limites de segurança. A segurança do paciente é fundamental, por isso os dispositivos devem ser rigorosamente testados em estudos pré-clínicos antes de avançar para a criação de uma clínica 9-15. Em nosso artigo companheiro, foi descrito um método para avaliar a histopatologia localizada do olho ao redor de um implante posicionado no espaço suprachoroidal 16. No presente artigo, são apresentadas uma técnica para a visualização de tecido ocular em torno de um conjunto de eletrodos presos ao retina epiretinally, em uma pré-clínica (felinha) modelo (Figura 1). A localização epiretiniana é a posição mais comumente utilizado para a localização de uma prótese visual. Conjuntos de eléctrodos situados aqui são tipicamente fixado à retina de metal com uma aderência que penetra em todas as camadas do olho 17-20. Antes de as técnicas descritas na presente manuscrito, que era difícil de avaliar com precisão a retina e outros tecidos que circundam imediatamente uma aderência. Fixação padrão olho usando formalina tamponada neutra resultou em danos na retina artefacto devido ao movimento diferencial da retina e esclera contra o ponto fixo da aderência. Portanto, qualquer dano real causado pela aderência e matriz epirretiniana não pôde ser observado com precisão. Além disso, o corte do tecido do olho não pode ser realizada com a aderência da retina in situ como objectos metálicos não pode ser facilmente cortada com aparelhos histológico tradicional; removendo a aderência antes do processamento histológico também foiindesejável como esta também conduziu a danos na retina artificial. O objetivo do presente estudo foi duplo: 1) reduzir retinal artefato descolamento de modo que qualquer dano causado pela aderência ea matriz implante epirretiniana pode ser avaliado de forma confiável; e 2) para visualizar a arquitectura da retina adjacente à aderência sem removê-la. A fim de alcançar este objectivo 1, uma nova técnica de fixação foi utilizada (tal como descrito no artigo associado 16), o que reduz a delaminação da retina artificial. A fim de cumprir o objectivo 2, modificamos um mergulho, moagem e polimento técnica, desenvolvida originalmente para observação in loco de eletrodos de implante coclear 21-23. Os métodos descritos neste manuscrito permitir a visualização da retina circundante e ao lado de um tack in situ, minimizando os danos da retina artifactual e, portanto, permitindo a avaliação precisa de qualquer dano potencial causado pela aderência e matriz epirretiniana.

<table><tbody><tr><td>Acetona</td><td>Chem-Supply</td><td>AA008</td><td>Propanone BHD Grau médico</td></tr><tr><td>Epo-Tek 301 Epóxi</td><td>Tecnologia Epóxi</td><td>Parte A 1675-54-3 Parte B 9046-10-0</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 70-75% v / v</td><td>Merck PTY LTD</td><td>4.10261</td><td>Álcool</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck PTY LTD</td><td>90143</td><td>Álcool</td></tr><tr><td>Toluidina azul O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TegraPol máquina de moagem/polimento</td><td>Struers</td><td>TegraPol-25</td><td></td></tr><tr><td>AccuStop suporte de amostra</td><td>Microscópio óptico Struers</td><td>Accustop</td><td></td></tr><tr><td>Lente objetiva</td><td>Leica</td><td>MZ16</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>2.0x Planapo Câmera</td> de microscópio digital objetivo <td></td></tr><tr><td></td> Software de Microscópio <td>Leica</td><td>DFC-420C</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica&nbsp;</td><td>Pacote de aplicativos v4.1.0</td><td></td></tr></tbody></table>

técnicas de processamento olhos implantados com uma retinal prosthesis para localizada análise histopatológica: parte 2 epirretiniana implantes com tachas da retina

