Quantificação simultânea de celulares e extracelulares Componentes de biofilmes

O objetivo geral deste procedimento é quantificar e comparar distribuições tridimensionais simultâneas de três componentes de biofilme celular e extracelular após o tratamento com agentes antibacterianos. Isso é feito primeiro fabricando e depois polindo amostras compostas de resina. Na segunda etapa, os biofilmes de interesse são cultivados nos espécimes e depois tratados com agentes antibacterianos.

Em seguida, os biofilmes são corados com fluorocromos para substâncias poliméricas extracelulares, ácidos nucléicos e proteínas e, em seguida, fotografados por microscopia confocal de varredura a laser. Na etapa final, imagens tridimensionais dos fluorocromos sobrepostos são reconstruídas para facilitar a visualização simultânea dos componentes do biofilme e os parâmetros estruturais são calculados a partir das imagens do biofilme. Em última análise, a análise estatística dos parâmetros estruturais do biofilme, como biovolume e espessura média do biofilme, pode ser realizada para comparar as diferenças entre os grupos de tratamento e controle.

A principal vantagem deste procedimento sobre os métodos existentes é que ele usa técnicas distintas, mas interconectadas, para caracterizar a distribuição de múltiplos componentes dentro da estrutura de biofilmes cultivados sob condições específicas, demonstrando que o procedimento será o Dr. Fernando Flores, um pesquisador de pós-doutorado, e a Sra. Kristen Smart, uma assistente de pesquisa do meu laboratório Para criar os espécimes, comece colocando um incremento de 0,4 ou TPH três composto de resina dentária em personalizado moldes de aço inoxidável feitos. Em seguida, polimerize o primeiro incremento com uma unidade de fotopolimerização LED por 40 segundos. Depois de repetir o procedimento para o segundo incremento, use um polidor de moagem semiautomático para polir as amostras curadas até um acabamento superficial final aceitável.

Finalmente, esterilize as amostras para cultivar o biofilme. Primeiro, inocule uma única colônia de S mutans em quatro mililitros de meio de cultura durante a noite e, em seguida, incube a cultura a 37 graus Celsius por 16 a 18 horas para atingir uma densidade óptica de pelo menos 0,9. Em seguida, dilua a cultura na proporção de um para 100 em 10 mililitros de crescimento de biofilme.

Transfira assepticamente as amostras compostas de resina estéril para placas estéreis de 12 poços e, em seguida, adicione 2,5 mililitros da cultura diluída a cada um dos poços. Para tratamento de enxaguatório bucal e grupos de controle, adicione 2,5 mililitros de crescimento de biofilme estéril não inoculado, médio aos poços de controle de esterilidade e, em seguida, cultive os biofilmes a 37 graus Celsius sob condições micro parafílicas em um agitador a 100 RPM. Após 24 horas, aspirar assepticamente o meio de todos os poços e lavar cada poço duas vezes com 2,5 mililitros de PBS estéril aspirando a solução salina após cada lavagem, depois reabastecer cada poço com 2,5 mililitros de meio de crescimento de biofilme fresco e incubar a placa por mais 24 horas, conforme demonstrado para um crescimento total do biofilme Duração de 48 horas após a conclusão do crescimento do biofilme, aspire o meio de crescimento e, em seguida, distribua 2,5 mililitros de enxaguatório bucal em cada poço do grupo de tratamento e 2,5 mililitros de água ultrapura estéril no grupo de controle.

Agite bem as placas em um agitador orbital a 150 RPM e, após 60 segundos, aspire o enxaguatório bucal e a água ultrapura dos poços para manchar o componente exo polissacarídeo dos biofilmes. Incube cada biofilme com 50 microlitros de conjugado LOR por 30 minutos em temperatura ambiente protegido da luz. Em seguida, lave as amostras duas vezes com 2,5 mililitros de tampão TC aspirando após cada lavagem e core os ácidos nucléicos em cada biofilme com uma gota de 50 microlitros de cyto nine por 30 minutos em temperatura ambiente protegida da luz.

