Name: Quantificação simultânea de celulares e extracelulares Componentes de biofilmes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-10T20:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Aprenda a quantificar componentes celulares e extracelulares de biofilmes simultaneamente usando microscopia confocal e análise estatística. Este método permite avaliar os efeitos de agentes antibacterianos na estrutura tridimensional de biofilmes.

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O financiamento para este estudo foi fornecido pelo National Institutes of Health/NIDCR grant 1R15DE019566-01A1. Jim Henthorn (Laboratório de Citometria de Fluxo e Imagem OUHSC) é reconhecido por fornecer assistência técnica com microscopia confocal de varredura a laser. O Dr. Fernando Esteban Florez (Departamento de Materiais Odontológicos) é reconhecido por fornecer assistência técnica durante as filmagens deste vídeo.

1. Preparação de Meios e Reagentes
<ol>
	<li>Prepare 300 ml de meio de cultura noturno (THY; 3% de Caldo Todd Hewitt preparado conforme instruções do fabricante, suplementado com 0,3% de Extrato de Levedura em água ultrapura) e autoclave. Armazene à temperatura ambiente por até 2 meses.</li>
	<li>Prepare 1 L de ágar THY (3% de Caldo Todd Hewitt, 0,3% de Extrato de Levedura e 1,5% de ágar em água ultrapura), autoclave e deixe esfriar até 60 °C antes de verter em placas de Petri. Armazene a 4 °C por até 3 meses.</li>
	<li>Prepare 150 ml de meio de crescimento de biofilme (TY 0,5X suplementado com sacarose 10 mM; 1,5% de Triptona, 0,5% de Extrato de Levedura e sacarose 10 mM em água ultrapura) e esterilize por filtração. Armazene à temperatura ambiente por até 1 mês.</li>
	<li>Prepare 1 L de solução salina tamponada com fosfato (PBS; 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4 e 0,24 g de KH2PO4 em água ultrapura) e autoclave. Armazene à temperatura ambiente por vários meses.</li>
	<li>Prepare 600 ml de tampão Tris-HCl 10 mM suplementado com CaCl2 10 mM em água ultrapura (tampão TC; pH 7,2) e autoclave. Armazene à temperatura ambiente por vários meses.</li>
	<li>Autoclave 1 L de água ultrapura. Armazene à temperatura ambiente por vários meses.</li>
</ol>
2. Fabricação do Espécime
<ol>
	<li>Confeccione corpos de prova em formato de disco dos compósitos dentários Point 4 (PF) e TPH3 (TP) em um molde personalizado de aço inoxidável em dois incrementos. Cada incremento é fotopolimerizado por 40 s usando uma unidade de polimerização com luz LED. Os dois produtos possuem composições e níveis de carga ligeiramente diferentes, produzindo, assim, topografias superficiais distintas sobre as quais os biofilmes serão cultivados.
	<ol>
		<li>Corpos de prova dos substratos relevantes podem ser confeccionados utilizando protocolos estabelecidos de outras áreas no lugar da etapa 2.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Finalize e pola os corpos de prova até obter um acabamento superficial aceitável, por exemplo, utilizando uma politriz-retificadora semi-automática. Enxágue os corpos de prova polidos com água ultrapura e seque-os com ar comprimido.</li>
	<li>Sterilize os corpos de prova utilizando óxido de etileno em forma de gás ou um método alternativo de esterilização.</li>
</ol>
3. Crescimento do Biofilme
<ol>
	<li>Inocule uma única colônia de S. mutans em 4 ml de meio de cultura noturno (passo 1.1). Incube durante a noite a 37 °C por 16-18 horas. A densidade óptica (OD600) da cultura deve ser ≥0,9.
	<ol>
		<li>É preferível utilizar uma colônia de culturas em placa que tenham sido repicadas duas vezes a partir de uma estirpe original, pois isso resulta em crescimento de biofilme mais consistente.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Prepare uma diluição 1:100 utilizando a cultura noturna (passo 1.1) em 10 ml de meio de crescimento de biofilme (passo 1.3).</li>
	<li>Transfira espécimes estéreis de compósito resinoso (ex. PF, TP) para placas estéreis de 12 poços.</li>
	<li>Adicione 2,5 ml de meio de cultura diluído (passo 3.2) aos poços dos grupos tratamento (enxaguante bucal) e controle. Adicione 2,5 ml de meio de crescimento de biofilme estéril não inoculado aos poços de controle de esterilidade.</li>