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

As próteses retinianas para o tratamento de certas formas de cegueira estão ganhando força em ensaios clínicos em todo o mundo, com dispositivos comerciais atualmente entrando no mercado. Para avaliar a segurança desses dispositivos, em estudos pré-clínicos, são necessárias técnicas confiáveis. No entanto, os componentes de metal duro utilizados em alguns implantes retinianos não são compatíveis com os processos histológicos tradicionais, particularmente em consideração à natureza delicada do tecido circundante. Aqui descrevemos técnicas para avaliar a saúde do olho diretamente adjacente a um implante de retina fixado epiretinalmente com uma tacha de metal.
As próteses retinianas apresentam feixes de eletrodos em contato com o tecido ocular. O local mais comumente usado para implantação é o local epirretiniana (câmara posterior do olho), onde o implante é preso à retina com uma aderência de metal que penetra em todas as camadas do olho. Métodos anteriores não foram capazes de avaliar o tecido ocular proximal com a aderência in situ, devido à incapacidade das técnicas histológicas tradicionais de cortar objetos metálicos. Consequentemente, tem sido difícil avaliar os danos localizados, se presentes, causados pela inserção de aderências.
Portanto, desenvolvemos uma técnica para visualizar o tecido ao redor de uma aderência e implante de retina. Modificamos uma técnica estabelecida, usada para processar e visualizar tecido ósseo duro ao redor de um implante coclear, para os tecidos moles e delicados do olho. Orientamos e embutimos o tecido ocular fixo, incluindo o implante e a aderência da retina, em resina epóxi, para estabilizar e proteger a estrutura da amostra. As amostras incorporadas foram então moídas, polidas, coradas e fotografadas sob várias ampliações em profundidades incrementais através da amostra. Essa técnica permitiu a avaliação confiável da integridade do tecido ocular e da citoarquitetura adjacente à aderência metálica.

