Isolamento e cultura de células endoteliais da Embryonic posencéfalo

O objetivo geral deste procedimento é preparar culturas puras de células endoteliais de quatro cérebros embrionários para estudar a angiogênese cerebral e as interações neurovasculares. Isso é feito primeiro descascando a membrana da casca e isolando o céfalo dos cérebros embrionários. A segunda etapa do procedimento é produzir uma única suspensão celular usando dissociação, filtração e digestão do tecido colhido.

O terceiro passo é rotular magneticamente as células usando microesferas CD 31. As etapas finais são purificar as células marcadas com CD 31 por separação magnética e, em seguida, cultivá-las. Em última análise, populações puras de células endoteliais paraventriculares são geradas para estudo posterior por meio de microscopia de imunofluorescência e ensaios de angiogênese.

Este método beneficiará estudos com foco em mecanismos celulares e moleculares. Para o anis cerebral, pode servir como uma ferramenta para elucidar interações de células endoteliais pré-ventriculares e diafonia com tipos de células neuronais. Ele também possui um tremendo potencial para a missão ansis terapêutica.

A demonstração deste método é fundamental para eliminar algumas das dificuldades técnicas associadas ao isolamento e cultura de populações puras de células endoteliais de embrionárias para o cérebro. Para este protocolo, tenha cabeças de filhotes E 15 de barragens CD um em PBS gelado sob um estereoscópio. Remova os miolos com microponta fina, tesoura e pinça fina.

Uma boa dissecção é fundamental e virá com a prática e com as ferramentas em excelentes condições. Em seguida, use a pinça para segurar firmemente o cérebro e a tesoura de microponta para descascar a membrana da casca. Esta etapa é a mais desafiadora do procedimento, mas as habilidades necessárias virão com a prática.

Em seguida, remova o mesencéfalo e encontre Cephalon. Isole o céfalo. Em seguida, transfira-o livre da membrana da casca para uma placa de cultura de 35 milímetros com dois mililitros de PBS no gelo.

Colete todas as garras em um único prato. Comece picando as garras em fragmentos de um ou dois milímetros com uma lâmina de bisturi. Colete o tecido em um tubo de 15 mililitros contendo dois mililitros de DMEM completo.

Dissociar o tecido suavemente, mas completamente, tri com uma pipeta de um mililitro, até que os aglomerados desapareçam e se obtenha uma suspensão leitosa. Centrifugar a suspensão a 800 a 1000 g durante cinco minutos. À temperatura ambiente, remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração e resus.

Suspender o palato em DMEM com DS um. Dissociar agora as células de novo com uma acção suave e repetir o passo de centrifugação. Em seguida, ressuspenda o pellet em DMEM completo aquecido.

Filtre as células suspensas através de uma malha de náilon de 70 mícrons e colete as porções celulares retidas na malha e digere ainda mais em dois mililitros de DMEM com colagenase e dis bays. Espere alguns minutos e depois lave o lenço de papel. Três para usar centrifugação e resus do pellet em DMEM com DS uma piscina, a coleta lavada com o filtrado mantido em gelo.

Em seguida, lave a combinação com DMEM completo usando centrifugação e resus. Agora determine o número da célula com um hemocitômetro e prossiga com a marcação magnética. Os volumes neste protocolo são válidos para até 10 milhões de células Para números maiores de células, basta aumentar a escala.

Comece centrifugando a suspensão celular a 300 G por 10 minutos à temperatura ambiente, aspire completamente o sobrenadante e adicione 90 microlitros de tampão de purificação resfriado ao pellet celular, seguido por 10 microlitros de microesferas conjugadas CD 31. Misture bem as células usando uma pipeta de 200 microlitros e incube a suspensão por 15 minutos na geladeira, mas não mais, para que a rotulagem permaneça específica. Lave as células adicionando um a dois mililitros de tampão de purificação refrigerado e centrifugando a 300 G por 10 minutos.

Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em 500 microlitros de tampão de purificação resfriado. Agora carregue uma coluna MS no campo magnético do separador máximo. Em seguida, enxágue a coluna com 500 microlitros de tampão de purificação em temperatura ambiente.

