Aplicação de um rato ligado patch Peyer Assay alça intestinal para avaliar absorção pelas células bacterianas M

O objetivo geral deste procedimento é examinar a captação bacteriana por células M localizadas no sistema imunológico da mucosa intestinal. O primeiro passo deste procedimento é expor e ligar os folículos linfoides intestinais de um camundongo anestesiado. Em seguida, bactérias fluorescentes são injetadas na área ligada.

Uma hora depois, os fragmentos de tecido são excisados. As células no tecido são então permeabilizadas e coradas para o marcador de células M, GP dois. Finalmente, as amostras são observadas usando um microscópio confocal e as bactérias em trânsito através das células M podem ser visualizadas.

Além de fornecer informações sobre a base molecular da transcitose bacteriana por células M, o método pode ser aplicado a outros sistemas. Por exemplo, este protocolo poderia ser utilizado para auxiliar na avaliação da permeabilidade celular e no intestino delimitado usando cloro e microrganismos. Usando um alisador de vidro estéril, faça o esgotamento das bactérias fluorescentes em uma placa de ágar LB e incube a placa a 37 graus Celsius até que colônias isoladas se tornem visíveis. Escolha uma única colônia do ágar sólido e inocularla em dois mililitros de meio LB fresco.

Em seguida, cultive as bactérias em agitador durante a noite a 37 graus Celsius. Uma vez que a cultura inicial tenha crescido, transfira 500 microlitros de bactérias para 4,5 mililitros de meio LB e incube esta nova cultura a 37 graus Celsius por três a quatro horas ou até que sua densidade óptica em 600 nanômetros atinja um, indicando que o crescimento bacteriano está na fase logarítmica. Neste ponto, centrifugue a cultura a 3000 ×g por cinco minutos a 4 graus Celsius para colher as bactérias; após a centrifugação, descarte o sobrenadante e lave o pellet com 5 mililitros de PBS estéril. Após repetir a etapa de lavagem, ressuspenda as bactérias em 5 mililitros de PBS.

Após posicionar o camundongo sob anestesia contínua com isoflurano, utilize ferramentas estéreis para abrir assépticamente o abdômen do camundongo. Comece expondo o intestino delgado e localize os folículos linfoides associados ao intestino (PI). Uma vez encontrado um folículo PI, utilize fio cirúrgico estéril para ligar o intestino a cerca de cinco milímetros de um dos lados da placa.

Tenha cuidado para evitar a seção de vasos sanguíneos durante o procedimento. Uma vez que o intestino for ligado, use uma seringa para injetar 50 microlitros de suspensão bacteriana contendo cerca de 10 elevado a sete UFC no segmento ligado do patch de Peyer no lado solto do intestino. Em seguida, use barbante para ligar o outro lado do intestino.

Feche o abdômen do camundongo com um clipe e mantenha o animal anestesiado por uma hora antes de eutanasiá-lo. Para coletar o fragmento de Peyer, remova cuidadosamente o fragmento de Peyer. Em seguida, lave vigorosamente com PBS várias vezes o segmento intestinal coletado, a fim de limpar a face apical do fragmento de Peyer e remover o excesso de fluido mucoso e bactérias.

Após a lavagem do fragmento de PI, coloque-o em um poço de uma placa de 24 poços e adicione a solução cyto effects ou cyto perm. Incube a amostra no gelo por uma hora. Após o fragmento de PI ter sido fixado, mergulhe-o em um mililitro de tampão de lavagem perm por cinco minutos.

Repita este passo de lavagem três vezes. Em seguida, coloque a amostra em um mililitro de tampão bloqueador e incube-a em gelo por 30 minutos. Após a etapa de bloqueio, adicione anticorpo monoclonal anti-murino GP dois até uma concentração final de cinco microgramas por mililitro e incube a amostra durante a noite a quatro graus Celsius para corar as células M.

Em seguida, lave a amostra como anteriormente. Adicione um anticorpo secundário conjugado e incube a amostra no gelo, no escuro, por duas horas. Após a amostra ser corada, lave-a suavemente em PBS.

Em seguida, coloque três ou quatro pedaços de lamínulas circulares sobre uma lâmina e incorpore o fragmento de pires em 200 microlitros de uma solução de glicerol a 30% em PBS. Na lâmina, utilize um microscópio confocal a laser DM IRE2 ou um microscópio de desconvolução Delta Vision para observar a amostra. Nesta imagem, pode-se observar que a *Salmonella typhimurium* marcada com GFP verde está cercada pela GP2, mostrada em vermelho, na membrana plasmática apical.

Nesta imagem rotacionada, as bactérias são visíveis dentro das vesículas citoplasmáticas subapicais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como avaliar a transcitose bacteriana por células M utilizando o ensaio de Lu intestinal pós ligado.