Análise de uma única célula de Bacillus subtilis Os biofilmes utilizando microscopia de fluorescência e citometria de fluxo

O objetivo geral deste procedimento é visualizar e quantificar as subpopulações distintas de células especializadas que se diferenciam em biofilmes do organismo modelo, Bacillus subtilis. Isso é realizado primeiramente inserindo repórteres transcricionais no cromossomo de B. subtilis. Esses repórteres serão expressos exclusivamente na subpopulação de células em estudo.

O próximo passo é promover o desenvolvimento de um biofilme cultivando B. subtiles no meio indutor de biofilme, MS GG gg. Após a formação do biofilme, as células do biofilme são dispersas e fixadas com paraformaldeído. O passo final do procedimento é detectar o sinal de fluorescência emitido por células individuais da comunidade microbiana utilizando microscopia de fluorescência e citometria de fluxo.

No fim das contas, os resultados demonstram como as células especializadas produzem e secretam. A matriz extracelular que constitui o biofilme representa uma subpopulação distinta das células que secretam o surfactante, a molécula sinalizadora responsável pela diferenciação da subpopulação de produtoras de matriz. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a quantificação da expressão transcricional por meio de ensaios de viabilidade ou análises de micromatrizes, é que ela nos permite monitorar a expressão gênica em nível de célula única e visualizar populações celulares particularmente pequenas que são especializadas em expressar um gene específico.

Essas expressões gênicas não serão detectadas ao analisar a população geral. Plasmídeos integrativos são usados para marcar B. subtiles e um exemplo é mostrado aqui. PTAA, o promotor dos genes responsáveis pela produção de tass.

Uma proteína da matriz é clonada no vetor utilizando os sítios de restrição ECO R um e Hindi três. A expressão do gene repórter CFP está agora sob o controle de ptap A para iniciar o procedimento de marcação de B, sutilmente linearize o plasmídeo integrativo por digestão enzimática. A enzima de restrição recomendada é XH o um; quando o plasmídeo integrativo estiver pronto, induza competência natural na linhagem B subtiles 1 68 cultivando as células em meio indutor de competência por cinco horas a 37 graus Celsius.

Adicione o plasmídeo linearizado ao cultivo de células competentes de B subtiles e incube por duas horas a 37 graus Celsius; após duas horas, plaque as células em ágar com espetinomicina e incube durante a noite a 37 graus Celsius. O cromossomo de B subtiles possui dois locos neutros, AmyE e LAC A, que podem ser utilizados para integrar fusões marcadoras sem afetar o desenvolvimento do biofilme. O plasmídeo PKM008 linearizado integra-se ao genoma de B subtiles por dupla recombinação.

O próximo passo é transferir o gene repórter da linhagem marcada para uma linhagem capaz de formar biofilmes, utilizando o protocolo de transdução por fago SPP1. Para fins deste vídeo, apenas os passos importantes do protocolo são mostrados. Incube a linhagem doadora 1 68, que carrega a fusão do gene repórter, em meio TY a 37 graus Celsius até que a cultura atinja a fase estacionária inicial, adicionando 200 microlitros de células a 100 microlitros de estoque diluído de fago em um tubo de vidro.

E vamos manter a 37 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, pipete o ágar TY quente no tubo e misture bem por vortex. Espalhe suavemente sobre uma placa TY fresca e incube a 37 graus Celsius por oito a 16 horas para permitir o surgimento de halos de fago.

Para coletar os halos de fagos, adicione três mililitros de meio TY à placa e use a pipeta de vidro para desagregar o ágar superior. Transfira a suspensão de ágar para um tubo cônico de 15 mililitros. Vortexe suavemente para desagregar o ágar e, em seguida, centrifugue a 1000 ×g por 15 minutos.

Transfira o sobrenadante para um novo tubo. Passe o sobrenadante através de um filtro de seringa de 22 mícrons. Utilize este sobrenadante para infectar um cultivo da linhagem receptora cultivada em meio TY.

Adicione 30 microlitros de sobrenadante a 10 mililitros de cultura diluída na proporção de um para 10 e incube por 30 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, centrifugue a 5.000 RPM por sete minutos, ressuspenda o pellet em 200 microlitros de meio TY e plaque em uma placa contendo ESPECTInomicina mais 10 milimolares de citrato de sódio.

Incubar a 37 graus Celsius por 12 a 36 horas. Selecionar uma colônia e cultivá-la durante a noite em LB líquido a 37 graus Celsius. Por fim, aplicar três microlitros da cultura noturna em meio sólido indutor de biofilme.

Deixe as células crescerem por 72 horas a 30 graus Celsius. Após três dias de crescimento, os biofilmes formados na superfície do ágar Ms.GG desenvolverão uma arquitetura morfológica complexa na superfície do ágar. Para iniciar este procedimento, utilize um palito de dente ou pinça para remover o biofilme da superfície do ágar MSGG.

A consistência do biofilme deve permitir que ele seja removido inteiro da superfície do ágar. Coloque o biofilme em três mililitros de tampão PBS, dispersando-o suavemente. Realize 12 pulsos com uma saída de três e uma amplitude de 0,7 segundos para fixar as amostras antes da análise de célula única.

Re-suspenda 300 microlitros da suspensão celular em um mililitro de uma solução a 4% de paraformaldeído e incube à temperatura ambiente por exatamente sete minutos. Após a fixação de sete minutos, lave as células três vezes com tampão PBS. Por fim, re-suspenda as células em 300 microlitros de tampão PBS antes da microscopia de fluorescência.

Prepare uma lâmina de microscópio pipetando 200 microlitros de ágar a 0,8% sobre a lâmina e cobrindo-a cuidadosamente com outra lâmina. Após dois minutos, remova suavemente a lâmina superior para obter uma camada de ágar aderida à lâmina no ponto inferior. Adicione 2 microlitros de células fixadas sobre a superfície da camada de ágar e cubra com uma lamínula de microscópio.