Em seguida, aplique a suspensão da célula à coluna. É bom para até 20 milhões de células. Colete e descarte todo o fluxo através do qual contém as células não rotuladas.

Lave a coluna com 500 microlitros de tampão de purificação três vezes. Certifique-se sempre de que o reservatório da coluna esteja vazio antes de adicionar alíquotas de tampão de purificação subsequentes. Agora remova a coluna do separador máximo e coloque-a em um tubo de 15 mililitros.

Adicione um mililitro de tampão de purificação à coluna e lave imediatamente as células marcadas magneticamente empurrando firmemente o êmbolo fornecido para dentro da placa da coluna. As células foram liberadas em uma placa de cultura de 35 milímetros pré-codificada com colágeno. Digite um.

Agora cultive as células com ECCM em uma incubadora ajustada para 37 graus Celsius com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono. Troque o meio a cada quatro dias. Observe as células que crescem na placa de cultura através de um microscópio todos os dias.

A caracterização fenotípica das células endoteliais periventriculares ou PVE CS muda do primeiro ao dia 12, conforme visto por microscopia de luz de contraste de fase. As células ligadas ao prato no primeiro dia mostram morfologia característica de divisão celular entre cinco a oito dias. O PVE CS faz a transição de um paralelepípedo para uma morfologia fusiforme típica das células endoteliais e mais semelhante ao seu estado in vivo.

No dia 12. A cultura PVEC atinge a plena confluência. Os p vs podem ser subcultura facilmente para expandir a colônia após a subcultura.

A pureza das culturas de células endoteliais foi determinada em 100% usando os seguintes marcadores de células endoteliais. ISO selectina antes do fator de von Willbrand CD 31, PE cam one e caderina VE de alta ampliação de PV Cs preparadas a partir de embriões CD one, bem como dois embriões GFP cujas células endoteliais expressaram GFP foram marcados com lectina ISO antes de mostrarem as morfologias comuns em forma de paralelepípedo e fusiforme, bem como morfologias poligonais com processos delgados em algumas placas de cultura revestidas de colágeno. Na ausência de matrigel pve, o CS formou padrões de rede semelhantes à característica única da rede vascular periventricular in vivo.

Isso reflete o alto potencial angiogênico do pve. Cs.Um ensaio de angiogênese foi realizado no qual 20.000 PVE CS foram adicionados a placas de cultura revestidas com matriz de gel de matriz. Esses PV Cs mostraram formação robusta de tubos em 18 horas.

O estudo de longo prazo de pve CS, incluindo migração, morfologia de motilidade, ensaios de função celular, bem como experimentos in vivo, é possível marcando PV vs. Isolado de embriões CD one com nanocristais de ponto Q. Esses nanocristais fornecem uma fluorescência intensa e estável no citoplasma das células vivas.

Pve EECS pode ser transfectado com marcadores celulares como a membrana plasmática de luz celular. RFP back MAM 2.0 para visualização clara da morfologia celular em experimentos de imagem de células vivas. Pve CS foram cultivados em vários meios e a morfologia celular foi comparada por microscopia de contraste de fase e ISO selectina antes da coloração.

Enquanto PV CS cultivado em ECCM mostrou morfologia fusiforme e foi confluente no dia 12, pve CS cultivado em meio de crescimento de células endoteliais de cérebro de rato mostrou morfologia muito alongada e foi confluente no dia 20. Por outro lado, PV CS cultivado em D-M-E-M-F 12. Os meios apresentaram apenas morfologia plana e poligonal sem formação de fusos, tiveram crescimento muito rápido e foram contidos no quarto dia.

Pve eecs foram cultivados em ECCM por até três passagens sem perda de fenótipo e função. Portanto, o ECCM é o meio preferido para a cultura de PVEC. Uma vez dominado, este stick pode ser feito em três horas se for executado corretamente.

A cocultura de células endoteliais periventriculares com precursores neuronais provavelmente estimula a neurogênese e a migração neuronal muito melhor do que as células endoteliais do cérebro adulto ou de outras fontes. Eles podem, portanto, ser valiosos para ajudar na recuperação da função neurológica em muitos cenários diferentes.