Name: Um protocolo para hepatite C Analisando replicação de vírus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Aprenda a gerar RNA genômico do vírus da hepatite C e transfectar células para estudar replicação viral. Este protocolo viabiliza ensaios de titulação, Western blot e imunofluorescência em sistemas de cultura celular infecciosos.

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Agradecemos a F. Chisari por fornecer a linhagem celular Huh-7.5.1. Gostaríamos de agradecer a Justine Ho pela edição do manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Prêmio de Pesquisa Programática Institucional do Cedars-Sinai Medical Center e pelo Centro Nacional para o Avanço das Ciências Translacionais, Grant UL1TR000124 to V.A.

Um esboço geral do protocolo é ilustrada na Figura 1. 1. Células <ol><li> Preparar o meio de crescimento completo, que contém 10-15% de soro fetal bovino (FBS), 10 mM de aminoácidos não essenciais, 10 mM de Hepes, penicilina (100 unidades / ml), estreptomicina (100 mg / ml), e 2 mM de L-glutamina. </li><li> Manter Huh-7.5.1 células 13 em meios de cultura completos contendo os suplementos acima para análise in vitro do ciclo de replicação viral da hepatite C. </li><li> Culturas estirpes virais em células Huh-7.5.1 com o meio de crescimento suplementado especificado a 37 ° C com 5% de CO 2. </li></ol> 2. Vírus e plasmídeos As construções <ol><li> Gerar a forma complementar de ADN (ADNc) do ARN de HCV e cloná-lo num vector de plasmídeo para a facilidade da manipulação genética. Nota: A descoberta da hepatite fulminante japonês 1, JFH-1 (genótipo 2a HCV), isolar tem sido fundamental para a pesquisa de HCV e éusado principalmente para estudar o ciclo de replicação do HCV 11-13. Vírus quiméricos inter e intragenotypic baseados em JFH-1 HCV são comumente usados ​​em pesquisas 14-18. Construção de intragenotype 2a sintético vírus quimérico, FNX-HCV, e uma cepa repórter quimérico monocistrónicas foi descrito anteriormente 19 e construção detalhes estão fora do âmbito do presente protocolo. </li><li> Use o pFNX-HCV vírus intragenotype 2a vez que contém um 5 &#39;NTR, regiões e p7 estruturais e parte das regiões não-estruturais NS2 (nucleotídeos 1-2878) da J6CF cepa parental (NCBI adesão não. AF177036), como bem como os componentes não estruturais do vírus da estirpe JFH-1 (n ° de acesso NCBI. AB047639). Nota: FNX-HCV foi sintetizado com base na seqüência de Jc1 intragenotype 2a HCV quimérico relatado anteriormente 15. </li><li> Gerar um construto quimérico monocistrónicas repórter viral, o pFNX-Rluc, com base na estirpe pFNX-HCV (anteriormente no passo 2.2) através da inserção de um Rdo gene da luciferase enilla entre a NTR 5 &#39;e o gene núcleo (entre 388 e 389 nt). Posteriormente, ligar o gene da luciferase e gene núcleo dessa construção usando uma 2A vírus da febre aftosa (F2A) sequência peptídica, que funcionaria como um sinal de clivagem. </li><li> Engenheiro da construção viral RNA polimerase-null (Pol-) usando o pFNX-HCV ou o fundo viral pFNX-Rluc. Substitua os resíduos catalíticos NS5B polimerase, GDD (aa 2759-2761; nt 8615-8623), de qualquer um desses backbones virais com resíduos de ácido amino AAG. </li></ol> 3. In Vitro HCV RNA Transcrição <ol><li> Use uma intragenotype 2a vírus quimérico FNX-VHC e FNX-HCV Pol nula (Pol-) HCV para avaliação da replicação viral (Figura 2A). </li><li> Linearizar os plasmídeos virais com a enzima de restrição Xbal e, em seguida, tratar com nuclease de feijão mung para produzir extremidades cegas. Purificar os plasmídeos digeridos por cromatografia de troca aniônica. Verifique a integridade of o plasmídeo linearizado submetendo ADN de electroforese em gel de agarose (Figura 2B). </li><li> Transcrever os plasmídeos linearizados virais usando a polimerase T7 RNA. </li><li> Purifica-se o ARN tratado com ADNase recém-sintetizado utilizando um kit de purificação de RNA. </li><li> Verificar a produção de RNA por electroforese em gel de agarose (Figura 2C). </li><li> Quantificar o RNA por espectrofotometria. </li><li> Armazenar o ARN gerado em -80 ° C em aliquotas de 10 ug de trabalho. Nota: Para minimizar a variação da qualidade de ARN em cada desenho experimental transcrevendo