	<li>Cultive os biofilmes em condições microaerofílicas. Coloque as placas em um agitador a 100 rpm dentro de uma incubadora a 37 °C por 24 horas.</li>
	<li>Após 24 horas, aspire assépticamente o meio de todos os poços e lave duas vezes com PBS estéril (passo 1.4; 2,5 ml/poço), aspirando o PBS após cada lavagem. Reponha 2,5 ml de meio fresco de crescimento de biofilme em cada poço e incube por mais 24 horas em condições idênticas às do passo anterior, totalizando um tempo de crescimento de biofilme de 48 horas.</li>
	<li>Em vez dos passos acima, biofilmes de outras espécies podem ser cultivados em substratos utilizando protocolos estabelecidos.</li>
</ol>
4. Tratamentos Antibacterianos/Enxaguantes Bucais
<ol>
	<li>Aspire o meio após a conclusão do crescimento do biofilme.</li>
	<li>Adicione 2,5 ml de enxaguante bucal Biotène PBF (BIO) ou Listerine Total Care (LTO), ou outra modalidade de tratamento, nos poços dos grupos tratados, e adicione 2,5 ml de água estéril ultrapura no poço do grupo controle. Mergulhe os espécimes por 60 segundos, conforme instruções do fabricante, agitando as placas em um agitador orbital a 150 rpm. Imediatamente aspire tanto o enxaguante bucal quanto a água ultrapura dos poços.</li>
	<li>Lave os espécimes 5 vezes, por 15 segundos a cada lavagem, com água estéril ultrapura no agitador orbital a 150 rpm, aspirando a água após cada etapa de lavagem.</li>
	<li>Em vez dos passos acima, outros agentes antibacterianos podem ser testados utilizando protocolos estabelecidos.</li>
</ol>
5. Coloração
<ol>
	<li>Prepare as diluições do corante para análise de biofilme.
	<ol>
		<li>Prepare uma solução estoque de 5 mg/ml de Concanavalina A, conjugado com Alexa Fluor 647 (AF), em tampão de bicarbonato de sódio 0,1 M, pH 8,3. Armazene a -20 °C em alíquotas para uso único por vários meses, pois congelamentos e descongelamentos repetidos são desaconselháveis. Usando essa solução estoque de AF, prepare uma diluição de 250 μg/ml em tampão TC.</li>
		<li>Prepare uma diluição de 10 μM usando a solução estoque de Syto 9 a 5 mM (SY), conforme fornecida pelo fabricante, em tampão TC. Armazene o restante da solução estoque de SY a -20 °C por vários meses.</li>
		<li>Prepare uma diluição 10x usando a solução estoque de Sypro Red a 5.000x (SR), conforme fornecida pelo fabricante, em água estéril ultrapura. Armazene o restante da solução estoque de SR a -20 °C por vários meses.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lave todos os biofilmes 2x com tampão TC (2,5 ml/poço), utilizando um movimento manual de rotação, deixando o segundo lavado permanecer na placa por 30 min à temperatura ambiente. Aspire.</li>
	<li>Coloque uma gota de 50 μl do corante AF sobre cada espécime de biofilme. Incube por 30 min à temperatura ambiente, protegido da luz. Lave 2x com tampão TC (2,5 ml/poço), aspirando após cada lavagem.</li>
	<li>Em seguida, adicione uma gota de 50 μl do corante SY sobre cada espécime de biofilme. Incube por 30 min à temperatura ambiente, protegido da luz. Lave 2x com água estéril ultrapura (2,5 ml/poço), aspirando após cada lavagem.</li>
	<li>Finalmente, coloque uma gota de 50 μl do corante SR sobre cada espécime de biofilme. Incube por 30 min à temperatura ambiente, protegido da luz. Lave 3x com água estéril ultrapura (2,5 ml/poço), aspirando após cada lavagem.</li>
	<li>Transfira os espécimes para uma placa de 6 poços, colocando um espécime por poço em 6 ml de água estéril ultrapura para facilitar a microscopia confocal.</li>
</ol>
6. Imagem utilizando microscopia confocal de varredura a laser
<ol>
	<li>Adquira imagens de cada componente (corante) dentro dos biofilmes dos grupos tratamento e controle utilizando as configurações do microscópio confocal a laser mostradas na Tabela 1. Neste estudo, foi utilizada uma lente de imersão de 63X com abertura numérica de 0,9 e distância de trabalho de 2,2 mm. 
	<img alt="Quadro de coloração de biofilmes; comprimentos de onda do laser (nm) e bandas de emissão (nm) para EPS, ácidos nucleicos e proteínas." fo:content-width="4.75in" src="/files/ftp_upload/50639/50639table1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Tabela 1"> 
	Tabela 1. Configurações do Microscópio Confocal a Laser.</li>
</ol>

