Isolamento de células progenitoras endoteliais de sangue humano do Cordão Umbilical

O objetivo do presente protocolo é isolar as células progenitoras endoteliais do sangue do cordão umbilical. Algumas das aplicações incluem o uso dessas células como um biomarcador para identificar pacientes com risco cardiovascular, tratamento de doenças isquêmicas, e criando engenharia de tecido vascular e coração válvula de construções.

O objetivo geral deste procedimento é isolar as células progenitoras endoteliais do sangue do cordão umbilical humano. Este método descreve o isolamento de células progenitoras endoteliais do sangue do cordão umbilical para seu uso potencial como células autólogas para a engenharia de tecidos de enxertos vasculares. A principal vantagem desta técnica é que o procedimento de isolamento pode ser feito em meios especializados sem a necessidade de qualquer classificação de aminoácidos.

As células progenitoras endoteliais isoladas podem ser usadas para estudar a neovascularização, e relatos também sugerem que essas células podem ser usadas como biomarcadores para identificar pacientes com risco para doenças cardiovasculares. Antes de iniciar o procedimento de isolamento, pré-cubra seis placas de poço com dois mililitros de rabo de rato recém-preparado, uma solução de colágeno por poço. Equilibre a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de CO2 por pelo menos uma hora.

Em seguida, dilua aproximadamente 25 mililitros de sangue do cordão umbilical com HBSS em uma concentração de um para um. Em seguida, adicione 20 mililitros de reagente de meio de gradiente de densidade a um tubo cônico de 50 mililitros e dispense cuidadosamente 20 mililitros de sangue de cordão umbilical diluído pela parede do tubo para colocar o sangue no meio. Separe as células por centrifugação, seguida de remoção cuidadosa da camada de plasma.

Usando uma seringa equipada com uma agulha de calibre 18, colete a célula mononuclear contendo o revestimento buffy em um novo tubo de 50 mililitros. E adicione um volume igual de meio basal endotelial às células. Lave as células por centrifugação e lise os glóbulos vermelhos no palato resultante com cinco mililitros de solução de cloreto de amônio no gelo.

Após cinco a 10 minutos com agitação ocasional, coletar as células por centrifugação e ressuspender o pellet branco em meio de crescimento endotelial fresco. Após a contagem, aspire o colágeno de cada poço da placa de seis poços e lave os poços três vezes em PBS. Semeie as células mononucleares em uma vez 10 elevado a sete células por dois mililitros de meio por concentração de poço.

E devolva a placa à incubadora por 24 horas. No dia seguinte, enxágue as células uma vez com meio de crescimento endotelial fresco. Em seguida, substitua a lavagem por três mililitros de meio de crescimento endotelial fresco e retorne as células à incubadora de cultura de células.

Usando um microscópio de campo brilhante, obtenha imagens diárias das células para monitorar a progressão das colônias de células endoteliais, marcando as placas onde as colônias surgem para acompanhar seu crescimento. Quando as colônias de células endoteliais atingirem cerca de três milímetros de tamanho, cubra um frasco de cultura T25 com colágeno fresco de cauda de rato por pelo menos uma hora na incubadora de cultura de células. Em seguida, colha as células com 150 microlitros de 0,05% de tripsina-EDTA por poço na incubadora de cultura de células por dois a três minutos.

Bata suavemente na placa para desalojar as células anexadas. Quando as células começarem a se desprender, adicione imediatamente dois mililitros de meio de crescimento endotelial fresco e puxe as células em um único tubo cônico de 15 mililitros. Colete as células por centrifugação e ressuspenda o pellet em meio de crescimento endotelial fresco.

Após a contagem, semeie as células no frasco revestido de colágeno em cinco vezes 10 até a quinta células em três mililitros de densidade média por frasco e marque o frasco como passagem um. Em seguida, retorne o frasco à incubadora, replantando as células sempre que a colônia atingir 90% de confluência. Após a semeadura nas placas tratadas com colágeno, o crescimento da primeira colônia é normalmente observado entre os dias cinco a nove.

As colônias continuam a crescer e a adquirir uma morfologia celular fusiforme nos estágios iniciais da cultura, que mais tarde progride para uma morfologia semelhante a paralelepípedos. O número total de células colhidas em cada passagem aumenta em correlação direta com o número total de dias em cultura. A análise de Western blot revela uma expressão precoce de CD 31 e CD 34 pelas células endoteliais cultivadas, que parece diminuir com a passagem subsequente.

A expressão do receptor dois do fator de crescimento endotelial vascular, no entanto, é mantida ao longo do tempo, embora em um nível de expressão ligeiramente inferior ao observado após a primeira passagem. É importante notar que as células progenitoras endoteliais não são positivas para o marcador de células mesenquimais actina do músculo liso alfa, ao contrário, por exemplo, dos lisados de células intersticiais valvulares, que podem ser incluídos como controle positivo. Todo o procedimento de isolamento pode ser concluído em menos de cinco horas, dependendo da unidade de sangue do cordão umbilical obtida.

Depois de isolar e semear as células mononucleares em meio de crescimento endotelial, geralmente leva entre cinco e nove dias para que as colônias de CPE apareçam na cultura. O método de isolamento proposto utiliza meios especializados para a cultura das células progenitoras endoteliais e evita o uso de citômetro de fluxo, no que diz respeito à necessidade de marcadores endoteliais. Este método também fornece um protocolo eficiente para a obtenção de grandes quantidades de células progenitoras endoteliais em um curto espaço de tempo.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar células progenitoras endoteliais de unidades de sangue do cordão umbilical humano. Não se esqueça de que o sangue do cordão umbilical humano pode ser perigoso e o descarte adequado de resíduos de sangue e produtos de cultura de células deve ser seguido.