Aplicação de um rato ligado patch Peyer Assay alça intestinal para avaliar absorção pelas células bacterianas M

O objetivo geral deste procedimento é examinar a captação bacteriana por células M localizadas no sistema imunológico da mucosa intestinal. O primeiro passo deste procedimento é expor e ligar as placas de piras intestinais de um camundongo anestesiado. As bactérias fluorescentes são então injetadas na área ligada.

Uma hora depois, as manchas de piras são extirpadas. As células do tecido são então permeadas e coradas para o marcador de células M, GP dois. Finalmente, as amostras são observadas usando um microscópio confocal e as bactérias sendo transcitose por células M podem ser visualizadas.

Além de fornecer informações sobre a base molecular da transcitose bacteriana por células m, a rejeição pode ser aplicada a outros sistemas. Por exemplo, este protocolo pode ser usado para auxiliar a permeabilidade celular e no intestino emoldurado usando cloro e micróbio Usando um espalhador de vidro estéril, listre as bactérias fluorescentes em uma placa de trado LB e incube a placa a 37 graus Celsius até que colônias únicas sejam visíveis. Escolha uma única colônia da broca sólida e inocule-a em dois mililitros de meio LB fresco.

Em seguida, cultive as bactérias em uma coqueteleira durante a noite a 37 graus Celsius. Uma vez que a cultura inicial tenha crescido, transfira 500 microlitros de bactérias para 4,5 mililitros de meio LB e incube essa nova cultura a 37 graus Celsius por três a quatro horas ou até que sua densidade óptica a 600 nanômetros atinja um, indicando que o crescimento bacteriano está em fase logarítmica. Neste ponto, centrifugue a cultura a 3000 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius para colher as bactérias após a centrifugação, descarte o snat e lave o pellet com cinco mililitros de PBS estéril Depois de repetir a etapa de lavagem Resus suspenda as bactérias em cinco mililitros de PBS.

Depois de colocar o camundongo sob anestesia contínua com flúor, use ferramentas estéreis para abrir assepticamente o abdômen do camundongo. Comece expondo o intestino delgado e localize as placas do IP. Uma vez que os adesivos de um PI tenham sido encontrados, use fios de costura estéreis para ligar o intestino cerca de cinco milímetros para um lado do adesivo.

Tome cuidado para evitar o corte dos vasos sanguíneos durante o procedimento. Uma vez que o intestino esteja ligado, use uma seringa para injetar 50 microlitros de suspensão bacteriana cerca de 10 a sete UFC no laço de remendo de piras ligadas no lado solto do intestino. Em seguida, use o fio para ligar o outro lado do intestino.

Feche o abdômen do camundongo com um clipe e mantenha o camundongo sob anestesia por uma hora antes de sacrificá-lo. Para colher o remendo das piras, excise cuidadosamente o remendo das piras. Em seguida, lave vigorosamente o PBS através da seção colhida do intestino várias vezes para lavar o lado apical do adesivo do IP e remover o excesso de fluido mucoso e bactérias.

Uma vez que o adesivo do PI é lavado, coloque-o em um poço de uma placa de 24 poços e adicione efeitos de cito ou solução de perm de cito. Incubar a amostra no gelo durante uma hora. Assim que o adesivo P'S estiver consertado, mergulhe-o em um mililitro de tampão de lavagem permanente por cinco minutos.

Repita esta etapa de lavagem três vezes. Em seguida, coloque a amostra em um mililitro de tampão de bloqueio e incube-a no gelo por 30 minutos. Após a etapa de bloqueio, adicione anticorpo monoclonal anti mouse GP dois a uma concentração final de cinco microgramas por mililitro e incube a amostra durante a noite a quatro graus Celsius para corar as células M.

Em seguida, lave a amostra como antes. Adicione um piso secundário para o anticorpo conjugado e incube a amostra no gelo no escuro por duas horas. Assim que a amostra estiver corada, lave-a suavemente em PBS.

Em seguida, coloque três ou quatro pedaços de vidro de cobertura circular em uma lâmina e incorpore o adesivo pires em 200 microlitros de uma solução de glicerol a 30% em PBS. Na lâmina, use um microscópio a laser confocal DM IRE dois ou um microscópio de deconvolução de restauração de visão Delta para observar a amostra. Nesta imagem, a salmonela typhimurium marcada com GFP verde pode ser vista cercada por GP dois mostrada em vermelho na membrana plasmática apical.

Nesta imagem rotacionada, as bactérias são visíveis dentro das vesículas citoplasmáticas subapicais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar a transcitose bacteriana por células M usando o pigmento intestinal ligado pys.