<ol start="2">
	<li>Defina o tamanho de varredura como 250 μm x 250 μm e uma resolução mínima de pixel de 512 x 512 para adquirir imagens de microscopia confocal a laser (CLSM) com resolução adequada para análise quantitativa.</li>
	<li>Utilize a coloração SY para definir os pontos superior e inferior da pilha de imagens do biofilme, em seguida, ajuste o passo z para ser adequado à análise quantitativa (0,6 μm neste estudo). Antes de coletar uma varredura, otimize os parâmetros da imagem e da coloração (ou seja, tensão e deslocamento do PMT) utilizando a opção QLUT. Uma tabela de cores foi usada para atribuir cores falsas a cada coloração (verde para SY, vermelho para SR e azul para AF), a fim de tornar cada componente do biofilme mais distinguível na reconstrução tridimensional.</li>
	<li>Adquira imagens de CLSM a 400 Hz utilizando varredura sequencial no modo "entre pilhas" para otimizar a captura de imagens de múltiplas colorações dentro do mesmo biofilme.</li>
</ol>
7. Análise Estrutural de Biofilme
<ol>
	<li>Analise as imagens de microscopia confocal coletadas utilizando um software de análise de imagem para biofilmes. Os seguintes passos descrevem o uso do software ISA3D12 para calcular os parâmetros estruturais das imagens de biofilme coletadas.
	<ol>
		<li>Copie os arquivos de imagem de microscopia confocal para cada biofilme na pasta Imagens, conforme especificado no manual do software. Certifique-se de seguir a convenção de nomenclatura para arquivos de microscopia confocal exigida pelo software. O software permite a análise de arquivos em subpastas em modo de lote, facilitando assim a análise de biofilmes dos grupos tratamento e controle na mesma execução.</li>
		<li>Insira as dimensões dos eixos x, y e z das imagens de microscopia confocal nos campos dxy e dz da caixa de diálogo principal. Selecione as configurações de limiar e de mapeamento de distância, conforme descrito no manual do software (Otsu e Quase-Euclidiana foram usados neste estudo, respectivamente). Insira um nome adequado para o arquivo de resultados e execute o programa. Um arquivo de resultados será gerado na pasta ISA.</li>
		<li>Visualize o arquivo de resultados para obter os valores de vinte parâmetros estruturais tridimensionais12, como o biovolume e a espessura média do biofilme (medidos neste estudo), que quantificam a distribuição tridimensional de cada componente (corante) dentro do biofilme.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Visualização da Estrutura do Biofilme
<ol>
	<li>Crie uma reconstrução dos componentes sobrepostos (colorações) dentro de cada biofilme utilizando um software de análise de imagem. Os passos a seguir descrevem o uso do software Volocity para criar reconstruções 3D.
	<ol>
		<li>Crie uma biblioteca para cada biofilme copiando os arquivos de imagens do CLSM no software, conforme descrito no manual.</li>
		<li>Utilize a opção de menu Renderizador 3D para produzir uma imagem reconstruída em 3D a partir das imagens do CLSM de cada biofilme (o formato Opacidade HR foi utilizado neste estudo).</li>
		<li>Rotacione a imagem 3D para orientar todos os biofilmes de maneira semelhante em relação aos eixos coordenados x, y e z. Capture uma imagem do biofilme reconstruído corretamente orientado e, em seguida, exporte a imagem em formato TIFF, JPEG ou outro formato adequado.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Realize uma análise visual da distribuição simultânea dos componentes EPS, proteínas e ácidos nucleicos dentro dos biofilmes nas imagens reconstruídas.</li>
	<li>Utilize o coeficiente de correlação de Pearson e o coeficiente de sobreposição de Manders para realizar uma análise de colocalização de múltiplos componentes do biofilme (a colocalização não foi medida neste estudo).</li>
</ol>
9. Análise Estatística
<ol>
	<li>Utilize análises estatísticas separadas de modelos mistos para comparar os valores médios dos parâmetros estruturais entre os grupos com enxaguante bucal e controle (α=0.05). Para este estudo, o software SAS foi utilizado para realizar a análise estatística.</li>
</ol>

