Um protocolo para hepatite C Analisando replicação de vírus

O objetivo geral deste procedimento é investigar vários estágios do ciclo de replicação do vírus da hepatite C. Isso é feito gerando primeiro RNA genômico HCV, transcritos de construções de plasmídeos HCV linearizados. O segundo passo é transfectar as células com H-C-V-R-N-A.

Em seguida, as células são revestidas para vários pontos de tempo e ensaios. A etapa final é coletar o sobrenadante da cultura de células para medir o título viral e colher células transfectadas para proteína e RNA. Em última análise, a transcrição reversa, o ensaio de imunofluorescência por Western blotting por PCR e o título de HCV são realizados e demonstram um sistema robusto de cultura de células infecciosas do HCV.

A principal vantagem deste sistema de cultura de células do vírus da hepatite C infecciosa sobre o sistema replicante do HCV é que as etapas de montagem e saída do víon de entrada viral podem ser investigadas. Este protocolo pode ajudar a responder às principais questões no campo da virologia da hepatite C, como Vion, morfogênese e interação hospedeiro de um patógeno. As implicações dessa técnica se estendem ao desenvolvimento de vacinas, pois permite a caracterização de cepas virais atenuadas que podem ser avaliadas como potenciais candidatas a vacinas.

Embora esse método possa fornecer informações sobre o vírus da hepatite C, ele também pode ser aplicado a outros vírus de RNA da família dos laboratórios verdes. Geralmente, os indivíduos novos neste método enfrentarão o desafio de gerar estudos de RNA genômico do HCV de alta qualidade. O ciclo completo de replicação do HCV tornou-se viável em cultura de células após a descoberta de um genótipo dois A HCV fulminante japonês Hepatite um isolado.

A demonstração visual do ensaio virológico é crítica porque o ensaio exigirá experiência em técnicas moleculares e celulares Usando um vírus quimérico intragenótipo dois, F-N-X-H-C-V e F-N-X-H-C-V poll null HCV para avaliação da replicação viral. Linearize plasmídeos virais gerados anteriormente por digestão com XBA uma enzima de restrição em um tubo de dois mililitros. Em seguida, trate os plasmídeos com nuclease de feijão mungo para gerar extremidades rombas.

Purificar os plasmídeos digeridos por cromatografia de troca aniônica. Verificar a integridade do plasmídeo linearizado submetendo o ADN a electroforese em gel AROS. Em seguida, adicione o molde de DNA de plasmídeo linearizado em um tubo de 0,2 mililitro contendo T sete componentes da reação da RNA polimerase para sintetizar transcritos de RNA genômico do HCV.

Purifique o RNA tratado com DNAs recém-sintetizados usando um kit de purificação de RNA. Em seguida, verifique a produção de RNA por eletroforese em gel Agros. Em seguida, quantifique o RNA por fotometria espectral.

Separe as células aderentes à base de HU sete usando o tratamento com enzima tripsina e colete as células em um cônico de 50 mililitros. Dois após a centrifugação resus. Suspenda o pellet celular com meio frio de soro baixo Depois de repetir a centrifugação, ressuspenda as células em meio de soro baixo de uma vez 10 a sete células por mililitro.

Em seguida, misture um total de 10 microgramas de RNA viral transcrito com 400 microlitros de células ressuspensas em um veterinário de eletroporação pré-resfriado de 0,4 centímetro para entregar o RNA viral nas células usando uma eletroporação a 270 volts, 100 ohms e 950 micro ferres. Quando terminar, ressuspenda as células eletroporosas em 10 mililitros de meio de crescimento completo com 15% FBS neste ponto, coloque as células em ambos os frascos T 25 em cerca de 1,2 vezes 10 elevado a seis células por frasco e 48 placas de poço em uma vez 10 elevado a quarto células por poço por 4, 48 e 96 horas. Substitua o meio quatro a oito horas após a transfecção por meio de crescimento suplementado fresco com 10% de FBS para remover os detritos de células mortas dos frascos e placas cultivados.

Com uma pipeta serológica, colher os sobrenadantes da cultura de células nos pontos de tempo de 48 N 96 horas para um tubo cónico de 15 mililitros. Em seguida, remova os detritos celulares das amostras coletadas por centrifugação a 15.000 RPM por 10 minutos a quatro graus Celsius após centrifugação. Armazene os sobrenadantes livres de células a 80 graus Celsius negativos.

Lyce as células para análise de proteínas e RNA por western blot e PCR quantitativo de transcrição reversa ou RTQPCR nos pontos de tempo indicados. Transcreva reversamente um micrograma de RNA celular total usando a enzima transcriptase reversa e um primer específico para a fita sensorial do HCV que se liga às cinco regiões principais não traduzidas em um tubo de 0,2 mililitro. Também transcreva inversamente F-N-X-H-H-C-V-R-N-A de cópias conhecidas do genoma usando um primer de fita sensorial HCV usando um sistema de PCR em tempo real.