todos RNA para cada amostra e de controlo virai, ao mesmo tempo. </li></ol> 4. HCV RNA transfecção e Coleta de Amostras <ol><li> Colher as células Huh-7.5.1 utilizando tripsina. </li><li> Para lavar as células, centrífuga e ressuspender a suspensão duas vezes com a mídia frio baixo soro. Ressuspender as células em meios de baixa no soro a 1 x 10 7 células por ml. </li><li> Misturar um total de 10 &amp; #956; g de ARN viral transcrito com 400 ul de células ressuspensas (4 x 10 6 células) numa cuvete de electroporação de 0,4 cm. Transfectar as células através de electroporação a 270 V, 100 Ω, e 950 uF. </li><li> Ressuspender as células electroporadas em 10 ml de meio de crescimento completo com 15% de FBS. Nota: O aumento da capacidade de sobrevivência das células electroporadas é visto quando as células Huh-7.5.1 foram cultivadas em 15% de soro fetal bovino. </li><li> Placa as células em ambos os frascos T-25 (1,2 x 10 ~ 6 células por frasco) e as placas de 48 poços (1 x 10 4 culas por po) para cada um dos seguintes pontos de tempo: 4, 48 e 96 horas. </li><li> Substitua a mídia a 4-8 horas após a transfecção com a mídia de crescimento suplementado fresco com 10% de FBS para remover restos de células mortas dos frascos de cultura e placas. </li><li> Os sobrenadantes de cultura de células da colheita nos 48 pontos de tempo, 96 h e remover os detritos celulares a partir de amostras recolhidas por centrifugação das células a 1500 rpm durante 10 min a 4 º C. </li><li> Armazenar os sobrenadantes isentos de células a -80 º C. Lisar as células de proteína e análise por Western blot de ARN e a transcrição reversa-PCR quantitativa em pontos de tempo indicados. </li></ol> 5. Transcrição reversa-PCR quantitativo (RT-qPCR) para a Avaliação Cópias HCV Genoma <ol><li> Realize uma de duas etapas RT-qPCR para determinar o número de cópias do genoma do HCV RNA. </li><li> Transcrever Reversa 1 ug de RNA celular total, utilizando a transcriptase reversa e um iniciador específico para a cadeia de sentido directo do HCV que se liga a 5 &#39;NTR (JFH RTQ R: 5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3&#39;) ou um primer específico para o gene doméstico peptidylprolyl isomerase de L (R PPIG : 5&#39;-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 &#39;). Também a transcrição reversa do RNA de HCV-FNX (gerado na Etapa 3) de cópias do genoma conhecidos (10 janeiro - 10 setembro padrão) usando sentido HCV cordão iniciador. </li><li> Realizar qPCR utilizando 50 ng do cDNA transcrito resultante usando primers específicos do HCV (JFH RTQF: 5&#39;CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3 &#39;) e DNA de ligação corante verde contendo qPCR de super mix. Realize qPCR para PPIG gene housekeeping, bem como (primers PPIG F: 5&#39;-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 &#39;; PPIG R: 5&#39;-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3&#39;) Nota: Para o cálculo nível RNA HCV intracelular preciso através de amostras, use gene housekeeping celular, PPIG , o nível de expressão (ciclo Ct) para normalização. Utilizar o número de cópias do genoma FNX-HCV, como o padrão para a determinação do número de cópias. </li><li> Use as seguintes condições durante a execução de qPCR para determinar o número de cópias de RNA do HCV: 95 º C por 15 segundos e 60 &#160; º C por 30 segundos (40 ciclos), utilizando sistema em tempo real PCR. </li><li> Ver Figuras 3A e 3B para resultados de replicação do genoma. </li></ol> 6. Ocidental análise de hibridação para detecção de expressão da proteína do VHC (figura 3C) <ol><li> Use lisatos celulares frRNA viral om transfectadas em 96 horas pós transfecção para a proteína análise Western blot. </li><li> Resolver o ligado celular utilizando SDS-PAGE e transferência de difluoreto de polivinilideno (PVDF) da membrana. </li><li> Bloquear a membrana com uma solução de bloqueio contendo 5% de leite desnatado, 0,2% de Tween 20 em tampão fosfato salino (PBS). </li><li> Incubar a membrana com anticorpo primário monoclonal NS3 (1 em 1000 de diluição) e da beta-actina (diluição de 1 em 5.000). </li><li> Adicionar cabra anti-IgG de ratinho conjugado com peroxidase de rábano (diluição de 1 em 5000) e detectadas por quimiluminescência. </li></ol> 7. Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) <ol><li> Fixar as células transfectadas e infectadas por HCV utilizando metanol durante 30 min a -20 º C para o ensaio de imunofluorescência. </li><li> Lava-se a células com PBS três vezes, e bloquear com IFA tampão de bloqueio. </li><li> Use policlonal de coelho anti-NS5A principalmente anticorpo (gentilmente cedido pelo Dr. Dasgupta, UCLA) ou anticorpo monoclonal anti-DSRNA J2 anticorpo a uma diluição de 1:200 (1 ug / ml) e incubar durante 5 horas a durante a noite a 4 º C. </li><li> Lavar as células com PBS três vezes, após o anticorpo primário. </li><li> Adicionar cabra anti-IgG de coelho-488 de anticorpo secundário ou policlonal de cabra anti-IgG de ratinho-594 de anticorpo policlonal secundário numa diluição de 1:1000 (1 ug / ml) e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Lave as células com PBS três vezes e núcleos mancha usando corante Hoechst e vista usando microscópio de fluorescência (Figura 3D). </li></ol> 8. Titer medição Vírus <ol><li> Placa naive Huh-7.5.1 células em cerca de 3 x 3 10 células / poço usando uma placa de 96 poços. No dia seguinte, realizar diluições em série de 10 vezes de livre de células do sobrenadante da cultura colhida a partir de RNA de HCV transfectadas células usando a mídia de crescimento e inocular em triplicado para Huh-7.5.1 células. </li><li> Fix células em 72 horas pós-infecção, utilizando metanol (durante 30 min a -20 </sup&gt; º C) e immunostain para a proteína NS5A do HCV como indicado na secção 7. </li><li> Utilizar a diluição mais elevada para contar para os focos positivo NS5A e calcular o número médio de unidades formadoras de foco (UFF) por mililitro. Ver Figura 4 para o HCV título. </li></ol> 9. Renilla luciferase Ensaio para Viral Genome replicação e infectividade <ol><li> Para avaliar a replicação do genoma viral, a placa de HCV RNA electroporado-Huh-7.5.1 células em triplicado em placas de 48 poços (1 x 10 4 células / cavidade). </li><li> Lisar as células com 75 ul de tampão de lise passivo no 6 h, 48 h e 96 h pós-transfecção. </li><li> Rocha as placas suavemente durante 15 minutos à temperatura ambiente e armazenar a -80 ° C. </li><li> Para medir a actividade enzimática de luciferase de Renilla, descongelar o lisado de proteína e luciferase de Renilla reagentes de ensaio a temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 20 ul de lisado de proteína por cavidade de uma 96-wel<html> l placa luminescência branca e coloque a placa em um luminómetro. </li><li> Dispensar 100 l de Renilla luciferase reagente de ensaio (substrato celenterazina + buffer) por poço e depois de um atraso de 2 segundos pré-leitura; integrar a luz emitida durante 10 segundos. </li><li> Calcula-se a média eo desvio padrão para cada amostra a partir dos valores da luciferase de triplicados biológicos e submeter os dados para análise estatística (Figura 5). </li><li> Para avaliar a infectividade, inocular 500 mL de sobrenadante isento de células obtidas a partir de células transfectadas com ARN de HCV para os pontos de tempo indicados (48 hr e 96 hr), em triplicado, para naive Huh-7.5.1 células em placas de 48 poços. </li><li> Substituir o inoculo virai com 500 ul de meio fresco por po, depois de 6 horas pós-infecção. </li><li> Lise das células às 48 horas pós-infecção e sujeitas a ensaio de luciferase de Renilla como descritos nos passos 8,2-8,7 (Figura 5). </li></ol>itle &quot;&gt; 10 Análise Estatística. <ol><li> As barras de erro nos gráficos indicam os desvios padrão (SD). Os valores de p foram calculados pelo teste t não pareado. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Esta ilustração descreve um método para a análise do ciclo de replicação do vírus da hepatite C. HCV é um patógeno humano eo protocolo de biossegurança prescrito terá que ser rigorosamente seguidas. Sistemas de cultura de células de HCV infecciosas foram descritos anteriormente 11-13,16,17. Existem alguns pontos cruciais que implementamos quando seguindo o protocolo ilustrado. Primeiro, é de grande importância para uma boa qualidade de comprimento RNA genômico viral completo intacto para os estudos a jusante....