<ol><li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+a+common+cause+of+persistent+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+from+the+natural+environment+to+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases.</a> Nat. Rev. Microbiol. 2, 95-108 (2004).</li>
<li>Yang, Y., Sreenivasan, P. K., Subramanyam, R., Cummins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+assessments+to+determine+the+effects+of+sugars+and+antimicrobials+on+a+polymicrobial+oral+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiparameter assessments to determine the effects of sugars and antimicrobials on a polymicrobial oral biofilm.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 6734-6742 (2006).</li>
<li>Klein, M. I., Xiao, J., Heydorn, A., Koo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analytical+tool-box+for+comprehensive+biochemical%2C+structural+and+transcriptome+evaluation+of+oral+biofilms+mediated+by+mutans+streptococci%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An analytical tool-box for comprehensive biochemical, structural and transcriptome evaluation of oral biofilms mediated by mutans streptococci.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Conchello, J. A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning microscopy.</a> Nat. Methods. 2, 920-931 (2005).</li>
<li>Robinson, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Principles of confocal microscopy.</a> Methods Cell Biol. 63, 89-106 (2001).</li>
<li>Neu, T. R., Kuhlicke, U., Lawrence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+fluorochromes+for+two-photon+laser+scanning+microscopy+of+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of fluorochromes for two-photon laser scanning microscopy of biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 901-909 (2002).</li>
<li>Wood, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+intact+natural+human+plaque+biofilms+studied+by+confocal+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dental+Res%22%5BJournal%5D)">Architecture of intact natural human plaque biofilms studied by confocal laser scanning microscopy.</a> J. Dental Res. 79, 21-27 (2000).</li>
<li>Chen, M. Y., Lee, D. J., Tay, J. H., Show, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+of+extracellular+polymeric+substances+and+cells+in+bioaggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Staining of extracellular polymeric substances and cells in bioaggregates.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 75, 467-474 (2007).</li>
<li>Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+colocalization+analysis+of+multicolor+confocal+immunofluorescence+microscopy+images%3A+pushing+pixels+to+explore+biological+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena.</a> Acta Histochem. Cytochem. 40, 101-111 (2007).</li>
<li>Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+evaluating+colocalization+in+biological+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, C723-C742 (2011).</li>
<li>Beyenal, H., Donovan, C., Lewandowski, Z., Harkin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+biofilm+structure+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional biofilm structure quantification.</a> J. Microbiol. Methods. 59, 395-413 (2004).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes. A produção e o acesso gratuito a este artigo são patrocinados pela Leica Microsystems.