Após lavar os espécimes duas vezes, corar os componentes proteicos em cada biofilme com 50 microlitros de Cipro red por 30 minutos em temperatura ambiente, protegido da luz. Depois de lavar os espécimes três vezes, transfira-os para poços individuais de uma placa de seis poços contendo seis mililitros de água ultrapura estéril por poço para facilitar sua visualização por microscopia confocal para adquirir imagens de cada um dos corantes componentes dentro dos biofilmes dos grupos de tratamento e controle. Defina os lasers de um microscópio confocal de varredura a laser para as seguintes configurações para a detecção de exo polissacarídeos pela coloração conjugada Exor, use um laser de 633 nanômetros e uma banda de emissão de 659 a 749 nanômetros para a detecção de ácidos nucléicos por coloração de citocine.

Use um laser de 488 nanômetros e uma banda de emissão de 495 a 500 nanômetros e, para a detecção de proteínas pela coloração vermelha de Cipro, use um laser de 543 nanômetros e uma banda de emissão de 615 a 651 nanômetros. Em seguida, usando uma lente de mergulho de 63 x com uma abertura numérica de 0.9 e uma distância de trabalho de 2.2 milímetros. Colete imagens de microscopia confocal de varredura a laser a 400 hertz usando varredura sequencial no modo entre pilhas para otimizar a captura de imagens de várias manchas no mesmo biofilme.

Depois de analisar as imagens de microscopia de varredura a laser confocal, use a opção de menu do renderizador 3D no software de análise de imagem de velocidade para criar uma imagem 3D reconstruída das manchas de componentes sobrepostas dentro de cada biofilme. Em seguida, gire a imagem 3D para obter uma visão ideal do biofilme. Em seguida, capture um instantâneo da reconstrução do biofilme e exporte o instantâneo em um formato de arquivo de imagem adequado.

Finalmente, realize uma análise visual da distribuição simultânea do ácido nucleico exo polissacarídeo e componentes proteicos dentro dos biofilmes. Nas imagens reconstruídas, calcule os parâmetros estruturais do biofilme, como o volume do bio e a espessura média do biofilme, usando o software ISA 3D Nesta tabela, são exibidos os valores médios e desvios padrão dos parâmetros estruturais do biofilme calculados usando o software de análise estatística. Os valores de média e desvio padrão para os parâmetros estruturais dos biofilmes tratados com enxaguatório bucal que diferiram significativamente dos biofilmes do grupo controle são destacados nos modelos mistos vermelhos.

As análises estatísticas demonstraram que o enxaguatório bucal Biotene PBF produziu estruturas de biofilme que diferiram significativamente do grupo controle em ambos os compósitos de resina, enquanto o enxaguatório bucal Listerine total care não produziu diferenças significativas em nenhum dos compósitos de resina, indicando claramente diferenças nos componentes do biofilme celular e extracelular remanescentes após os dois tratamentos com enxaguatório bucal. A distribuição simultânea de exo polissacarídeos, ácidos nucléicos e proteínas dentro dos biofilmes pode ser visualizada por meio de reconstruções 3D geradas usando software de velocidade. Nesta figura, uma reconstrução representativa dos biofilmes do grupo controle cultivados em 0,4 é mostrada que a cor azul foi atribuída ao exopolissacarídeo.

Dentro dos biofilmes de S mutans, a cor verde foi atribuída aos ácidos nucléicos e a cor vermelha às proteínas. O espaço intermediário pode ser ocupado por água ou outros componentes de biofilme que não tenham sido marcados com fluorescência. Nesta figura, é mostrada uma reconstrução representativa dos biofilmes do grupo controle cultivados em três compósitos de resina TPH com as cores representando os mesmos componentes da figura anterior.

Este procedimento trouxe aplicação em uma variedade de disciplinas, como ciências médicas, odontológicas, geológicas e marinhas. Uma vez que muitos substratos e biofilmes podem ser substituídos pelos usados aqui.