Vírus da hepatite C (HCV) causa cirrose e câncer de fígado. Ela afeta 170 milhões de pessoas em todo o mundo, com 350.000 pessoas morrem anualmente 1-3. O HCV é um vírus de cadeia positiva de ARN com um tamanho de genoma de 9,6 kb. O genoma do HCV é traduzido como uma única poliproteína de ~ 3000 resíduos de aminoácidos que é clivada proteoliticamente por diversas proteases celulares e virais em 10 polipéptidos. O HCV é o vírus protótipo do género Hepacivirus e pertence à família Flaviviridae 4. Após a exposição, o HCV estabelece a infecção crónica em 80% dos indivíduos. A infecção é geralmente assintomática e oportuna diagnóstico pode permitir a intervenção terapêutica para evitar a deterioração do fígado. O tratamento atual é de qualidade inferior e nenhuma vacina está disponível 5,6. A etiologia da hepatite C foi descrita pela primeira vez em 1989 7. Estudar a replicação do HCV é importante para a vacina contra a hepatite C e pesquisa de tratamento, mas que tinha sidolongo dificultada pela falta de um sistema de cultura de vírus eficiente. Um clone molecular de HCV foi demonstrado ser infeccioso em chimpanzés mediante inoculação intra-8. Subsequentemente, os replicões de HCV sub-genómicos foram descritas, o que permitiu a dissecar a fase de replicação do genoma viral em um sistema de cultura de células de 9,10. Descoberta de um VHC genótipo 2a isolar JFH-1 (Japanese fulminante da hepatite-1), capaz de infectar cultura de células abriu novos caminhos para a pesquisa a replicação do HCV 11-13. Genótipo 2a tensão JFH-1 baseada vírus quiméricos inter-e intra-genotípicas e do genótipo 1 do HCV sistemas de cultura infecciosas base também estão disponíveis 14-18. Temos utilizado com sucesso JFH-1 tensão e HCV intragenotype 2a vírus quimérico para obter o mapa de alta resolução de perfil funcional de domínios de proteínas e cis-atuantes elementos de RNA 19,20. De acordo com isto, aqui descrevemos um sistema de cultura eficaz utilizado rotineiramente que permiteestudando várias fases do ciclo de replicação do HCV e interação patógeno-hospedeiro. Apresentamos ensaios virológicos para avaliar replicação do genoma viral e infectividade de novo de intragenotype 2a HCV e HCV repórter baseado Renilla luciferase.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Águia modificada' s meio (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácido não essencial</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25025CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Medium de Soro Reduzido, sem Fenol Red</td><td>Life Technologies</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>Huh-7.5.1</td>O Instituto <td></td><td>de Pesquisa Scripps</td><td>A linhagem celular foi gentilmente fornecida pelo Dr. Francis Chisari ao Dr. Arumugaswami sob MTA executado entre o Instituto de Pesquisa Scripps e os Plasmídeos do Centro Médico Cedars-Sinai</td></tr><tr><td>(pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol nulo, pFNX-Rluc e pFNX-Rluc Pol nulo)&nbsp;</td>Centro <td></td><td>Médico Cedars-Sinai</td><td>Os plasmídeos HCV foram sintetizados pelo Dr. Arumugaswami usando oligonucleotídeos sobrepostos.</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease de feijão mungo</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>M0250S</td><td></td></tr><tr><td>T7 RiboMAX Express Sistema de Produção de RNA em Grande Escala</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta de Eletroporação (4 mm)</td> <td>Bioexpress</td><td>E-5010-4</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Sistema Total</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2660</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo monoclonal anti-dsRNA de camundongo J2&nbsp;</td><td>Inglês & Consultoria Científica Kft.</td><td></td><td></td>10010200</tr><tr><td>IgG anti-coelho de cabra Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-coelho de cabra Alexa Fluor 594</td><td>Life Technologies</td><td>A11020</td><td></td></tr><tr><td>Pacote de membrana PVDF</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0263</td><td></td></tr><tr><td>Bloqueador de grau de mata-borrão Leite em pó desnatado</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6404XTU</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6531XTU</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Hepatite C Vírus NS3 anticorpo [8 G-2]</td><td>Abcam</td><td>ab65407</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Hepatite C Vírus NS3 anticorpo [H23]</td><td>Abcam</td><td>ab13830</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-camundongo IgG conjugada com peroxidase de rábano (HRP)&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>Reagentes de Detecção de Blotting Prime Western da Amersham ECL&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>RPN2236</td><td></td></tr><tr><td>SUPERSCRIPT III RT&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18080085</td><td></td></tr><tr><td>SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX</td> Sistema de PCR em tempo real <td>Life Technologies</td><td>11744500</td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7</td><td></td><td></td> Kit de sistema de ensaio de luciferase Renilla <td></td></tr><tr><td></td><td>Promega</td><td>E2810</td><td></td></tr><tr><td>Sistema</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de detecção GloMax-Multi (Luminômetro)</td><td>Promega</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