A aquisição de imagens CLSM deve ser realizada da maneira e formato necessários para a quantificação de biofilmes e para análise de colocalização, de modo que a distribuição da intensidade do sinal em cada imagem seja uma representação confiável da distribuição de cada fluorocromo na pilha de biofilme. A intensidade do sinal deve ser distinguível do ruído e do fundo10,11, não afetada pela autofluorescência do substrato e com sangramento mínimo devido à interferência espectral entre os fluorocromos usados11. O ruído é uma limitação inevitável da microscopia de fluorescência11, e a qualidade da imagem às vezes pode ser limitada por razões técnicas ou logísticas. A identificação de fluorocromos com sobreposição espectral mínima é fundamental para o sucesso desse método, mas pode ser complicada. Além disso, a quantificação de múltiplos fluorocromos representa um problema multifatorial. Portanto, não é surpreendente que muito poucas investigações tenham quantificado com sucesso a distribuição simultânea de mais de dois componentes dentro das estruturas dos biofilmes.
O objetivo deste estudo foi relatar uma metodologia que consiste em etapas distintas, mas interconectadas, para a quantificação e comparação das distribuições tridimensionais simultâneas de três componentes celulares e extracelulares dentro de biofilmes. O ensaio de crescimento de biofilme descrito permite o crescimento de biofilme em substratos relevantes e produz estruturas de biofilme que são reprodutíveis, conforme demonstrado pelos resultados relatados na Tabela 1. A combinação de novas colorações simultâneas de componentes de EPS, proteínas e ácidos nucléicos com a medição de parâmetros estruturais de biofilme 3D resulta em distribuições quantificáveis de componentes dentro de biofilmes. A análise visual qualitativa da distribuição simultânea de EPS, proteínas e ácidos nucléicos nos biofilmes é possível por meio da reconstrução de manchas sobrepostas em cada biofilme. O software ISA3D12 contém vários parâmetros estruturais exclusivos, como dimensão fractal, homogeneidade e coeficiente de rugosidade do biofilme, além de parâmetros tradicionalmente medidos, como porosidade e espessura do biofilme, para melhorar a quantificação das estruturas 3D dos biofilmes. A análise estatística dos parâmetros estruturais do biofilme facilita comparações relevantes de biofilmes sob condições experimentais específicas, como eficácia antibacteriana/anti-incrustante (por exemplo, após tratamento com enxaguatórios bucais) ou ao longo do tempo (efeitos temporais).
Esta metodologia quantificou e comparou de forma eficiente e bem-sucedida as distribuições 3D simultâneas de três componentes principais dentro de biofilmes de S. mutans que foram cultivados em substratos relevantes, superando assim dois desafios para a avaliação simultânea dos componentes do biofilme. Este método também pode ser usado para determinar a eficácia de tratamentos antibacterianos ou medidas anti-incrustantes contra vários componentes do biofilme, conforme mostrado usando enxaguatórios bucais neste estudo. Além disso, a maioria dos protocolos descritos acima pode ser substituída por protocolos para a fabricação de substratos relevantes e ensaios de crescimento de biofilme de microrganismos relevantes. Portanto, este método tem ampla aplicação porque facilita a comparação de estruturas/arquitetura 3D de biofilmes in vitro e in vivo em uma variedade de disciplinas, incluindo ciências médicas, odontológicas, geológicas e marinhas.

