A utilização de uma alta taxa de transferência In Vitro Microfluidic Sistema de Desenvolvimento Oral Biofilms Multi-espécies

O objetivo geral deste procedimento é criar biofilmes de placa dentária multiespécies e representativos da composição. Paralelamente à análise, isso é conseguido criando primeiro um meio e um inóculo representativos. O inóculo é então introduzido no chip microfluídico após uma incubação noturna, um biofilme se forma dentro do microcanal.

Finalmente, o biofilme é lavado e corado para microscopia de varredura a laser confocal in situ ou microscopia de epifluorescência. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como células de fluxo, é que é um sistema de alto rendimento que permite que vários experimentos sejam feitos em paralelo, usando menos materiais e não exigindo meios artificiais de laboratório. Para começar, colete amostras de saliva de uma coorte de cinco ou mais voluntários em tubos plásticos individuais de 50 mililitros.

Puxe as amostras de saliva para um único copo de plástico colocado no gelo. Evite usar copos de vidro nesta configuração, pois os biopolímeros de saliva tendem a aderir às superfícies de vidro. Em seguida, adicione este orifício à amostra até que sua concentração final seja de 2,5 milimolares.

Mexa a mistura por 10 minutos no gelo. Puxe todo o conteúdo para vários tubos de plástico. Execute uma centrifugação de alta velocidade por 30 minutos em uma centrífuga resfriada a quatro graus Celsius para separar as partículas da amostra.

Transfira o sato de saliva para um recipiente fresco e estéril e descarte a fração de pellets para preparar um meio de crescimento livre de bactérias a partir da amostra. Primeiro, dilua a amostra grátis de detritos do dia com três volumes de água deionizada. Em seguida, usando um filtro de membrana de baixa ligação a proteínas de 0,22 micro.

Esterilize a saliva enquanto mantém a fração pós-filtrada gelada. Eloquente a solução esterilizada e armazene a menos 80 graus Celsius até que seja necessário. Colete amostras de saliva de uma coorte de cinco ou mais voluntários em tubos plásticos estéreis de 50 mililitros.

Puxe as amostras de saliva para um copo de plástico pré-esterilizado à temperatura ambiente ou tubo de 50 mililitros. Adicione glicerol esterilizado até obter 25% de glicerol. 75% de mistura de saliva é atingida.

Ao contrário do protocolo do meio de crescimento, onde os contaminantes foram removidos com uma etapa de filtração, a técnica estéril é importante aqui para evitar a contaminação por bactérias ou fungos específicos não orais. Misture a solução de glicerol para saliva. Bem, aliquote a mistura de glicerol da saliva e armazene as amostras a menos 80 graus Celsius até que sejam necessárias para começar.

Compre ou fabrique um chip microfluídico com microcanal semelhante aos mostrados aqui antes de inocular amostras no microchip para o meio de crescimento negativo para bactérias e inóculo positivo para bactérias na bancada à temperatura ambiente. Vortex cada tubo por cinco segundos para misturar antes de prosseguir para o experimento principal, comece adicionando 100 microlitros do meio de crescimento no reservatório de saída dos microchips. Usando uma bomba de controle de computador, inicie o fluxo médio através do microcanal por dois minutos.

À temperatura ambiente, inspecione visualmente cada canal para garantir o enchimento adequado do fluido. Incube o microchip em temperatura ambiente por 20 minutos. Isso revestirá as paredes laterais do microcanal com um andaime de biopolímero no qual o biofilme se ancorará durante o crescimento.

Em seguida, aspire manualmente ou o meio remanescente do reservatório de saída e transfira essa fração, que agora atuará como uma carga de balanceamento hidrodinâmico para o reservatório de entrada. Após a deposição do andaime de biopolímero, adicione 100 microlitros do inóculo positivo da bactéria ao reservatório de saída. Coloque o microchip em uma placa quente de 37 graus Celsius e inicie o fluxo reverso de cisalhamento médio.

Viajando da saída para o reservatório de entrada por exatamente seis segundos. Em seguida, desligue a bomba e incube o chip em condições estáticas a 37 graus Celsius por 40 minutos para facilitar a fixação de bactérias ou fungos nas paredes laterais do microcanal. Em seguida, remova e descarte todo o inóculo do reservatório de saída com uma pipeta e reabasteça o mesmo reservatório adicionando um mililitro de meio de crescimento livre de bactérias.

Incube o microchip a 37 graus Celsius por aproximadamente 20 horas sob baixo fluxo para promover o crescimento do biofilme intracanal após o crescimento noturno. Pipetar todas as soluções dos reservatórios de entrada e saída. Aplique 100 microlitros de PBS no reservatório de entrada e lave o microcanal por 20 minutos.

Sob baixo fluxo direto da entrada para a saída, o biofilme agora está pronto para coloração de mortos vivos. Pouco antes da coloração do biofilme, prepare 100 microlitros da mistura de coloração de viabilidade encontrada no protocolo de texto para cada canal a ser corado. Proteja esta solução da exposição à luz até que seja necessário corar o biofilme, aspirar todo o líquido restante da entrada e reabastecer o mesmo reservatório com 100 microlitros da mistura de coloração de viabilidade.

Em seguida, empurre a solução de coloração através do microcanal por 45 minutos. Sob baixo fluxo de compartilhamento à temperatura ambiente, certifique-se de proteger o chip da exposição à luz. Aspire todo o líquido restante do reservatório de entrada e reabasteça com 100 microlitros de PBS.

Lave o microcanal por 20 minutos Sob baixo fluxo de compartilhamento à temperatura ambiente para remover o excesso de corantes não ligados. O biofilme corado está agora pronto para microscopia fluorescente para testar a arquitetura tridimensional dos biofilmes. Reconstruções digitais usando varreduras horizontais com um microscópio confocal podem ser usadas para visualizar a estrutura geral do filme de qualquer ângulo oblíquo.

Além disso, a análise de coloração de mortos vivos pode ser aplicada ao mesmo conjunto de dados para estudar a dependência espacial da viabilidade celular dentro do biofilme em função de diferentes tratamentos químicos. Uma vez que o biofilme tenha sido fotografado, as células dos canais não corados podem ser extraídas. Usando água destilada operando em alto fluxo de cisalhamento, a flora do biofilme pode então ser identificada a partir do DNA genômico por 4 5 4 pirosequenciamento.

Seguindo este procedimento. Outros métodos, como a adição de diferentes espécies ou compostos, podem ser realizados para responder a diferentes perguntas, como o que acontece com os biofilmes multiespécies sob várias condições.