Métodos de caracterização da Co-desenvolvimento de biofilme e Habitat Heterogeneidade

Os biofilmes têm interações complexas com o ambiente circundante. Para investigar de forma abrangente as interações biofilme-ambiente, apresentamos aqui uma série de métodos para criar um ambiente químico heterogêneo para o desenvolvimento do biofilme, quantificar a velocidade do fluxo local e analisar o transporte de massa dentro e ao redor das colônias de biofilme.

O objetivo geral deste procedimento é caracterizar as interações do biofilme com o ambiente circundante usando métodos integrados para fazer isso. Um sistema de célula de fluxo microfluídico de entrada dupla é construído no qual meios contendo glicose e livres de glicose são bombeados através de uma célula de fluxo gerando um gradiente de glicose. Bactérias são adicionadas ao sistema e os biofilmes podem se desenvolver ao longo de vários dias.

Os biofilmes são então fotografados por microscopia confocal 3D para caracterizar o transporte de solu. Dentro dos biofilmes, traçadores fluorescentes são injetados no sistema de fluxo e imagens de lapso de tempo são realizadas para caracterizar o campo de fluxo ao redor das colônias de biofilme, microesferas fluorescentes são injetadas e imagens de lapso de tempo são realizadas. A análise de transporte de soluto e rastreamento de partículas dos dados resultantes demonstra a utilidade desse método na avaliação de processos de biofilme em vários ambientes químicos em um único dispositivo e em um conjunto de experimentos.

A principal vantagem desses métodos é que eles permitem a avaliação simultânea de múltiplos aspectos das interações do ambiente de biofilme. Os métodos relatados aqui podem ajudar a responder a perguntas-chave sobre a formação de biofilme em ambientes naturais ou em infecções relacionadas ao biofilme. Trabalhando em uma capela de fluxo laminar, transfira uma colônia de posa PAO one GFP end uma colônia de e coli DH cinco alfa de uma placa LB para separar tubos contendo três mililitros de caldo lb.

Incube as culturas durante a noite a 37 graus Celsius enquanto agita a 225 RPM. Este sistema de fluxo é baseado em uma célula microfluídica de entrada dupla que facilita a observação do crescimento do biofilme sob um gradiente químico bem definido formado pela mistura de duas soluções dentro da câmara de fluxo. Durante o fluxo, um gradiente de concentração suave é formado na direção transversal.

Como resultado da difusão, o perfil de concentração é íngreme perto da entrada e mais relaxado a jusante. No dia do experimento, monte cuidadosamente o sistema de fluxo. Primeiro, prenda a tubulação na bomba peristáltica e, em seguida, conecte uma extremidade da tubulação a uma garrafa média contendo 900 mililitros de meio FAB com glicose e a outra extremidade a uma armadilha de bolhas.

Repita esse processo para conectar uma segunda garrafa média contendo 900 mililitros de fab sem glicose a uma segunda armadilha de bolhas. Em seguida, insira válvulas de três vias logo antes das entradas da célula de fluxo e conecte cada um dos coletores de bolhas à célula de fluxo. Por fim, conecte a saída da célula de fluxo a um frasco de resíduos.

Certifique-se de que a célula de fluxo seja colocada com a lamínula voltada para baixo para permitir que as células suspensas se acomodem na lamínula. Após a montagem do sistema de fluxo, ligue a bomba peristáltica a uma vazão de 10 mililitros por hora para cada entrada para encher o sistema Com o meio fab medium é introduzido nas duas entradas com uma glicose fornecida apenas em uma entrada. Em seguida, trabalhando no exaustor, dilua as duas culturas bacterianas na proporção de um para um em um mililitro de água estéril com um OD 600 equivalente de 0,01 para cada bactéria para inocular a célula de fluxo, use uma seringa de plástico estéril para injetar 500 microlitros do inóculo em cada uma das entradas da célula de fluxo através da válvula de três vias.

Após a injeção, pare a bomba e deixe as células bacterianas se fixarem à lamínula por uma hora após a fixação das células, ajuste a bomba para 0,03 mililitros por minuto para cada entrada e deixe o sistema fluir por três dias à temperatura ambiente, durante os quais um biofilme se desenvolve sob um gradiente de exposição à glicose. Depois de três dias. Use um marcador e uma régua para desenhar uma grade no lado da lamínula da célula de fluxo em preparação para a imagem.

Isso ajudará a localizar as regiões de imagem para combater a coloração para visualização de E. coli. Primeiro, apague as luzes para escurecer a área de trabalho, pois a contra-mancha é sensível à luz. Use uma seringa para injetar lentamente um mililitro de coloração de ácido nucleico fluorescente vermelho permean de célula diluída na válvula de três vias a montante da câmara de fluxo.