Os biofilmes são comunidades microbianas estruturadas que são encapsuladas em uma matriz extracelular autoproduzida e estão ligadas a superfícies biológicas ou inertes1. Os biofilmes representam um estilo de vida comum para muitas bactérias e se formam pela transição em estágios de células flutuantes (planctônicas) para comunidades multiespécies complexas. A resistência inerente dos biofilmes aos agentes antimicrobianos está na raiz de muitas infecções bacterianas persistentes e crônicas1,2, como demonstrado pelos biofilmes orais (placa dentária). Microrganismos cariogênicos, como estreptococos mutans, processam sacarose e outros carboidratos para produzir uma matriz extracelular e gerar ácidos que podem desmineralizar a estrutura dentária e causar cárie dentária. A maioria das matrizes de biofilme são biopolímeros constituídos por componentes celulares e extracelulares, como exopolissacarídeos (EPS), proteínas e ácidos nucléicos3,4.
A microscopia confocal de varredura a laser (CLSM), a técnica mais amplamente utilizada para imagens de fluorescência, transformou radicalmente a imagem óptica na biologia porque tem a capacidade de coletar imagens 3D de estruturas biológicas hidratadas sem fixação5,6,7. Essa técnica não destrutiva envolve a coleta de imagens de seções finas dentro de uma região de interesse no espécime de tal maneira que a contribuição da luz fora de foco seja removida. A qualidade e a resolução das imagens capturadas pelo CLSM estão além do que é possível usar a microscopia de fluorescência de campo amplo. Uma grande desvantagem do CLSM é que a varredura de imagens ocorre em uma taxa mais lenta do que com técnicas de microscopia de campo amplo, nas quais imagens inteiras são coletadas simultaneamente5. No entanto, com uma seleção cada vez maior de fluorocromos, lasers e filtros, o CLSM tornou-se uma das técnicas predominantes para imagens multiespectrais5,7.
Estudos anteriores mostraram que o CLSM é uma ferramenta útil para examinar a estrutura ou arquitetura de biofilmes usando uma ou duas marcas ou corantes fluorescentes para fornecer uma melhor compreensão da distribuição de EPS e células dentro dos biofilmes e, especialmente, dentro da matriz extracelular7,8. Em teoria, a coloração/marcação fluorescente de vários componentes é desejável para explorar a estrutura detalhada e a colocalização de componentes celulares e extracelulares dentro de biofilmes. No entanto, a análise simultânea de vários componentes dentro dos biofilmes pode ser desafiadora porque: 1) a seleção de corantes fluorescentes com sobreposição espectral mínima é complicada e 2) a quantificação de múltiplos fluorocromos representa um problema multifatorial. A colocalização usando múltiplos fluorocromos requer o uso de colorações altamente específicas com interferência espectral mínima para evitar quaisquer efeitos de sangramento, que ocorrem quando dois fluorocromos têm sobreposição significativa em seu pico espectral, fazendo com que um seja mais fortemente excitado do que o outro9. Idealmente, fluorocromos com espectros de excitação que não se sobrepõem forneceriam os melhores resultados, no entanto, é muito difícil encontrar manchas que atendam a esse critério. Em vez disso, a seleção de manchas é otimizada pela escolha de fluorocromos cujos espectros de emissão têm sobreposição mínima, permitindo que as manchas sejam visualizadas uma a uma dentro de uma banda de comprimento de onda de observação limitada9.
A sobreposição de imagens de fluorescência é provavelmente o método mais amplamente utilizado para avaliar a distribuição simultânea de fluorocromos. A colocalização dos vários componentes aparece como uma sobreposição de cores diferentes por meio de múltiplos canais criados pelos fluorocromos que estão sendo examinados10. As ferramentas para exibir imagens de fluorescência de múltiplos canais como imagens coloridas mescladas estão disponíveis na maioria dos softwares CLSM e softwares de análise de imagens biológicas. Embora a sobreposição de imagens seja útil para a avaliação espacial da colocalização, as imagens só podem ser examinadas qualitativamente por análise visual. Isso fornece uma quantidade limitada de informações, pois essas representações geralmente não são úteis para quantificar a colocalização sob diferentes condições experimentais nem determinam se a colocalização excede a coincidência aleatória11. Muito poucas investigações até agora usaram métodos quantitativos para analisar a estrutura tridimensional de biofilmes e componentes de biofilme, e menos ainda quantificaram o efeito de tratamentos antibacterianos ou medidas anti-incrustantes nos componentes do biofilme.
O objetivo deste estudo foi relatar uma metodologia para quantificação e comparação das distribuições tridimensionais concorrentes de três componentes celulares e extracelulares de biofilmes. O método consiste em etapas distintas, mas interconectadas, envolvendo crescimento de biofilme, coloração, imagem CLSM de biofilmes, análise e visualização estrutural de biofilme e análise estatística de parâmetros estruturais. O ensaio de crescimento de biofilme permite o crescimento de biofilme em substratos relevantes e produz estruturas de biofilme que são reprodutíveis. A combinação de novas colorações simultâneas de componentes de EPS, proteínas e ácidos nucléicos com a medição de parâmetros estruturais de biofilme 3D resulta em distribuições quantificáveis de componentes dentro de biofilmes. A análise estatística dos parâmetros estruturais do biofilme facilita a avaliação dos biofilmes em condições experimentais específicas (por exemplo, após tratamento com enxaguatórios bucais), conforme descrito na próxima seção.

<table><tbody><tr><td>Bacto Agar</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Caldo Bacto Todd Hewitt</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>249240</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de Levedura, EMD Granulado</td><td>Millipore</td><td>1.03753.0500</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Triptona</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>OmniPur Sacarose</td><td>EMD Millipore</td><td>8510</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Potássio, reagente ACS, 99.0-100.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Potássio, monobásico, &ge; 99,0%, reagente ACS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Sódio, Monobásico, Monohidratado</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0710-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris (hidroximetil) aminometano, 99,8 +%, reagente ACS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859-500G</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalina A, Alexa Fluor 647 Conjugado</td><td>Invitrogen</td><td>C21421</td><td></td></tr><tr><td>Syto 9</td><td>Invitrogen</td><td>S34854</td><td></td></tr><tr><td>Sypro Red</td><td>Invitrogen</td><td>S12012 ou S6653</td><td></td></tr><tr><td>Biot&egrave; ne PBF Enxaguante Oral</td><td>GlaxoSmithKline</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Listerine Total Care</td><td>McNeil-PPC, Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificação simultânea de celulares e extracelulares componentes de biofilmes

