Isolamento e cultura de células endoteliais da Embryonic posencéfalo

O objetivo geral deste procedimento é preparar culturas puras de células endoteliais a partir de quatro cérebros embrionários para estudar a angiogênese cerebral e as interações neurovasculares. Isso é realizado primeiramente removendo a membrana perivascular e isolando o cefalônio de cérebros embrionários. O segundo passo do procedimento consiste em produzir uma suspensão de células únicas por meio da dissociação, filtração e digestão do tecido coletado.

O terceiro passo é rotular magneticamente as células utilizando microesferas de CD31. Os passos finais são purificar as células marcadas com CD31 por separação magnética e, em seguida, cultivá-las. Em última análise, populações puras de células endoteliais paraventriculares são obtidas para estudos posteriores por microscopia de imunofluorescência e ensaios de angiogênese.

Este método beneficiará estudos focados em mecanismos celulares e moleculares. Para os anis cerebrais, pode servir como uma ferramenta para elucidar interações entre células endoteliais ventriculares e comunicação cruzada com tipos celulares neuronais. Também possui um potencial enorme para a missão terapêutica em anis.

A demonstração deste método é essencial para eliminar algumas das dificuldades técnicas associadas ao isolamento e cultivo de populações puras de células endoteliais a partir de embriões cerebrais. Para este protocolo, tenha as cabeças de filhotes E 15 de ratas CD1 em PBS gelado sob um estereoscópio. Remova os cérebros com tesoura de micro ponta fina e pinça fina.

Uma boa dissecação é essencial e será aperfeiçoada com a prática e com o uso de ferramentas em excelente estado. Em seguida, utilize a pinça para obter um bom controle sobre o cérebro e as tesouras microcirúrgicas para remover a membrana. Esta etapa é a mais desafiadora do procedimento, mas as habilidades necessárias serão desenvolvidas com a prática.

Em seguida, remova o mesencéfalo e o met cefálon. Isole o cefálon. A seguir, transfira-o livre da membrana serosa para uma placa de cultura de 35 milímetros com dois mililitros de PBS sobre gelo.

Colete todas as garras em um único recipiente. Comece picando as garras em fragmentos de um ou dois milímetros com uma lâmina de bisturi. Reúna o tecido em um tubo de 15 mililitros contendo dois mililitros de DMEM completo.

Dissocie o tecido suave mas completamente com uma pipeta de um mililitro até que os agregados desapareçam e seja obtida uma suspensão leitosa. Centrifugue a suspensão a 800–1000 ×g durante cinco minutos. À temperatura ambiente, remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração e ressuspenda.

Suspenda o palato em DMEM com DS um. Dissocie as células novamente usando agitação suave e repita a etapa de centrifugação. Em seguida, re-suspenda o pellet em DMEM completo aquecido.

Filtre as células suspensas através de uma malha de náilon de 70 mícrons e colete as porções celulares retidas na malha, digerindo-as adicionalmente em dois mililitros de DMEM com colagenase e dis bays. Aguarde alguns minutos e, em seguida, lave o tecido. De três a utilizando centrifugação e ressus do pellet em DMEM com DS um pool, a coleção lavada com o filtrado mantido em gelo.

Em seguida, lave a combinação com DMEM completo utilizando centrifugação e ressuspensão. Agora, determine o número de células com um hemocitômetro e prossiga com a marcação magnética. Os volumes deste protocolo são adequados para até 10 milhões de células. Para números maiores de células, basta aumentar proporcionalmente os volumes.

Inicie centrifugando a suspensão celular a 300 G durante 10 minutos à temperatura ambiente, aspire completamente o sobrenadante e adicione 90 microlitros de tampão de purificação gelado ao pellet celular, seguido por 10 microlitros de microesferas conjugadas com CD31. Misture bem as células usando uma pipeta de 200 microlitros e incube a suspensão por 15 minutos em geladeira, mas não por mais tempo, para que a marcação permaneça específica. Lave as células adicionando um a dois mililitros de tampão de purificação gelado e centrifugando a 300 G durante 10 minutos.

Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em 500 microlitros de tampão de purificação gelado. Em seguida, coloque uma coluna MS no campo magnético do separador max. A seguir, lave a coluna com 500 microlitros de tampão de purificação à temperatura ambiente.