um protocolo para hepatite c analisando replicação de vírus

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Vírus da Hepatite C (HCV) afeta 3% da população mundial e causa graves doenças do fígado, incluindo hepatite crônica, cirrose e carcinoma hepatocelular. O HCV é um vírus de ARN encapsulado pertencente à família Flaviviridae. O tratamento atual não é totalmente eficaz e causa efeitos colaterais adversos. Não há vacina HCV disponível. Assim, é necessário um esforço continuado para o desenvolvimento de uma vacina e terapia melhor. Um sistema de cultura de células de VHC é fundamental para o estudo de vários estágios de crescimento de HCV, incluindo a entrada do vírus, a replicação do genoma, as embalagens, e de saída. No processo agora apresentado, foi utilizado um vírus de tipo selvagem intragenotype 2a quimérico, FNX-HCV, e um vírus FNX-Rluc recombinante portador de um gene repórter de luciferase de Renilla para estudar a replicação do vírus. Uma linha de células de hepatoma humano (Huh-7 com base) foi utilizado para a transfecção in vitro do transcrito ARN genómico de HCV. Os sobrenadantes de cultura isentos de células, lisados ​​de proteína e tRNA otal foram colhidas em vários pontos de tempo pós-transfecção para avaliar o crescimento HCV. Estado de replicação do genoma do HCV foi avaliada por RT-PCR quantitativo e visualizar a presença de ARN de HCV de cadeia dupla. A expressão da proteína do VHC foi verificada por imunofluorescência blot e ensaios de Western utilizando anticorpos específicos para as proteínas do HCV NS3 e NS5A. RNA de HCV de células transfectadas divulgados partículas infecciosas em cultura sobrenadante e o título virai foi medido. Os ensaios de luciferase, foram utilizados para avaliar o nível de replicação e infecciosidade de HCV repórter. Em conclusão, nós apresentamos vários ensaios virológicos para caracterizar diferentes estágios do ciclo de replicação do HCV.

O vírus da hepatite C é um vírus de RNA. Assim, para fins de manipulação genética, o ADNc genómico do HCV foi clonado num vector de plasmídeo bacteriano. Uma sequência de promotor de polimerase de ARN T7 foi introduzida imediatamente antes da extremidade 5 &#39;do genoma do VHC. Um esquema geral de fluxo de trabalho de análise do HCV é apresentada na Figura 1. Para gerar o ARN genómico de HCV com precisão a extremidade 3 &#39;, o genoma do VHC que contém o plasmídeo é cortado com a enzima de restrição <...

O vírus da hepatite C (HCV) é um dos principais patógenos humanos que causa distúrbios hepáticos, incluindo cirrose e câncer. Um sistema de cultura de células infecciosas do HCV é essencial para entender o mecanismo molecular da replicação do HCV e desenvolver novas abordagens terapêuticas. Aqui descrevemos um protocolo para investigar vários estágios do ciclo de replicação do HCV.