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

A microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) é uma ferramenta poderosa para investigação de biofilmes. Muito poucas investigações quantificaram com sucesso a distribuição simultânea de mais de dois componentes dentro dos biofilmes porque: 1) a seleção de corantes fluorescentes com sobreposição espectral mínima é complicada e 2) a quantificação de múltiplos fluorocromos representa um problema multifatorial. Objectivos: Relate uma metodologia para quantificar e comparar distribuições tridimensionais simultâneas de três componentes celulares / extracelulares de biofilmes cultivados em substratos relevantes. Métodos: O método consiste em etapas distintas e interconectadas envolvendo crescimento de biofilme, coloração, imagem CLSM, análise e visualização estrutural de biofilme e análise estatística de parâmetros estruturais. Biofilmes de Streptococcus mutans (cepa UA159) foram cultivados por 48 horas em amostras estéreis de compósitos de resina Point 4 e TPH3. As amostras foram posteriormente imersas por 60 segundos em enxaguatórios bucais Biotène PBF (BIO) ou Listerine Total Care (LTO) ou água (grupo controle; n = 5 / grupo). Os biofilmes foram corados com fluorocromos para substâncias poliméricas extracelulares, proteínas e ácidos nucléicos antes da imagem com CLSM. Os parâmetros estruturais do biofilme calculados usando o software de análise de imagens ISA3D foram o biovolume e a espessura média do biofilme. As análises estatísticas de modelos mistos compararam os parâmetros estruturais entre os grupos enxaguatório bucal e controle (software SAS; α=0,05). O software Volocity permitiu a visualização de distribuições 3D de componentes de biofilme sobrepostos (fluorocromos). Resultados: O BIO do enxaguatório bucal produziu estruturas de biofilme que diferiram significativamente do controle (p<0,05) em ambos os compósitos de resina, enquanto o LTO não produziu diferenças (p>0,05) em nenhum dos produtos. Conclusões: Esta metodologia quantificou e comparou de forma eficiente e bem-sucedida distribuições 3D simultâneas de três componentes principais dentro de biofilmes de S. mutans em substratos relevantes, superando assim dois desafios para a avaliação simultânea dos componentes do biofilme. Este método também pode ser usado para determinar a eficácia de agentes antibacterianos/anti-incrustantes contra vários componentes do biofilme, conforme mostrado usando enxaguatórios bucais. Além disso, este método tem ampla aplicação porque facilita a comparação de estruturas 3D / arquitetura de biofilmes em uma variedade de disciplinas.

Os resultados representativos dos tratamentos (enxaguantes bucais) e do grupo controle sem tratamento são apresentados na Tabela 2 e nas Figuras 1 e 2. A Tabela 2 exibe os valores médios e desvios padrão dos parâmetros estruturais do biofilme: biovolume (μm3) e espessura média do biofilme (μm), calculados utilizando o software ISA3D. Os parâmetros estruturais dos biofilmes tratados com enxaguante bucal que diferiram significativamente dos biofilmes do grupo controle (p&lt;0,05) têm os valores médios e desvios padrão destacados em vermelho. Os resultados das análises estatísticas por modelos mistos demonstraram que o enxaguante bucal BIO produziu estruturas de biofilme que diferiram significativamente do controle (p&lt;0,05) em ambos os compósitos resinosos, enquanto o enxaguante bucal LTO não produziu diferenças significativas (p&gt;0,05) em nenhum dos compósitos resinosos. Os resultados mostram claramente que os componentes celulares e extracelulares do biofilme remanescentes após os dois tratamentos com enxaguante bucal diferiram. Deve-se observar também que os biofilmes de S. mutans cultivados nos dois substratos (PF e TP) diferiram na estrutura tridimensional, mesmo tendo sido cultivados em condições semelhantes e ambos os substratos tendo sido polidos com abrasivos semelhantes.
A distribuição simultânea de EPS, proteínas e ácidos nucleicos dentro de biofilmes pode ser visualizada por meio das reconstruções 3D geradas usando o software Volocity. Figuras 1 e 2 demonstram reconstruções representativas de biofilmes do grupo controle cultivados em compósitos de resina PF e TP, respectivamente. A coloração azul representa EPS em biofilmes de S. mutans, a coloração verde demonstra ácidos nucleicos e a coloração vermelha mostra proteínas. O espaço intermediário pode ser ocupado por água ou outros componentes do biofilme não marcados com fluorescência.
<img alt="Gráfico de dispersão 3D, visualização dinâmica de dados, gráfico, ferramenta interativa de pesquisa, exibição analítica." fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50639/50639fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50639/50639fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1. Uma reconstrução tridimensional representativa do biofilme de S. mutans cultivado em compósito resinoso de PF no grupo controle (não tratado com enxaguante bucal). A sobreposição simultânea das três colorações em um único biofilme permite a visualização conjunta dos componentes de EPS (coloração azul), ácidos nucleicos (coloração verde) e proteínas (coloração vermelha) nos biofilmes de S. mutans. (1 Unidade = 24 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50639/50639fig1large.jpg" target="_blank"> Clique aqui para visualizar a figura em tamanho maior</a>.
<img alt="Visualização da estrutura celular tridimensional, microscopia de fluorescência, análise de dados espaciais, gráfico científico." fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50639/50639fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50639/50639fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figura 2"> 
Figura 2. Uma reconstrução tridimensional representativa do biofilme de S. mutans cultivado em compósito resinoso TP no grupo controle (não tratado com enxaguante bucal). A sobreposição simultânea das três colorações em um único biofilme permite a visualização simultânea dos componentes EPS (coloração azul), ácidos nucleicos (coloração verde) e proteínas (coloração vermelha) nos biofilmes de S. mutans. (1 Unidade = 24 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50639/50639fig2large.jpg" target="_blank"> Clique aqui para visualizar a figura em tamanho maior</a>.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Compósito resinoso</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Point 4</td>
			<td colspan="2">TPH3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enxaguante bucal</td>
			<td>Componente</td>
			<td>BV (μm3)</td>
			<td>MT (μm)</td>
			<td>BV (μm3)</td>
			<td>MT (μm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotène PBF</td>
			<td>Ácidos nucleicos</td>
			<td>279,517±53,291</td>
			<td>9,32±2,80</td>
			<td>195,033±42,014</td>
			<td>7,45±3,70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EPS</td>
			<td>344,902±56,386</td>
			<td>35,22±17,19</td>
			<td>197,840±62,351</td>
			<td>9,83±7,26</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Proteínas</td>
			<td>298,796±62,868</td>
			<td>54,21±21,65</td>
			<td>216,033±66,654</td>
			<td>24,33±39,64</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Listerine Total Care</td>
			<td>Ácidos nucleicos</td>
			<td>355,707±110,444</td>
			<td>26,45±14,21</td>
			<td>273,296±47,323</td>
			<td>13,43±2,89</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EPS</td>
			<td>494,099±180,592</td>
			<td>64,90±26,68</td>
			<td>329,150±47,145</td>
			<td>34,35±30,32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Proteínas</td>
			<td>348,416±161,316</td>
			<td>58,68±47,28</td>
			<td>303,150±54,705</td>
			<td>34,18±41,46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controle (sem tratamento)</td>
			<td>Ácidos nucleicos</td>
			<td>388,375±42,152</td>
			<td>51,15±40,66</td>
			<td>327,809±39,400</td>
			<td>17,08±1,65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EPS</td>
			<td>660,448±173,197</td>
			<td>91,37±74,84</td>
			<td>363,850±67,612</td>
			<td>28,33±15,07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Proteínas</td>
			<td>517,274±119,475</td>
			<td>127,96±73,84</td>
			<td>353,161±56,518</td>
			<td>21,17±4,41</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Valores médios e desvios padrão de Biovolume (BV) e Espessura média do biofilme (MT) de biofilmes tratados com BIO ou LTO, ou deixados sem tratamento (grupo controle). Parâmetros estruturais de biofilmes tratados com enxaguantes bucais que diferiram significativamente daqueles dos biofilmes no grupo controle (p&lt;0,05) têm valores médios e desvios padrão destacados em vermelho.