O protocolo de fixação reduziu substancialmente descolamento artifactual e delaminação da retina 16. Orientação do espécime dentro do bloco epoxi foi conseguida consistentemente usando o processo de incorporação de duas etapas descrito. O processo de moagem incrementais exigido um nível moderado de destreza manual para obter os melhores resultados, mas foi ajudado pelo titular ajustável espécime que proporcionou um bom controle sobre a resolução de incremento. Em todos os casos (n = 5), a aderência foi localizado e terra / polido com resultados desejáveis ​​e consistentes. O retinae adjacente às tachas foram resolvidos e coradas de forma adequada. Polimento da superfície do bloco de resina epoxi com um grau P # 800 papel de carboneto de silício era suficiente para a imagem da macroestrutura celular do tecido embebido. Papel de melhor qualidade, ou pasta de diamante podem ser usadas para polir a superfície posterior, em qualquer profundidade, se desejado. Um microscópio de dissecção e de fibra óptica &quot;pescoço de ganso&quot; lighfonte t verificou-se ser adequado para imagiologia da superfície do bloco de solo e a amostra de tecido embebido. A posição da fonte de luz foi variado por tentativa e erro para descobrir uma localização e ângulo que deu a melhor iluminação e contraste através do microscópio. A adição de uma gota de água destilada sobre a superfície do bloco, por cima da amostra, era útil para reduzir a luz caminho de difracção e / ou distorções lisas na interface ar-epoxi. A Figura 4 mostra exemplos de imagens de tecido da retina visualizadas imediatamente adjacente a uma retina de titânio alinhavar usando esta técnica. Descolamento da retina e não-artefactual de dobragem pode ser visto de ambos os lados do silicone (Figura 4A). O eixo de aderência é visível incorporado em silicone; o chefe do tack penetrou na retina e esclera. Há descolamento da retina não artefactual na retina não corado ambos os lados do silicone (Figura 4C). A técnica tem mostrado que, neste exemplo, o there é desorganização da retina adjacente à aderência e compressão da retina de um lado devido a um ângulo oblíquo de inserção. Note-se que as imagens apresentadas são meramente ilustrações do sucesso da técnica, não é representativo de aderência-dano histopatológico em geral. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig1highres.jpg" /> Figura 1. Colocação de um conjunto de eléctrodos epiretiniana. (A) Representação esquemática do olho que mostra uma secção transversal ampliada da parte posterior da esclera, coróide e retina degenerada (falta fotorreceptores). Um conjunto de eletrodos é retratada em azul, aposta epiretinally. (B) assistida por computador desenho de um conjunto de eletrodos epirretiniana. uma, em circuito integrado (&quot;chip&quot;) e um pacote de eletrodo; b, titânio tack da retina; c, habitação silicone de grau médico; d, ponto de saída de chumbo. Painel A modificado de um illustrati originaisem uma cortesia da Bionic Vision Australia, copyright Beth Croce. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52348/52348fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig2highres.jpg" /> Figura 2. remoção do eletrodo e dissecção do olho. High Dynamic Range fotografias macro de um olho felino enucleated com tack epirretiniana in situ. (A) Publicar fixação com fixador de Davidson para preservar a arquitetura da retina 16, o olho enucleado foi dissecado. O pacote conjunto de eléctrodos foi removido a partir do suporte de silicone (contorno quadrado a tracejado indica o local original da disposição de eléctrodos) com a aderência (seta) e corpo do implante de silicone restante. (B) O olho foi dissecada com a secção transversal longitudinal adjacente ao tacha(Linha a tracejado). A aderência continua encravada na parede posterior da ocular (seta), estabilizado predominantemente pela esclera. A secção de tecido contendo a aderência foi preparado por incorporação de resina de moagem e (segmento direito), enquanto que a secção que contém a retina sob o conjunto de eléctrodos foi preparado removido para processamento histológico convencional 16 (segmento à esquerda). A régua com incrementos de 0,5 milímetros é mostrado na borda inferior de cada painel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52348/52348fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig3highres.jpg" /> Figura 3. embedment Epoxy e moagem do tack e tecido da retina. Fotografias da epoxy incorporado e amostra de tecido alinhado, moagem, de coloração e de imagem da aderência e tecido da retina. (A) A tac<html> k amostra foi incorporado em um bloco de resina epóxi. Usando o molde, a amostra foi orientada de modo que o plano longitudinal seja paralela ao fundo do molde. (B) O bloco de epoxi curada que contém a amostra de aderência. (C) O bloco epoxi foi montado num suporte de amostra de moagem, pronto para moer . (D) A amostra foi orientada seções para imaged do tecido chão conter as camadas celulares da retina e eixo longitudinal da aderência. (E) A amostra foi moído usando papel de carboneto de silício em um moinho rotativo. (F) A superfície do solo de o bloco foi corado com azul de toluidina para identificar as camadas da retina. (G) O bloco foi lavado em água corrente para remover o excesso de corante. (H) O toluidine azuis camadas da retina manchado e aderência foram fotografadas usando um espaço da alta dissecção powered. ad / 52348 / 52348fig4highres.jpg &quot;/&gt; Figura 4. imagens de alta potência e baixa da aderência e da retina. Em vários pontos durante as imagens processo de moagem foram tiradas com um escopo de dissecação, mostrando seções longitudinais do tack (asterisco) que penetram através do olho e que saem da esclera (&#39;S&#39; ), silicone (haxixe) e Azul de Toluidina e retina imaculada (&#39;R&#39;) adjacente. Note que esses são imagens de exemplo apenas para demonstrar a presente técnica de visualização, e não são representativos de todos os implantes ou aderência resultados inserção histologia epirretiniana. Restos térreo da fiação de platina são visíveis em painéis AD (&quot;W&quot;). (A) de baixa potência, imagem imaculada do tack penetrar a retina e esclera. (B) Alta imagem alimentado do descolamento de retina e dobrando na retina unstained adjacente à transportadora silicone imagem A. (C) imagem de baixa potência em, no centro do eixo de rumo. <strong&gt; (D) imagem do centro da aderência na imagem C. (E) Em uma amostra separada de alta potência, com nenhuma transportadora silicone, uma imagem de alta alimentado de toluidina retina manchado por baixo do punho tack é mostrado, imediatamente antes da moagem do eixo tack (F) toluidine normal azul arquitetura retinal manchado (GCL: camada de células ganglionares da retina; INL: camada nuclear interna; ONL: camada nuclear exterior; PR: fotorreceptores; T: felino tapetum lucidum). visualizada usando a mesma técnica de moagem . Barras de escala em cada painel são: A e C = 2 mm; B e D = 500 mm; E = 200 um; F = 100 pm.

Aqui descrevemos técnicas histológicas para visualizar o tecido ocular diretamente adjacente a uma aderência epirretiniana de metal e prótese de retina.