Um protocolo para hepatite C Analisando replicação de vírus

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

O objetivo geral deste procedimento é investigar várias etapas do ciclo de replicação do vírus da hepatite C. Isso é realizado primeiramente gerando transcritos de RNA genômico do VHC a partir de construtos de plasmídeos do VHC linearizados. O segundo passo é transfectar as células com o RNA do VHC. Em seguida, as células são semeadas para diferentes pontos temporais e ensaios. O passo final é coletar o sobrenadante do cultivo celular para medir o título viral e colher as células transfectadas para obtenção de proteína e RNA. Por fim, são realizadas a reação em cadeia da polimerase após transcrição reversa, o Western blot, o ensaio de imunofluorescência e a determinação do título do VHC, demonstrando um sistema robusto de cultura celular infecciosa pelo VHC.A principal vantagem deste sistema de cultura celular de vírus da hepatite C infeccioso em comparação com o sistema de replicon de VHC é que permite investigar as etapas de entrada viral, montagem do virion e saída celular. Este protocolo pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da virologia da hepatite C, como a morfogênese do virion e a interação entre o patógeno e o hospedeiro. As implicações desta técnica estendem-se para o desenvolvimento de vacinas, pois permitem a caracterização de cepas virais atenuadas que podem ser avaliadas como candidatas potenciais a vacinas.Embora este método possa fornecer informações sobre o vírus da hepatite C, ele também pode ser aplicado a outros vírus de RNA da família Flaviviridae. Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão o desafio de gerar RNA genômico de alta qualidade do HCV. O estudo do ciclo completo de replicação do HCV tornou-se viável em cultura celular após a descoberta de um isolado japonês do genótipo 2A do HCV associado à hepatite fulminante. A demonstração visual do ensaio virológico é fundamental, pois o ensaio exigirá expertise em técnicas moleculares e celulares.Utilizando um vírus quimérico intra-genótipo 2A, F-N-X-H-C-V e F-N-X-H-C-V pol-null HCV para avaliação da replicação viral, linearize plasmídeos virais previamente gerados mediante digestão com a enzima de restrição XBA-um em um tubo de dois mililitros. Em seguida, trate os plasmídeos com nuclease de feijão-mungo para gerar extremidades rombas.Purifique os plasmídeos digeridos por cromatografia de troca aniônica. Verifique a integridade do plasmídeo linearizado submetendo o DNA à eletroforese em gel de agarose. Em seguida, adicione o molde de DNA do plasmídeo linearizado a um tubo de 0,2 mililitros contendo os componentes da reação da RNA polimerase T-sete para sintetizar transcritos de RNA genômico do VHC.Purifique o RNA recém-sintetizado tratado com DNase utilizando um kit de purificação de RNA. Em seguida, verifique a produção de RNA por eletroforese em gel de agarose. Após isso, quantifique o RNA por espectrofotometria.Desprenda as células aderentes baseadas em Huh-7 utilizando tratamento com enzima tripsina e colete as células em um tubo cônico de 50 mililitros. Duas centrifugações subsequentes seguidas de ressuspendimento do pellet celular em meio com baixo teor de soro frio. Após repetir a centrifugação, ressuspenda as células em meio com baixo teor de soro na concentração de um vezes 10 à sétima células por mililitro.Em seguida, misture um total de 10 microgramas de RNA viral transcrito com 400 microlitros de células re-suspensas em uma cubeta de eletroporação pré-resfriada de 0,4 centímetro. Introduza o RNA viral nas células utilizando eletroporação com 270 volts, 100 ohms e 950 microfarads. Ao final, re-suspenda as células eletroporadas em 10 mililitros de meio de crescimento completo com 15% de FBS. Neste ponto, plaque as células em frascos T25 com cerca de 1,2 vezes 10 à sexta células por frasco e em placas de 48 poços com uma vez 10 à quarta células por poço para os pontos temporais de 4, 48 e 96 horas. Substitua o meio entre quatro e oito horas pós-transfecção por meio de crescimento suplementado fresco com 10% de FBS para remover detritos de células mortas dos frascos e placas cultivados.Utilizando uma pipeta serológica, colete os sobrenadantes do cultivo celular nos pontos temporais de 48 e 96 horas em um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, remova os detritos celulares das amostras coletadas por centrifugação a 15.000 rpm durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, armazene os sobrenadantes livres de células a menos 80 graus Celsius.Lise as células para análise de proteínas e RNA por meio de western blot e PCR quantitativa com transcriptase reversa ou RT-qPCR nos pontos de tempo indicados. Transcreva reversamente um micrograma de RNA celular total utilizando a enzima transcriptase reversa e um iniciador específico para a fita sentido do VHC que se liga à região não traduzida do extremo cinco primo em um tubo de 0,2 mililitro. Também realize a transcrição reversa do F-N-X-H-C-V-R-N-A com número conhecido de cópias genômicas utilizando um iniciador da fita sentido do VHC. Utilizando um sistema de PCR em tempo real, realize a qPCR empregando 50 nanogramas do cDNA transcrito resultante, com emprego de iniciadores específicos para o VHC e corante verde intercalante de DNA contido na mistura super qPCR. Utilize as seguintes