Um protocolo para a quantificação e comparação simultânea de três componentes celulares e extracelulares dentro de biofilmes é apresentado. A metodologia envolve o uso de microscopia confocal de varredura a laser, software de análise e visualização estrutural de biofilme e software de análise estatística.

Quantificação simultânea de celulares e extracelulares Componentes de biofilmes

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

O objetivo geral deste procedimento é quantificar e comparar distribuições tridimensionais simultâneas de três componentes de biofilme celular e extracelular após o tratamento com agentes antibacterianos. Isso é feito primeiro fabricando e depois polindo amostras compostas de resina. Na segunda etapa, os biofilmes de interesse são cultivados nos espécimes e depois tratados com agentes antibacterianos.Em seguida, os biofilmes são corados com fluorocromos para substâncias poliméricas extracelulares, ácidos nucléicos e proteínas e, em seguida, fotografados por microscopia confocal de varredura a laser. Na etapa final, imagens tridimensionais dos fluorocromos sobrepostos são reconstruídas para facilitar a visualização simultânea dos componentes do biofilme e os parâmetros estruturais são calculados a partir das imagens do biofilme. Em última análise, a análise estatística dos parâmetros estruturais do biofilme, como biovolume e espessura média do biofilme, pode ser realizada para comparar as diferenças entre os grupos de tratamento e controle.A principal vantagem deste procedimento sobre os métodos existentes é que ele usa técnicas distintas, mas interconectadas, para caracterizar a distribuição de múltiplos componentes dentro da estrutura de biofilmes cultivados sob condições específicas, demonstrando que o procedimento será o Dr. Fernando Flores, um pesquisador de pós-doutorado, e a Sra. Kristen Smart, uma assistente de pesquisa do meu laboratório Para criar os espécimes, comece colocando um incremento de 0,4 ou TPH três composto de resina dentária em personalizado moldes de aço inoxidável feitos. Em seguida, polimerize o primeiro incremento com uma unidade de fotopolimerização LED por 40 segundos. Depois de repetir o procedimento para o segundo incremento, use um polidor de moagem semiautomático para polir as amostras curadas até um acabamento superficial final aceitável.Finalmente, esterilize as amostras para cultivar o biofilme. Primeiro, inocule uma única colônia de S mutans em quatro mililitros de meio de cultura durante a noite e, em seguida, incube a cultura a 37 graus Celsius por 16 a 18 horas para atingir uma densidade óptica de pelo menos 0,9. Em seguida, dilua a cultura na proporção de um para 100 em 10 mililitros de crescimento de biofilme.Transfira assepticamente as amostras compostas de resina estéril para placas estéreis de 12 poços e, em seguida, adicione 2,5 mililitros da cultura diluída a cada um dos poços. Para tratamento de enxaguatório bucal e grupos de controle, adicione 2,5 mililitros de crescimento de biofilme estéril não inoculado, médio aos poços de controle de esterilidade e, em seguida, cultive os biofilmes a 37 graus Celsius sob condições micro parafílicas em um agitador a 100 RPM. Após 24 horas, aspirar assepticamente o meio de todos os poços e lavar cada poço duas vezes com 2,5 mililitros de PBS estéril aspirando a solução salina após cada lavagem, depois reabastecer cada poço com 2,5 mililitros de meio de crescimento de biofilme fresco e incubar a placa por mais 24 horas, conforme demonstrado para um crescimento total do biofilme Duração de 48 horas após a conclusão do crescimento do biofilme, aspire o meio de crescimento e, em seguida, distribua 2,5 mililitros de enxaguatório bucal em cada poço do grupo de tratamento e 2,5 mililitros de água ultrapura estéril no grupo de controle.Agite bem as placas em um agitador orbital a 150 RPM e, após 60 segundos, aspire o enxaguatório bucal e a água ultrapura dos poços para manchar o componente exo polissacarídeo dos biofilmes. Incube cada biofilme com 50 microlitros de conjugado LOR por 30 minutos em temperatura ambiente protegido da luz. Em seguida, lave as amostras duas vezes com 2,5 mililitros de tampão TC aspirando após cada lavagem e core os ácidos nucléicos em cada biofilme com uma gota de 50 microlitros de cyto nine por 30 minutos em temperatura ambiente protegida da luz.Após lavar os espécimes duas vezes, corar os componentes proteicos em cada biofilme com 50 microlitros de Cipro red por 30 minutos em temperatura ambiente, protegido da luz. Depois de lavar os espécimes três vezes, transfira-os para poços individuais de uma placa de seis poços contendo seis mililitros de água ultrapura estéril por poço para facilitar sua visualização por microscopia confocal para adquirir imagens de cada um dos corantes componentes dentro dos biofilmes dos grupos de tratamento e controle. Defina os lasers de um microscópio confocal de varredura a laser para as seguintes configurações para a detecção de exo polissacarídeos pela coloração conjugada Exor, use um laser de 633 nanômetros e uma banda de emissão de 659 a 749 nanômetros para a detecção de ácidos nucléicos por coloração de citocine.Use um laser de 488 nanômetros e uma banda de emissão de 495 a 500 nanômetros e, para a detecção de proteínas pela coloração vermelha de Cipro, use um laser de 543 nanômetros e uma banda de emissão de 615 a 651 nanômetros. Em seguida, usando uma lente de mergulho de 63 x com uma abertura numérica de 0.9 e uma distância de trabalho de 2.2 milímetros. Colete imagens de microscopia confocal de varredura a laser a 400 hertz usando varredura sequencial no modo entre pilhas para otimizar a captura de imagens de várias manchas no mesmo biofilme.Depois de analisar as imagens de microscopia de varredura a laser confocal, use a opção de menu do renderizador 3D no software de análise de imagem de velocidade para criar uma imagem 3D reconstruída das manchas de componentes sobrepostas dentro de cada biofilme. Em seguida, gire a imagem 3D para obter uma visão ideal do biofilme. Em seguida, capture um instantâneo da reconstrução do biofilme e exporte o instantâneo em um formato de arquivo de imagem adequado.Finalmente, realize uma análise visual da distribuição simultânea do ácido nucleico exo polissacarídeo e componentes proteicos dentro dos biofilmes. Nas imagens reconstruídas, calcule os parâmetros estruturais do biofilme, como o volume do bio e a espessura média do biofilme, usando o software ISA 3D Nesta tabela, são exibidos os valores médios e desvios padrão dos parâmetros estruturais do biofilme calculados usando o software de análise estatística. Os valores de média e desvio padrão para os parâmetros estruturais dos biofilmes tratados com enxaguatório bucal que diferiram significativamente dos biofilmes do grupo controle são destacados nos modelos mistos vermelhos.As análises estatísticas demonstraram que o enxaguatório bucal Biotene PBF produziu estruturas de biofilme que diferiram significativamente do grupo controle em ambos os compósitos de resina, enquanto o enxaguatório bucal Listerine total care não produziu diferenças significativas em nenhum dos compósitos de resina, indicando claramente diferenças nos componentes do biofilme celular e extracelular remanescentes após os dois tratamentos com enxaguatório bucal. A distribuição simultânea de exo polissacarídeos, ácidos nucléicos e proteínas dentro dos biofilmes pode ser visualizada por meio de reconstruções 3D geradas usando software de velocidade. Nesta figura, uma reconstrução representativa dos biofilmes do grupo controle cultivados em 0,4 é mostrada que a cor azul foi atribuída ao exopolissacarídeo.Dentro dos biofilmes de S mutans, a cor verde foi atribuída aos ácidos nucléicos e a cor vermelha às proteínas. O espaço intermediário pode ser ocupado por água ou outros componentes de biofilme que não tenham sido marcados com fluorescência. Nesta figura, é mostrada uma reconstrução representativa dos biofilmes do grupo controle cultivados em três compósitos de resina TPH com as cores representando os mesmos componentes da figura anterior.Este procedimento trouxe aplicação em uma variedade de disciplinas, como ciências médicas, odontológicas, geológicas e marinhas. Uma vez que muitos substratos e biofilmes podem ser substituídos pelos usados aqui.

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