Determinação de ácidos graxos tolerável e Concentrações toxina da cólera Usando Humanos células epiteliais intestinais e BALB / c mouse macrófagos

O objetivo geral deste procedimento é determinar as concentrações toleráveis de ácidos graxos e da toxina da cólera que não influenciem negativamente a sobrevivência celular. Isso é realizado primeiramente cultivando o tipo apropriado de células. O segundo passo é incubá-las com diferentes concentrações dos três ácidos graxos a serem testados ou com a toxina da cólera.

Após 24 horas, a sobrevivência celular é avaliada utilizando um ensaio de MTT. Em última análise, os dados de espectrometria do ensaio de MTT mostram as concentrações ideais de ácidos graxos e toxina da cólera com as quais as células podem ser tratadas sem redução significativa na sobrevivência. As implicações dessa técnica estendem-se para a prevenção de infecções por cólera, pois as vacinasnem sempre são eficazes.

Macrófagos de camundongos Mus musculus da linhagem Bowel C serão utilizados para todas as determinações de co-toxina e para a determinação em maior escala da concentração de ácidos graxos. As células são cultivadas em um dos dois meios seguintes: DMEM com L-glutamina suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de antibiótico-antimicótico, ou meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 5% de L-glutamina e 1% de antibiótico-antimicótico. Para este protocolo, cultivar as células Bowel C em frascos Corning de 75 cm² com tampas ventiladas, a 37 °C, 95% de ar e 5% de dióxido de carbono. Para a determinação da concentração de ácidos graxos em pequena escala, utilizar células epiteliais intestinais humanas cultivadas em frascos Corning de 75 cm² com tampas ventiladas, em meio Hypercare suplementado com 10% de FPS e 30 nanogramas por mililitro.

O EGF humano não utiliza reagentes antibióticos antimicóticos conforme as instruções do fabricante; incubar a 37 graus Celsius, 95% de ar e 5% de dióxido de carbono. Repicar todas as células na proporção de um para três quando atingirem aproximadamente 70% de confluência, dependendo do tipo celular. Normalmente, as células são repicadas a cada dois a cinco dias antes do tratamento com ácidos graxos. Preparar primeiro os ácidos graxos: transferir os ácidos oleico, linoleico e linolênico das ampolas de vidro fornecidas pela empresa para frascos de vidro esterilizados. Em seguida, transferir cada ácido graxo para um tubo de eppendorf esterilizado separado.

Dissolva cada ácido graxo em etanol 100% numa diluição de um para seis, seguida pela adição de meio RPMI 1640 incompleto até uma concentração final de 10 microgramas por microlitro. Agite cada solução em vórtex e transfira-as para frascos de vidro para armazenamento na placa do congelador a menos 20 graus Celsius.

Células epiteliais intestinais humanas a 2.500 células por poço em placas de cultura de tecido de 96 poços, adicione o meio completo apropriado para atingir um volume total de 200 microlitros por poço. Incube as células a 37 graus Celsius, 95% de ar e 5% de dióxido de carbono por 24 horas.

Após o período de proliferação de 24 horas, remova o meio. Adicione às poças as concentrações apropriadas de cada ácido graxo a ser testado como controle positivo. Incube as células com meio completo como controle negativo e incube as células com etanol a 70%.

Após isso, adicione meio completo para levar o volume total de cada poço a 200 microlitros. Incube as placas tratadas por 24 horas antes de iniciar o ensaio de MTT para preparar a toxina do cólera para os tratamentos celulares. Dissolva a toxina do cólera em PBS na concentração de um miligrama por mililitro.

Aliquotar a solução em frascos criogênicos e armazenar entre dois e oito graus Celsius antes dos tratamentos celulares. Diluir a toxina na proporção de um para cem em PBS esterilizado ou DMEM incompleto para obter uma concentração final de trabalho de um nanograma por microlitro por placa. Macrófagos a 2.500 células por poço em 96.