condições ao executar a qPCR para determinar o número de cópias do R-N-A do V-H-C. Após a qPCR, resolva o lisado celular proveniente da transfeção com RNA viral em 96 horas pós-transfeção utilizando eletroforese SDS-PAGE. Em seguida, transfira as proteínas resolvidas no gel para uma membrana de difluoreto de polivinilideno pelo método trans-blot turbo. Bloqueie a membrana utilizando uma solução bloqueadora contendo leite desnatado a 5% e tween-20 a 0,2% em PBS e coloque em um recipiente.Incube a membrana com o anticorpo primário monoclonal de camundongo NS3 em uma diluição de um para 1000 e beta-actina em uma diluição de um para 5.000, em uma câmara fria a quatro graus Celsius. Após a incubação, adicione imunoglobulina-G de cabra anti-camundongo conjugada à peroxidase de rábano-picante em uma diluição de um para 5.000 e detecte por quimioluminescência.Neste momento, fixe as células transfectadas com H-C-V-R-N-A usando metanol por 30 minutos a 20 graus negativos Celsius para o ensaio de imunofluorescência. Ao finalizar, lave as células com PBS três vezes. Após o bloqueio com tampão de bloqueio para ensaio de imunofluorescência, use o anticorpo primário coelho policlonal anti-NS5A e o anticorpo primário monoclonal de camundongo anti-DSRNA J2 na diluição de 1:200 e incube por cinco horas até a noite em câmara fria a quatro graus Celsius. Após a incubação, lave as células com PBS três vezes após a aplicação do anticorpo primário. Em seguida, adicione o anticorpo secundário policlonal de cabra anti-imunoglobulina-G 488 e o anticorpo secundário policlonal de cabra anti-imunoglobulina de camundongo 594 na diluição de 1:1000 e incube por uma hora à temperatura ambiente em um agitador de bancada. Após lavar as células com PBS três vezes, contra-estaine os núcleos usando corante Hoechst e visualize utilizando um microscópio de fluorescência. Plaque em seguida células Huh7.5.1 ingênuas na densidade de aproximadamente três vezes 10 elevado a três células por poço, utilizando uma placa de 96 poços. No dia seguinte, realize uma diluição seriada decimal do sobrenadante de cultura livre de células, colhido de células transfectadas com R-N-A do V-H-C, usando meio de crescimento, e inocule em triplicata sobre células Huh7.5.1. Fixe as células 72 horas após a infecção utilizando metanol por 30 minutos a 20 graus Celsius negativos. Após remover as células do congelador, realize a coloração imunofluorescente para a proteína NS5A do V-H-C nas condições previamente descritas. Utilizando um microscópio fluorescente, conte os focos celulares positivos para NS5A no poço com a maior diluição viral e calcule o número médio de unidades formadoras de foco por mililitro.A qualidade do plasmídeo linearizado do VHC foi avaliada por eletroforese em gel. O DNA do VHC foi submetido à transcrição reversa in vitro mediada pela RNA polimerase T7, o que gerou um único produto de RNA com 9,6 quilobases. Os resultados de RT-qPCR indicaram que o vírus selvagem replicou o genoma de forma eficiente. O tipo selvagem exibiu um nível de replicação do genoma de um a três logaritmos mais alto em comparação com o vírus pol-nulo.O vírus selvagem produziu a proteína NS3 envolvida na clivagem de proteínas virais e na replicação do genoma. O vírus selvagem também expressou a proteína NS5A, e a proteína NS5A e o RNA de dupla fita co-localizaram-se no citoplasma celular de células transfectadas com o tipo selvagem, sugerindo replicação viral ativa. Medições do título viral indicaram que o vírus selvagem é infeccioso e produz mais de 10.000 unidades formadoras de focos por mililitro de partículas infecciosas. Seis horas após a transfeção, tanto o vírus selvagem quanto o vírus pol-nulo apresentaram atividades semelhantes de luciferase, indicando um nível semelhante de entrada de RNA transfectado traduzido. No entanto, 48 e 96 horas após a transfeção, o vírus selvagem exibiu níveis aumentados de replicação do genoma em comparação com o vírus pol-nulo. O vírus selvagem também produziu a proteína viral NS3. O vírus pol-nulo apresentou atividade de luciferase em nível basal, enquanto o vírus selvagem apresentou um nível de replicação duas a três vezes maior em escala logarítmica em comparação com o vírus repórter pol-nulo. Uma vez dominados, os ensaios virológicos para hepatite C podem ser realizados em duas semanas, se forem executados corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante utilizar células robustas e transcritos de RNA genômico de HCV de alta qualidade. Após este procedimento, cepas caracterizadas de HCV podem ser testadas em sistemas de modelos animais para investigar a aptidão in vivo e as interações entre o hospedeiro e o patógeno.O desenvolvimento de um sistema de cultura celular infeccioso para o HCV abriu caminho para que pesquisadores explorassem os passos da morfogênese do virion e da saída viral no ciclo de replicação do HCV. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar diversos ensaios virológicos para caracterizar diferentes estágios do ciclo de replicação do vírus da hepatite C. Não se esqueça de que trabalhar com o vírus da hepatite C pode ser extremamente perigoso e que precauções de segurança, como o uso de equipamentos de proteção individual apropriados, devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Dois métodos de formação de heterocários Descobrir Fatores de restrição HCV

