A utilização de uma alta taxa de transferência

O objetivo geral deste procedimento é criar biofilmes de placa dentária multiespécies composicionalmente representativos. Em paralelo, para análise, isso é alcançado primeiramente pela criação de um meio e inóculo representativos. O inóculo é então introduzido no chip microfluídico após uma incubação de 12 horas, formando-se um biofilme dentro do microcanal.

Por fim, o biofilme é lavado e corado para microscopia confocal a laser de varredura in situ ou microscopia de fluorescência epi. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como as células de fluxo, é que se trata de um sistema de alto rendimento que permite a realização de múltiplos experimentos em paralelo, utilizando menos materiais e sem necessidade de meios artificiais de laboratório. Para iniciar, colete amostras de saliva de um grupo de cinco ou mais voluntários em tubos plásticos individuais de 50 mililitros.

Retire as amostras de saliva para um único béquer de plástico colocado sobre gelo. Evite o uso de béqueres de vidro nesta montagem, pois os biopolímeros salivares tendem a aderir às superfícies de vidro. Em seguida, adicione ditiotreitol à amostra até que sua concentração final seja 2,5 milimolar.

Agite a mistura por 10 minutos em gelo. Transfira todo o conteúdo para vários tubos plásticos. Realize uma centrifugação de alta velocidade por 30 minutos em uma centrífuga refrigerada a quatro graus Celsius para separar os particulados da amostra.

Transfira o sobrenadante salivar para um recipiente novo e estéril e descarte a fração do precipitado para preparar um meio de crescimento livre de bactérias a partir da amostra. Primeiro, dilua a amostra livre de detritos do dia com três volumes de água desionizada. Em seguida, utilize um filtro de membrana com baixa ligação a proteínas de 0,22 µm.

Sterilize a saliva mantendo a fração pós-filtrada resfriada em gelo. Elua a solução esterilizada e armazene a menos 80 graus Celsius até o uso. Colete amostras de saliva de uma coorte de cinco ou mais voluntários em tubos plásticos estéreis de 50 mililitros.

Retire as amostras de saliva para um béquer plástico previamente esterilizado em temperatura ambiente ou para um tubo de 50 mililitros. Adicione glicerol esterilizado até obter uma mistura contendo 25% de glicerol e 75% de saliva.

Diferentemente do protocolo de meio de crescimento, no qual os contaminantes foram removidos por uma etapa de filtração, a técnica estéril é importante aqui para prevenir contaminação por bactérias ou fungos não específicos da cavidade bucal. Prepare a solução de saliva com glicerol. Aliquotar bem a mistura de saliva e glicerol e armazenar as amostras a menos 80 graus Celsius até que sejam necessárias para iniciar o procedimento.

Adquira ou fabrique um chip microfluídico com microcanal semelhante aos mostrados aqui antes de inocular amostras no microchip, tanto para o meio de crescimento negativo para bactérias quanto para o inóculo positivo para bactérias, sobre a bancada à temperatura ambiente. Vortexe cada tubo por cinco segundos para homogeneizar antes de prosseguir com o experimento principal; comece adicionando 100 microlitros do meio de crescimento no reservatório de saída do microchip. Utilizando uma bomba controlada por computador, inicie o fluxo de cisalhamento do meio através do microcanal por dois minutos.

À temperatura ambiente, inspecione visualmente cada canal para garantir o preenchimento adequado com fluido. Incube o microchip à temperatura ambiente por 20 minutos. Isso revestirá as paredes laterais dos microcanais com uma estrutura de biopolímero à qual o biofilme se ancorará durante o crescimento.

Em seguida, aspire manualmente ou remova o meio remanescente do reservatório de saída e transfira esta fração, que agora atuará como uma carga de equilíbrio hidrodinâmico para o reservatório de entrada. Após a deposição do esqueleto de biopolímero, adicione 100 microlitros do inóculo positivo bacteriano ao reservatório de saída. Coloque o microchip sobre uma placa aquecida a 37 °C e inicie o fluxo reverso de cisalhamento médio.

Transporte do reservatório de saída para o reservatório de entrada exatamente por seis segundos. Em seguida, desligue a bomba e incube o chip em condições estáticas a 37 graus Celsius por 40 minutos para facilitar a adesão de bactérias ou fungos às paredes laterais dos microcanais. A seguir, remova e descarte todo o inóculo do reservatório de saída com uma pipeta e reabasteça o mesmo reservatório adicionando um mililitro de meio de crescimento livre de bactérias.

Incube o microchip a 37 graus Celsius por aproximadamente 20 horas sob fluxo baixo para promover o crescimento de biofilme intracanal durante o crescimento noturno. Pipete todas as soluções dos reservatórios de entrada e saída. Adicione 100 microlitros de PBS no reservatório de entrada e lave o microcanal por 20 minutos.

Sob fluxo laminar contínuo da entrada para a saída, o biofilme está agora pronto para a coloração de células vivas e mortas. Imediatamente antes da coloração do biofilme, prepare 100 microlitros da mistura de coloração de viabilidade conforme descrito no protocolo textual, para cada canal a ser corado. Proteja esta solução da exposição à luz até o momento de utilizá-la para coloração do biofilme; aspire todo o líquido remanescente da entrada e reabasteça o mesmo reservatório com 100 microlitros da mistura de coloração de viabilidade.

Em seguida, empurre a solução corante através do microcanal durante 45 minutos. Sob fluxo de baixa cisalhamento à temperatura ambiente, certifique-se de proteger o chip da exposição à luz. Aspire todo o líquido remanescente do reservatório de entrada e reponha com 100 microlitros de PBS.

Lave o microcanal durante 20 minutos sob fluxo de baixa cisalhamento à temperatura ambiente para remover corantes não ligados em excesso. O biofilme corado está agora pronto para microscopia fluorescente para ensaio da arquitetura tridimensional dos biofilmes. Reconstruções digitais utilizando varreduras horizontais com um microscópio confocal podem ser usadas para visualizar a estrutura geral do filme a partir de qualquer ângulo oblíquo.

Além disso, a análise de coloração de viabilidade celular pode ser aplicada ao mesmo conjunto de dados para estudar a dependência espacial da viabilidade celular dentro do biofilme em função de diferentes tratamentos químicos. Uma vez que o biofilme tenha sido imagiado, células de canais não corados podem ser extraídas. Utilizando água destilada operando em fluxo de cisalhamento elevado, a microbiota do biofilme pode então ser identificada a partir do DNA genômico por pirosequenciamento 4 5 4.

Após seguir este procedimento, podem ser realizados outros métodos, como a adição de diferentes espécies ou compostos, com o objetivo de responder a diferentes perguntas, como o que acontece com os biofilmes multiespécies sob diversas condições.