Técnicas de processamento Olhos implantados com uma Retinal Prosthesis para localizada análise histopatológica: Parte 2 Epirretiniana implantes com tachas da retina

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

Próteses retinianas com componentes metálicos rígidos não são compatíveis com processos histológicos tradicionais. Aqui descrevemos técnicas para avaliar a saúde do olho diretamente adjacente a um implante retiniano fixado epirretinianamente com um T metálico. Isso é realizado primeiramente nucleando e fixando o olho de acordo com o protocolo descrito em um vídeo complementar, e então dissecando uma amostra de tecido, que inclui o implante e o T retiniano. O segundo passo consiste em desidratar progressivamente a amostra de tecido e, em seguida, embuti-la em uma resina epóxi na orientação desejada, utilizando um processo de inclusão em duas etapas. Em seguida, o bloco final de resina é montado em um suporte especial e lixado progressivamente até que uma seção transversal através do implante e do tecido ocular circundante seja exposta no nível desejado.O passo final consiste em realizar a coloração da superfície do tecido exposto e, em seguida, obter imagens e fotografias com um microscópio estereoscópico de alta potência para visualizar a arquitetura celular adjacente à prótese implantada. Esses passos são então repetidos várias vezes conforme necessário. Em última análise, uma série de imagens em corte transversal do fragmento de tecido, incluindo o implante in situ, é coletada e pode ser utilizada para aprimorar o projeto do dispositivo ou da cirurgia, bem como auxiliar na avaliação da segurança da prótese específica.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a histologia de corte tradicional com lâmina, é que objetos implantados no coração, incluindo componentes metálicos, podem permanecer in situ durante o procedimento, permitindo a visualização da interface entre o implante e o tecido. Este método pode responder perguntas fundamentais na área de próteses retinianas, como a avaliação da integridade estrutural do tecido ocular delicado adjacente a uma prótese retiniana implantada. Após a enucleação do olho e fixação conforme descrito em um vídeo complementar do JoVE, visualize o implante e o ponto onde ele está fixado na parte externa do olho.Usando uma lâmina de 15 graus, faça uma incisão transcorneana circunferencial e remova a tampa corneana para expor o interior do globo ocular. Observe que a lente já foi removida previamente durante a lentectomia com vitrectomia, que faz parte do procedimento cirúrgico para este implante epirretiniano.Em seguida, desinfete, insira a íris e quaisquer fibras Z residuais da lente para expor a câmara posterior com o implante epirretiniano e o metal T in situ. Dependendo do implante e do estudo sendo realizado, remova componentes desnecessários antes da dissecação adicional. No exemplo atual, a matriz epirretiniana em avaliação consiste em um protótipo hermético, com eletrodo de diamante e pacote de eletrônicos alojado em um suporte conformal de silicone.Disseque cuidadosamente uma amostra que inclua o pino e o tecido circundante na orientação desejada. Use tesoura de dissecação fina para cortar tiras de espessura total a partir da parte posterior do olho, incluindo esclera, coroide e retina. Aqui, extraia cuidadosamente o pacote do eletrodo de diamante por meio de dissecação fina com o bisturi.Deixe o corpo de silicone do implante junto com o grampo retiniano e os restos dos fios de platina. Colete uma amostra que forneça uma seção transversal longitudinal do grampo, mostrando todas as camadas da retina adjacentes ao grampo. Em seguida, devolva a amostra ao etanol 70%.Desidrate a amostra ao longo de três dias em etapas progressivas de etanol. Primeiro, desidrate a amostra em etanol 70% por duas horas, duas vezes. Em seguida, desidrate a amostra em etanol 80% por duas horas, duas vezes, e depois, no dia seguinte, desidrate a amostra em etanol 90% por duas horas, duas vezes; prossiga então com a desidratação da amostra em etanol 100% por duas horas, duas vezes, e depois durante a noite.Por fim, desidrate a amostra em acetona a 100% por duas horas, duas vezes. Remova a amostra da acetona e observe-a em um microscópio óptico enquanto seca ao ar à temperatura ambiente. A remoção do líquido dos tecidos moles resulta no colapso das células e na contração.A amostra será transferida para epóxi pouco antes de começar a enrolar e colapsar. A percepção do momento em que ocorre o enrolamento e o colapso do tecido é desenvolvida com a experiência. Para incluir a amostra em resina epóxi transparente, imerja o tecido ocular em epóxi liquefeito em um recipiente vedável apropriado.Degase suavemente o epóxi em uma câmara de vácuo e deixe-o curar durante a noite à temperatura ambiente. Tenha o cuidado de embutir a amostra na orientação desejada, redimensionando o epóxi curado e a amostra com uma serra de fita e palheta. Coloque o bloco redimensionado contendo o tecido ocular em epóxi recém-liquefeito de modo que o eixo longo do pino fique orientado paralelamente ao fundo do molde. Use uma gota de cola instantânea para fixar a amostra redimensionada ao fundo do porta-amostras.Encha o suporte da amostra com epóxi liquefeito e desgaseifique como antes, deixando curar durante a noite. Em seguida, monte a resina em um suporte para lixamento e lixe manualmente a amostra a 230 a 250 rpm com água corrente, utilizando papel de carbeto de silício. Para coloração, mergulhe a superfície lixada na solução de azul de toina por três a cinco minutos ou até que a coloração se desenvolva.Após enxaguar a amostra com água da torneira, visualize a superfície cortada do espécime com um microscópio estereoscópico de maior aumento. Para visualizar as camadas celulares da retina, aplique uma gota de água destilada na superfície superior do epóxi, logo acima do espécime. Para suavizar a difração na interface ar-epóxi.Utilize uma fonte de luz com fibra óptica tipo pescoço de ganso para iluminar a amostra. Repita as etapas de desgaste e de obtenção de imagens cada vez que desgastar uma espessura predefinida da amostra. O incremento mínimo de desgaste preciso e reprodutível do suporte da amostra é de 20 mícrons.Esse processo é repetido de forma incremental até que uma seção transversal através do implante e do tecido ocular circundante seja exposta no nível desejado. Abaixo são apresentadas imagens de exemplo do tecido retiniano visualizado imediatamente adjacente a um pino retiniano de titânio em diversos pontos durante o processo de desgaste. As imagens mostram cortes longitudinais do pino atravessando o olho e saindo pela esclera, com retina adjacente contendo silicone e corada ou não corada com azul de toluidina.Descolamento e dobramento retinianos não artifatos podem ser observados em ambos os lados do silicone, tanto em baixa quanto em alta ampliação. O eixo do grampo está visível, embutido no silicone, e a cabeça do grampo penetrou a retina e a esclera. Aqui, fica evidente que há descolamento retiniano não artifatos na retina não corada em ambos os lados do silicone, visualizado tanto em baixa quanto em alta ampliação.O exemplo mostrou que há desorganização retiniana adjacente ao grampo e compressão da retina em um dos lados devido a um ângulo de inserção oblíquo. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de embutir, orientar e cortar a amostra cuidadosamente, de modo que as superfícies resultantes fiquem alinhadas no plano desejado. Além disso, várias fotografias devem ser obtidas em cada estágio de desgaste, já que as amostras desgastadas não podem ser recuperadas hoje.Este método pode fornecer informações sobre a histologia de próteses retinianas. Também pode ser aplicado para visualizar a interface entre o dispositivo e o tecido em outros sistemas que utilizam componentes implantados rígidos, como implantes cerebrais profundos, stents vasculares ou próteses ortopédicas.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

