Análise de uma única célula de Bacillus subtilis Os biofilmes utilizando microscopia de fluorescência e citometria de fluxo

O objetivo geral deste procedimento é visualizar e quantificar as distintas subpopulações de células especializadas que se diferenciam em biofilmes do organismo modelo, bacilos sutis. Isso é feito inserindo primeiro repórteres transcricionais no cromossomo de B sutis. Esses repórteres serão expressos exclusivamente na subpopulação de células em estudo.

O próximo passo é promover o desenvolvimento de um biofilme cultivando sutis B no meio indutor de biofilme, Ms GG gg. Após a formação do biofilme, as células do biofilme são dispersas e fixadas com paraformaldeído. A etapa final do procedimento é detectar o sinal de fluorescência emitido por células individuais da comunidade microbiana usando fluorescência, microscopia e citometria de fluxo.

Em última análise, os resultados mostram como as células se especializaram em produzir e secretar. As matrizes extracelulares que constituem o biofilme são uma subpopulação diferente das células que secretam surfactante, a molécula sinalizadora responsável pela diferenciação da subpopulação de produtores de matrizes. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a quantificação da expressão da transcrição usando ensaios Vita Ities de análise de microraios, é que ela nos permite monitorar a expressão gênica em um único nível de célula e visualizar populações de células particularmente pequenas de células especializadas para expressar um gene específico.

Essas expressões gênicas não serão detectadas ao analisar a população geral. Plasmídeos integrativos são usados para rotular B sutis e um exemplo é mostrado aqui. PTAA, o promotor dos genes responsáveis pela produção de tass.

Uma proteína de matriz é clonada no vetor usando os sítios de restrição ECO R um e Hindi três. A expressão do gene repórter CFP está agora sob o controle de ptap A para iniciar o procedimento de marcação de B, sutilmente lineariza o plasmídeo integrativo por digestão enzimática. A enzima de restrição recomendada é XH oh um quando o plasmídeo integrativo estiver pronto, induza a competência natural na cepa B mais sutil 1 68 cultivando as células em meio indutor de competência por cinco horas a 37 graus Celsius.

Adicione o plasmídeo linearizado à cultura das células B mais sutis competentes e incube por duas horas a 37 graus Celsius após duas horas, coloque as células em ágar com spect micina e incube durante a noite a 37 graus Celsius. O cromossomo B sutil tem dois loci neutros, Amy, E, E e LAC A, que podem ser usados para integrar fusões repórter sem afetar o desenvolvimento do biofilme. O plasmídeo linearizado PKM 0 0 8 integra-se ao genoma de B sutis por dupla recombinação.

O próximo passo é transferir o repórter da cepa marcada para uma cepa capaz de formar biofilmes usando o protocolo de transdução de um fago SPP. Para o propósito deste vídeo, apenas as etapas importantes do protocolo são mostradas. Cultive a cepa doadora 1 68, abrigando a fusão repórter em meio TY a 37 graus Celsius até que a cultura atinja a fase estacionária inicial a 200 microlitros de células para 100 microlitros de estoque de fagos diluídos em um tubo de vidro.

E vamos ficar a 37 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, pipete o ágar macio TY quente no tubo e misture bem por vórtice. Espalhe suavemente em uma placa TY fresca e incube a 37 graus Celsius por oito a 16 horas para permitir o surgimento de halos de fagos.

Para coletar os halos de fagos, adicione três mililitros de meio TY à placa e use a pipeta de vidro para quebrar o ágar superior. Transfira a suspensão de ágar para um tubo de falcão de 15 mililitros. Agitar suavemente para quebrar o ágar e centrifugar a 1000 G durante 15 minutos.

Transferir o sobrenadante para um novo tubo. Passe o sobrenadante por um filtro de seringa de 22 mícrons. Utilizar este sobrenadante para infectar uma cultura da estirpe receptora cultivada em meio TY.

Adicione 30 microlitros de sobrenadante a 10 mililitros de cultura diluída de um a 10 e incube por 30 minutos a 37 graus Celsius. Após essa centrífuga a 5.000 RPM por sete minutos, resus suspende o pellet em 200 microlitros de meio TY e espalha em uma placa contendo micina SPECT mais 10 milimolares. Citrato de sódio.

Incube a 37 graus Celsius por 12 a 36 horas. Selecione uma colônia e cultive-a durante a noite em LB líquido a 37 graus Celsius. Finalmente, localize três microlitros da cultura durante a noite em meio indutor de biofilme sólido.

Deixe as células crescerem por 72 horas a 30 graus Celsius. Após três dias de crescimento, os biofilmes formados na superfície do ágar Ms.GG desenvolverão uma arquitetura morfológica complexa na superfície do ágar. Para iniciar este procedimento, use um palito ou pinça para remover o biofilme da superfície do ágar MSGG.

A consistência do biofilme deve permitir que ele seja removido da superfície do ágar. Em uma peça, coloque o biofilme em três mililitros de tampão PBS, disperse o biofilme suavemente. Execute 12 pulsos com uma saída de três e uma amplitude de 0,7 segundos para fixar as amostras antes da análise de célula única.

Resus suspende 300 microlitros da suspensão celular em um mililitro, uma solução de aldeído paraforme a 4% e incuba em temperatura ambiente por exatamente sete minutos. Após a fixação de sete minutos, lave as células em tampão PBS três vezes. Finalmente, ressuspenda as células em 300 microlitros de tampão PBS antes da microscopia de fluorescência.

Prepare uma lâmina de microscópio pipetando 200 microlitros de 0,8% agros sobre a lâmina e cobrindo-a cuidadosamente com outra lâmina. Após dois minutos, remova a lâmina superior suavemente para obter uma camada de agros presa à lâmina no ponto inferior. Dois microlitros de células fixas na superfície da camada agros e cubra-a com uma lamínula de microscópio.