Em seguida, aplique a suspensão celular na coluna. É adequada para até 20 milhões de células. Colete e descarte todo o fluxo que passa, o qual contém as células não marcadas.

Lave a coluna com 500 microlitros de tampão de purificação três vezes. Certifique-se sempre de que o reservatório da coluna esteja vazio antes de adicionar alíquotas subsequentes de tampão de purificação. Agora, remova a coluna do separador max e coloque-a em um tubo de 15 mililitros.

Adicione um mililitro de tampão de purificação à coluna e imediatamente elimine as células marcadas magneticamente empurrando firmemente o êmbolo fornecido para dentro da placa da coluna. As células eliminadas devem ser colocadas em uma placa de cultura de 35 milímetros previamente revestida com colágeno tipo um.

Agora, cultive as células com ECCM em uma incubadora ajustada a 37 graus Celsius, com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono. Troque o meio a cada quatro dias. Observe diariamente as células em crescimento na placa de cultura por meio de microscópio.

A caracterização fenotípica de células endoteliais periventriculares ou mudanças nas PCS ao longo dos dias um a doze, conforme observado por microscopia de contraste de fase. As células aderidas ao recipiente no primeiro dia mostram uma morfologia característica de divisão celular entre cinco e oito dias. As PCS passam de uma morfologia pavimentosa para uma forma alongada típica de células endoteliais e mais semelhante ao seu estado in vivo.

No dia 12, o cultivo de PVEC atinge confluência total. Os p vs podem ser subcultivados facilmente para expandir a colônia após a subcultura.

A pureza das culturas de células endoteliais foi determinada como sendo 100% utilizando os seguintes marcadores de células endoteliais: ISO selectina antes do fator de von Willebrand, CD31, PE cam-1 e VE-caderina. Imagens de alta magnificação de PVCs preparadas a partir de embriões CD1, bem como de embriões tie2-GFP cujas células endoteliais expressavam GFP, foram marcadas com ISO lectina antes, mostrando as morfologias comuns em forma de calçada e fusiforme, bem como morfologias poligonais com prolongamentos delgados em algumas placas de cultura revestidas com colágeno. Na ausência de Matrigel, as PVCs formaram padrões em rede que lembram a característica única da rede vascular periventricular in vivo.

Isso reflete o alto potencial angiogênico dos PVE Cs. Foi realizado um ensaio de angiogênese no qual 20.000 PVE Cs foram adicionados a placas de cultura revestidas com gel de matriz. Esses PVE Cs mostraram formação robusta de tubos em 18 horas.

É possível realizar um estudo de longo prazo de CS pve, incluindo migração, motilidade, morfologia, ensaios de função celular, bem como experimentos in vivo, marcando PVs isolados de embriões CD1 com nanocristais de ponto quântico. Esses nanocristais proporcionam uma fluorescência intensa e estável no citoplasma de células vivas.

Pve EECS podem ser transfectados com traçadores celulares como CellLight Membrana Plasmática RFP, MAM 2.0, para uma clara visualização da morfologia celular em experimentos de imagem celular viva. Pve CS foram cultivadas em diversos meios e a morfologia celular foi comparada por microscopia de contraste de fase e seletina ISO antes da coloração.

Enquanto as CS PV cultivadas em ECCM apresentavam morfologia alongada e se tornaram confluentes no 12º dia, as CS pve cultivadas em meio de crescimento para células endoteliais cerebrais de rato exibiram morfologia muito alongada e tornaram-se confluentes no 20º dia. Por outro lado, as CS PV cultivadas em meio D-M-E-M-F 12 apresentaram apenas morfologia plana e poligonal, sem formação de fusiforme, crescimento muito rápido e alcançaram confluência no quarto dia.

PVE eecs foram cultivadas em ECCM por até três passagens sem perda de fenótipo e função. Portanto, ECCM é o meio preferido para o cultivo de PVEC. Uma vez dominado, este procedimento pode ser realizado em três horas, se for executado corretamente.

O cultivo conjunto de células endoteliais periventriculares com precursores neuronais provavelmente estimula a neurogênese e a migração neuronal muito mais eficazmente do que as células endoteliais do cérebro adulto ou de outras origens. Elas podem, portanto, ser valiosas para auxiliar a recuperação da função neurológica em muitos cenários diferentes.