Source: Allaire, A., et al. Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus. J. Vis. Exp. (2015).The video demonstrates the procedure for preparing cells to assess the intracellular uptake and activity of an antiviral agent against the hepatitis C virus.

Preparing Cells to Analyze Intracellular Uptake and Activity of an Antiviral Agent

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates the procedure for quantifying Hepatitis C viral RNA using quantitative reverse transcription PCR to measure viral load in infected cell cultures.

Measuring Hepatitis C Viral Load Using Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates an immunofluorescence-based method to detect Hepatitis C virus replication in infected hepatoma cells. The protocol involves cell fixation, antibody staining for viral protein and double-stranded RNA, and visualization using fluorophore-tagged secondary antibodies. Dual signal detection under a fluorescence microscope confirms active viral replication within the host cells.

Immunofluorescence Assay to Detect Hepatitis C Virus Replication Complexes in Infected Cells

Este vídeo demonstra um ensaio de fixação viral para triagem de compostos antivirais. Usando o vírus da hepatite C geneticamente modificado e a luciferase, ele avalia os efeitos inibitórios na fixação viral, conforme indicado pela menor intensidade de luz em poços co-tratados em comparação com poços tratados apenas com o vírus.

Um ensaio de fixação viral para triagem de compostos antivirais

Este vídeo demonstra um ensaio para avaliar agentes antivirais que visam etapas específicas da entrada viral nas células hospedeiras e fusão com o endossomo. As células são incubadas a baixa temperatura e depois infectadas com HCV. A baixa temperatura permite a ligação viral às células hospedeiras, mas inibe a internalização via endocitose. O composto antiviral de teste é adicionado e as células são incubadas à temperatura fisiológica. Essa mudança para uma temperatura mais alta facilita a...

Um ensaio para avaliar o efeito dos compostos de teste na entrada e fusão viral em células hospedeiras

Descrevemos aqui um vírus da hepatite B recentemente desenvolvido sistema de repórter (HBV) para monitorar as fases iniciais do ciclo de vida do HBV. Este simplificado sistema in vitro irá ajudar no rastreio de agentes anti-HBV, utilizando uma estratégia de alto rendimento.

Desenvolvimento de um Sistema Reporter vírus da hepatite B de acompanhar as fases iniciais do ciclo de replicação

gotículas lipídicas são organelos importantes para a replicação de vários agentes patogénicos, incluindo o vírus da hepatite C (HCV). Descreve-se um método para isolar gotículas lipídicas para a espectrometria de massa quantitativa de proteínas associadas; ele pode ser utilizado sob uma variedade de condições, tais como infecção por vírus, stress ambiental, ou tratamento com droga.

Isolamento de gotículas de gordura para análise quantitativa Espectrometria de Massa

Descrevemos aqui a in vitro geração de HBV DNA através de um sistema de infecção de vírus de hepatite B e a detecção altamente sensível de sua integração (1 – 2 cópias) usando o inverso nested PCR.

Deteção de cópia baixa número de DNA Viral integrado formado por In Vitro infecção de hepatite B

O objetivo do presente protocolo é fornecer um guia passo a passo para realizar experiências em 3-d "fígado-on-a-chip" infecção com o vírus da hepatite B.

"Fígado-on-a-Chip" culturas de hepatócitos primários e células de Kupffer para infecção pelo vírus da hepatite B

O protocolo descreve um método para introduzir diversidade genética controlável no genoma do vírus da hepatite C combinando síntese completa de RNA mutante usando PCR propenso a erros e genética reversa. O método fornece um modelo para seleção de fenótipos e pode ser usado para genomas de vírus de RNA de sentido positivo de 10 kb longos.

Genética reversa para projetar variantes do vírus de RNA de sentido positivo

Aprenda a gerar RNA genômico do vírus da hepatite C e transfectar células para estudar replicação viral. Este protocolo viabiliza ensaios de titulação, Western blot e imunofluorescência em sistemas de cultura celular infecciosos.

Um protocolo para hepatite C Analisando replicação de vírus

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