As placas de cultura de tecidos em poços são incubadas a 37 graus Celsius, 95% de ar e 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Após o período de proliferação de 24 horas, remova o meio e adicione às cavidades as concentrações testadas apropriadas de toxina da cólera. De maneira semelhante aos tratamentos com ácidos graxos, incube as células com meio completo como controle positivo e etanol a 70% como controle negativo para todas as amostras e tratamentos.

Utilize no mínimo três replicações, com mais replicações para os controles positivos. Adicione meio completo para levar o volume total de cada poço a 200 microlitros. Incube as placas tratadas com toxina do cólera por 24 horas antes de iniciar o ensaio de MTT.

24 horas após as células terem sido tratadas com ácidos graxos ou corante, a viabilidade celular é determinada pelo ensaio MTT. Remova a solução de cada poço da placa de 96 poços a ser testada e substitua por 200 microlitros de uma solução fresca de meio completo.

Adicione 10 microlitros de uma solução de MTT recém-preparada a 2,5 miligramas por mililitro a cada poço. Incube a placa a 37 graus Celsius por três a quatro horas. Após três a quatro horas, descarte a solução do meio e adicione 100 microlitros de ácido clorídrico 0,04 molar em isopropanol a cada poço.

Incube bem a placa à temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, transfira a solução de cada poço para um tubo de centrífuga e centrifugue a 20.000 ×g por um minuto ou até a formação de um pellet. Transfira entre 20 e 40 microlitros de cada amostra para um leitor de microplacas e leia a absorbância a 570 nanômetros utilizando um espectrofotômetro.

Esta figura mostra a sobrevivência da maioria dos macrófagos representada como uma função do controle positivo para tratamentos utilizando concentrações crescentes de ácido oleico, ácido linoleico e ácidos linoleicos. É evidente que as células não toleram concentrações acima de 100 nanogramas por microlitro para nenhum dos ácidos graxos. O experimento foi repetido utilizando células epiteliais humanas para concentrações inferiores a 100 nanogramas por microlitro em incrementos de 10 nanogramas por microlitro, até 70 nanogramas por microlitro.

Este gráfico mostra a sobrevivência celular para cada concentração de ácido oleico. Um teste de Inova indicou que uma ou mais das médias eram estatisticamente diferentes. No entanto, apenas os tratamentos em concentrações mais altas apresentaram médias estatisticamente diferentes daquela do controle positivo.

Curiosamente, as diferenças observadas foram devidas a um aumento na viabilidade celular com maior variabilidade. Resultados semelhantes foram obtidos para os ácidos linoleico e linoleico. Uma maneira.

Inova indicou que nenhuma das médias dos tratamentos diferiu estatisticamente da média do controle positivo, mas a variabilidade parece aumentar em algumas das concentrações mais altas, como 60 nanogramas por microlitro de ácido linoleico ou ácido linoleico a partir desses resultados. As concentrações ideais de ácidos graxos ao utilizar células epiteliais intestinais humanas parecem estar entre um e cinco nanogramas por microlitro. Os efeitos de concentrações variadas de toxina collar sobre a sobrevivência da maioria dos macrófagos também foram testados, com tratamentos em níveis de toxina em incrementos relativamente grandes.

Observou-se uma tendência decrescente na viabilidade celular, conforme esperado, já que a viabilidade celular variou bastante para cada tratamento. A grande variabilidade na viabilidade resultou em nenhuma diferença significativa entre a média do controle positivo e qualquer um dos tratamentos, o que levou à realização de testes adicionais com níveis de toxina de 100 nanogramas ou menores. Este gráfico mostra a viabilidade celular para os tratamentos com níveis menores de toxina.

A viabilidade celular é altamente variável para quase todas as concentrações de toxina, embora pequenos aumentos tenham sido observados na viabilidade como resultado dos tratamentos. Esses aumentos não são estatisticamente significativos para nenhum dos tratamentos em comparação com a média do controle positivo. Com base nesses resultados.

A concentração recomendada da toxina color é inferior a 30 nanogramas por tratamento ao utilizar macrófagos de camundongo bowel C após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de pesquisa color explorarem se ácidos graxos podem potencializar a imunidade contra infecção por vio cholera.