Coloque a amostra na platina do microscópio de fluorescência. Ajuste o período de excitação de acordo com um controle negativo que não apresente fluorescência nas condições selecionadas para o experimento. A exposição deve estar entre 50 e 200 milissegundos.

Adquira uma imagem de fluorescência, bem como uma imagem de campo claro, para cada campo de visão. Para preparar as células para análise por citometria de fluxo, disperse a amostra de células fixadas por sonicação suave. Realize duas séries de 12 pulsos com uma saída de cinco e uma amplitude de 0,7 segundos para dispersar os agregados em células isoladas sem causar lise celular.

Confirme a eficiência da dispersão celular por microscopia de luz. Em seguida, dilua a amostra de um para 100 em tampão PBS. Um citômetro de fluxo BD FACS Canto II será usado nesta análise para fluorescência de YFP.

Uma excitação a laser em 488 nanômetros acoplada a um filtro 5 30 30 é utilizada para a fluorescência de CFP. Uma excitação a laser em 405 nanômetros acoplada a um filtro 4 0 8 40 é utilizada para calibrar o citômetro de fluxo com dois controles negativos. Uma amostra de tampão PBS sem células em suspensão deve servir como controle negativo para o tamanho da partícula detectada pelo citômetro de fluxo.

Uma amostra sem um marcador fluorescente deve servir como controle negativo para a sensibilidade fluorescente do fluxo. Após a calibração, coloque a amostra marcada com um marcador fluorescente no citômetro de fluxo; para cada amostra, analise pelo menos 50.000 eventos com uma taxa de fluxo entre 303.000 eventos por segundo. Quando *B. subtilis* cresce em uma placa com o meio indutor de biofilme, a formação de biofilme MSGG é observada após três dias de incubação a 30 graus Celsius.

O biofilme apresenta uma arquitetura morfológica complexa que indica as distintas subpopulações celulares participantes. Por exemplo, a produção da matriz extracelular e dos biofilmes resulta na formação de rugosidades na superfície da colônia. Esta figura mostra um exemplo de visualização da diferenciação celular em uma única linhagem marcada utilizando microscopia de fluorescência.

Esta linhagem carrega o repórter fluorescente Ptap, uma CFP expressa na subpopulação de células produtoras de matriz, colorida em azul. Esta subpopulação produz e secreta a matriz extracelular que constitui o biofilme. Esta próxima imagem é o resultado da visualização por microscopia de fluorescência de uma linhagem duplamente marcada que carrega o repórter Ptap, uma CFP, e o repórter adicional P Surfactin YFP.

Este segundo repórter permite o monitoramento da subpopulação de células responsáveis pela secreção da molécula sinalizadora surfactina, que desencadeia a cascata de sinalização para a diferenciação dos produtores da matriz. Aqui, os produtores da matriz são coloridos artificialmente em azul, enquanto os produtores de surfactante são coloridos artificialmente em amarelo, resultados da citometria de fluxo 2D utilizando uma única linhagem marcada que carrega o repórter ptap. Um YFB é apresentado aqui.

A cepa controle não tratada, sem genes de proteína fluorescente, apresentou uma única população com baixa fluorescência relativa em células que continham ptap. Um YFP em condições não indutoras de biofilme não diferenciou a subpopulação de produtoras de matriz, e toda a população também exibiu baixa fluorescência relativa. Em contraste, sob condições indutoras de biofilme, detectou-se uma subpopulação de células com alta fluorescência relativa, observada como um ombro à direita da fluorescência relativa baixa.

Resultados de pico obtidos a partir da citometria de fluxo 3D são mostrados aqui. Os sinais de fluorescência dos canais monitorados são apresentados no eixo X para YFP e no eixo Y para CFP; o painel superior esquerdo mostra uma linhagem sem genes de proteínas fluorescentes como controle para a fluorescência de fundo. No painel superior direito, uma linhagem marcada individualmente foi utilizada para detectar a subpopulação de produtores de surfactina no canal de fluorescência YFP destacado em amarelo.

No painel inferior esquerdo, uma cepa marcada diferente foi utilizada para detectar a subpopulação de produtores de matriz. No canal de fluorescência CFP destacado em azul, as subpopulações de produtores de matriz e produtores de surfactante são monitoradas utilizando a cepa duplamente marcada e os resultados são apresentados. Neste painel inferior direito.

Duas subpopulações de células que expressam altos níveis dos marcadores fluorescentes são detectadas. Cada população é delimitada, mostrando que não há sobreposição na expressão dos marcadores entre as duas subpopulações de células especializadas. Esta figura final mostra a quantificação das subpopulações de produtoras de matriz e canibais por citometria de fluxo tridimensional.

No painel superior direito, uma única linhagem marcada foi utilizada para detectar a subpopulação de canibais. No canal de fluorescência YFP destacado em amarelo, descreve-se que essa subpopulação de canibais diferencia-se coordenadamente com a subpopulação de produtores de matriz. No painel inferior esquerdo, a subpopulação de produtores de matriz é detectada em outra linhagem marcada única no canal de fluorescência CFP.

Delimitados em azul, os resultados da cepa duplamente marcada no painel inferior direito mostraram uma única subpopulação de células fluorescentes que expressam tanto YFP quanto CFP, delimitados em verde. A expressão simultânea dos dois marcadores indica que ambas as vias de diferenciação celular são coordenadamente ativadas na mesma subpopulação. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como visualizar e quantificar as subpopulações distintas de células que constituem um biofilme microbiano utilizando a análise celular da população, como microscopia fluorescente ou citometria de fluxo.