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Uma técnica simplificada para<em&gt; In situ</em&gt; Excisão de Córnea e evisceração de tecido da retina do globo ocular humano

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Técnicas de Processamento de Olhos implantados com uma prótese de retina para análise histopatológica localizada

O protocolo descrito aqui é para avaliação estrutural de uma preparação retiniana de montagem total. Isso inclui descrições de dissecção tecidual, montagem em uma inserção de membrana de politetrafluoretileno (PTFE) hidrofilizada, carregamento em bolus com marcadores fluorescentes e uma comparação da fixação com carbodiimida e paraformaldeído para análise imuno-histoquímica de componentes celulares e sinápticos.

Protocolo otimizado para preparação de montagem total da retina para imagem e imuno-histoquímica

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Realizando Subretinal Injeções em roedores para entregar epitélio pigmentar da retina células em suspensão

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A Passo a Passo Protocolo de Cirurgia sub-retiniana em Coelhos

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Subretinal transplante de células epiteliais de pigmento retinal derivado de células-tronco embrionárias humanas em um modelo de grandes olhos de atrofia geográfica

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Caracterização de uma nova técnica de cultura de retina organotipípica humana

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Otimizando a configuração e as condições do eletrorretinograma ex vivo para estudar a função da retina em olhos pequenos e grandes

Descrevemos um método para separar eficientemente o epitélio pigmentar da retina (EPR) da retina em olhos humanos e gerar montagens planas inteiras de EPR/coroide para análises histológicas e morfométricas da EPR.

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Técnicas de processamento Olhos implantados com uma Retinal Prosthesis para localizada análise histopatológica: Parte 2 Epirretiniana implantes com tachas da retina

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