Coloque a amostra no stage do microscópio de fluorescência. Definir o período de excitação de acordo com um controlo negativo que não mostre fluorescência nas condições seleccionadas para o ensaio. A exposição deve estar entre 50 a 200 milissegundos.

Adquira uma imagem de fluorescência, bem como uma imagem de campo claro para cada campo de visão. Para preparar as células para a análise por citometria de fluxo, dispersar a amostra de células fixas por sonicação suave. Execute duas séries de 12 pulsos com uma saída de cinco e uma amplitude de 0,7 segundos para dispersar aglomerados em células únicas sem causar lise celular.

Confirmar a eficiência da dispersão celular por microscopia de luz. Em seguida, dilua a amostra um a 100 em tampão PBS. Um citômetro de fluxo BD fax canto two será usado para esta análise de fluorescência YFP.

Uma excitação de laser a 488 nanômetros acoplada a um filtro 5 30 30 é usada para fluorescência CFP. Utiliza-se uma excitação laser a 405 nanómetros acoplada a um filtro 4 0 8 40, calibrando o citómetro de fluxo com dois controlos negativos. Uma amostra de tampão PBS sem células em suspensão deve servir como um controle negativo para o tamanho da partícula detectada pelo citômetro de fluxo.

Uma amostra sem um repórter fluorescente deve servir como um controle negativo para a sensibilidade fluorescente do fluxo. Citômetro após a calibração, coloque a amostra marcada com um repórter fluorescente no citômetro de fluxo para cada amostra, analise pelo menos 50.000 eventos com uma taxa de fluxo entre 303.000 eventos por segundo. Quando B Subtles cresce em uma placa do meio indutor de biofilme, a formação de biofilme MSGG é observada após três dias de incubação a 30 graus Celsius.

O biofilme mostra uma arquitetura morfológica complexa que é indicativa das distintas subpopulações celulares participantes. Por exemplo, a produção da matriz extracelular e dos biofilmes resulta na formação de rugas na superfície da colônia. Esta figura mostra um exemplo de visualização da diferenciação celular em uma única cepa marcada usando microscopia de fluorescência.

Esta cepa abriga o repórter fluorescente Ptap, um CFP que se expressa na subpopulação de células produtoras de matriz coloridas em azul. Essa subpopulação produz e secreta a matriz extracelular que constitui o biofilme. Esta próxima imagem é o resultado da visualização por microscopia de fluorescência de uma cepa duplamente marcada que abriga o repórter Ptap, A CFP, e o repórter adicional P Surfactina YFP.

Este segundo repórter permite o monitoramento da subpopulação de células responsáveis pela secreção da molécula sinalizadora surfactina, que desencadeia a cascata de sinalização para a diferenciação dos produtores da matriz. Aqui, os produtores de matriz são de cor falsa em azul, enquanto os produtores de surfactante são de cor falsa em amarelo, os resultados da citometria de fluxo 2D usando uma única cepa rotulada abrigando o repórter ptap. Um YFB é apresentado aqui.

A cepa de controle não tratada sem nenhum gene de proteína fluorescente mostrou uma única população com células de fluorescência relativa baixa abrigando ptap. Um YFP em condições não indutoras de biofilme não diferenciou a subpopulação de produtores de matrizes, e toda a população também apresentou baixa fluorescência relativa. Em contraste, sob condições indutoras de biofilme, uma subpopulação de células com alta fluorescência relativa foi detectada como um ombro à direita da baixa fluorescência relativa.

Os resultados de pico obtidos da citometria de fluxo 3D são mostrados aqui. Os sinais de fluorescência dos canais monitorados são apresentados no eixo X para YFP e eixo Y Para CFP, o painel superior esquerdo mostra uma cepa sem genes de proteína fluorescente como controle para fluorescência de fundo. No painel superior direito, uma única cepa marcada foi usada para detectar a subpopulação de produtores de surfactina no canal de fluorescência YFP emoldurado em amarelo.

No painel inferior esquerdo, uma cepa única marcada diferente foi usada para detectar a subpopulação de produtores de matriz. No canal de fluorescência CFP emoldurado em azul, as subpopulações de produtores de matriz e produtores de surfactante são monitoradas usando a cepa duplamente marcada e os resultados são apresentados. Neste painel inferior direito.

Duas subpopulações de células que expressam altos níveis de repórteres fluorescentes são detectadas. Cada população é enquadrada mostrando que não há sobreposição na expressão dos repórteres entre as duas subpopulações de células especializadas. Esta figura final mostra a quantificação das subpopulações de produtores de matrizes e canibais por citometria de fluxo 3D.

No painel superior direito, uma única cepa marcada foi usada para detectar a subpopulação de canibais. No canal de fluorescência YFP emoldurado em amarelo, esta subpopulação de canibais foi descrita para se diferenciar coordenadamente com a subpopulação de produtores de matrizes. No painel inferior esquerdo, a subpopulação de produtores de matriz é detectada em outra cepa marcada única no canal de fluorescência CFP.

Emoldurados em azul, os resultados da cepa duplamente marcada no painel inferior direito mostraram uma única subpopulação de células fluorescentes expressando YFP ou CFP emoldurados em verde. A expressão simultânea dos dois repórteres indica que ambas as vias de diferenciação celular são ativadas por coordenadas na mesma subpopulação. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como visualizar e quantificar as distintas subpopulações de células que constituem um biofilme microbiano usando a análise de células da população de células, como microscopia fluorescente ou citometria de fluxo.