Pare o fluxo. Mantenha a célula de fluxo estagnada no escuro por 30 minutos. Após 30 minutos.

Retome o fluxo a 0,03 mililitros por minuto e lave a mancha não ligada por 15 minutos. Em seguida, pare o fluxo e observe os biofilmes usando microscopia confocal com uma objetiva de 63 x. Encontre um campo de visão contendo uma boa quantidade de biomassa com colônias de biofilme bem separadas, conforme mostrado aqui.

Em seguida, capture pilhas de imagens 3D nos canais apropriados para mapear os padrões espaciais de desenvolvimento de biofilme dentro da imagem da célula de fluxo, os biofilmes em três ou mais distâncias longitudinais ou X ao longo da entrada da célula de fluxo e em três posições transversais ou Y em relação ao gradiente nutricional imposto. Para caracterizar os padrões de transporte de solu dentro do biofilme, comece com a célula de fluxo. Após três dias de desenvolvimento de biofilme, novamente, trabalhando no escuro.

Pare a bomba para pausar o fluxo, abra os coletores de bolhas para liberar a pressão de injeção. Em seguida, use uma seringa para injetar um mililitro de solução traçadora de ficção científica diluída em qualquer uma das válvulas de três vias a montante da célula de fluxo. Depois de injetar a solução de ficção científica, feche as armadilhas de bolhas.

Ajuste a válvula de três vias e reinicie a bomba a 0,03 mililitros por minuto para fornecer a solução de ficção científica na célula de fluxo. Em seguida, alterne o modo de imagem confocal para XYT com uma taxa de quadros de 0,15 hertz. Uma alta resolução temporal é preferida para verbalizar a penetração do corante, no entanto, a varredura rápida diminui a qualidade da imagem.

Portanto, defina a velocidade de varredura e a média da linha para equilibrar a resolução de tempo da imagem e a qualidade da imagem. Uma vez definidos os parâmetros de imagem, reinicie a bomba para retomar o fluxo. A uma taxa de 0,03 mililitros por minuto, cinco serão entregues na célula de fluxo simultaneamente.

Inicie a imagem confocal com lapso de tempo. Assim que a imagem de lapso de tempo estiver concluída. Realizou análise de difusão de acordo com as instruções no documento anexo.

Para caracterizar o campo de fluxo ao redor dos biofilmes, diluir as microesferas fluorescentes de um micrômetro em água esterilizada até uma concentração sólida final de 0,2% e um volume final de 0,5 mililitros. Em seguida, faça um vórtice para garantir que as microesferas estejam bem dispersas, pause o fluxo e, em seguida, injete e entregue as microesferas fluorescentes diluídas na célula de fluxo. Como antes, altere a vazão para 0,01 mililitros por hora.

A baixa taxa de fluxo permite o rastreamento preciso do caminho da partícula. Mude as configurações confocais para o modo XYT e instrua o software a rastrear o movimento das partículas em uma fatia Z. Capture imagens de séries temporais como antes usando uma taxa de quadros de um hertz.

Repita o procedimento de injeção de partículas e a imagem em diferentes locais Z. Depois de concluir a imagem, siga as instruções no documento anexo para calcular vetores de fluxo para estudar as interações bacterianas em um biofilme sob um gradiente de glicose. Posa GFP e E coli foram diferenciadas em biofilmes de espécies duplas por meio de contracoloração.

Com cito, 62 imagens foram adquiridas em cada uma das nove regiões de imagem na câmara de fluxo. Nas sobreposições mostradas aqui, posa GFP aparece verde ou amarelo e e coli aparece vermelho. Posa dominou a biomassa de biofilme em regiões com altas concentrações de glicose e e coli dominou em regiões com baixas concentrações de glicose.

Assim, as duas espécies ocuparam nichos ecológicos distintos. Esses resultados demonstram a utilidade da célula de fluxo microfluídico de dupla entrada no estudo da atividade de desenvolvimento de biofilme e interações em ambientes complexos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar uma célula de fluxo microfluídico de entrada dupla para cultivar biofilmes sob gradientes químicos e como obter parâmetros ambientais para o desenvolvimento de biofilme usando as injeções de partículas fluorescentes ou caçadores após o desenvolvimento.

Esses métodos abriram caminho para pesquisadores nas áreas de microbiologia ambiental e clínica explorarem interações complexas entre comunidades microbianas e seu ambiente circundante.