Realize a QPCR usando 50 nanogramas do CD NA transcrito resultante usando primers específicos para HCV e corante verde de ligação ao DNA contendo supermistura de QPCR. Use as seguintes condições ao executar o QPCR para determinar o número de cópia do H-C-V-R-N-A após o QPCR. Resolva o lisado celular do RNA viral transfectado em 96 horas.

Pós-transfecção usando a página SDS. Em seguida, transferir as proteínas resolvidas no gel para uma membrana de poli videira di fluoreto pelo método turbo trans plot. Bloqueie a membrana usando uma solução de bloqueio contendo 5% de leite desnatado e 0,2% entre 20 em PBS e coloque em um recipiente.

Incubar a membrana com anticorpo monoclonal primário de camundongo e S3 em uma diluição de um em 1000 e beta actina em uma diluição de um em 5.000 em uma câmara fria de quatro graus Celsius. Após a incubação, adicione imunoglobulina G anti-camundongo de cabra conjugada à peroxidase de rabanete em uma diluição de um em 5.000 e detecte por quimioluminescência. Neste ponto, fixe as células transfectadas H-C-V-R-N-A usando metanol por 30 minutos a 20 graus Celsius negativos para o ensaio de imunofluorescência.

Quando terminar, lave as células com PB S3 vezes após o bloqueio com o ensaio de imunofluorescência, use anticorpo primário anti NS cinco policlonal de coelho e anticorpo monoclonal de camundongo anti DS RNA J dois em uma diluição de um a 200 e incube por cinco horas a durante a noite em uma câmara fria de quatro graus Celsius. Após a incubação, lave as células com PB S3 vezes após o anticorpo primário. Em seguida, adicione o anticorpo secundário policlonal antiglobulina G 4 8 8 de cabra e o anticorpo secundário policlonal de imunoglobulina 5 9 4 anti-musa de cabra em uma diluição de um em 1000 e incube por uma hora em temperatura ambiente em uma cadeira de balanço de mesa.

Após lavar as células com PB S3 vezes, corar os núcleos usando herx die e view usando um microscópio fluorescente. Próxima tonalidade ingênua da placa, 7,5 0,1 células em aproximadamente três vezes 10 elevado ao terço de células por poço. Usando uma placa de 96 poços no dia seguinte, realize uma diluição em série de dez vezes do sobrenadante de cultura livre de células colhidas de células transfectadas com H-C-V-R-N-A usando meio de crescimento e inocule em triplicado sobre a tonalidade.

7,5 0,1 células Fixe as células 72 horas após a infecção usando metanol por 30 minutos a 20 graus Celsius negativos após remover as células da coloração amino do freezer para a proteína H-C-V-N-S cinco A usando as condições descritas anteriormente usando um microscópio fluorescente. Conte os focos de células NS cinco, A positivos no poço com a maior diluição viral e calcule o número médio de unidades formadoras de foco por mililitro. A qualidade do plasmídeo HCV linearizado foi avaliada por eletroforese em gel.

O H-C-V-D-N-A foi submetido à transcrição in vitro mediada por T sete RNA polimerase, que produziu um único produto de RNA a 9,6 quilobases. R-T-Q-P-C-R Os resultados indicaram que o vírus do tipo selvagem replicou o genoma de forma eficiente. O tipo selvagem exibiu um nível de replicação do genoma de um a três log mais alto em comparação com o vírus poll null.

O vírus do tipo selvagem produziu a proteína NS três envolvida na clivagem da proteína viral e na replicação do genoma. O vírus do tipo selvagem também expressou a proteína NS cinco a e a proteína NS cinco a e RNA de fita dupla co-localizado no citoplasma celular de células transfectadas do tipo selvagem, sugerindo que as medições de título do vírus de replicação viral ativa indicaram que o vírus do tipo selvagem é infeccioso e produz mais de 10.000 focos formando unidades por mililitro de partícula infecciosa seis horas após a transfecção. Tanto o vírus do tipo selvagem quanto o pólo nulo tiveram atividades semelhantes de luciferase, indicando um nível de entrada semelhante de transfecto.

O RNA foi traduzido, no entanto, 48 horas e 96 horas após a transfecção. O vírus do tipo selvagem exibiu níveis aumentados de replicação do genoma em comparação com o vírus poll null. O vírus do tipo selvagem também produziu a proteína viral NS três.

O vírus poll null tinha atividade de luciferase de nível básico, enquanto o vírus do tipo selvagem tinha um nível de replicação de dois a três logs mais alto em comparação com o poll null reporter virus. Uma vez dominados, os ensaios virológicos de TC de hepatite podem ser feitos em duas semanas se forem realizados corretamente Ao tentar este procedimento, é importante ter células robustas e transcrições de RNA genômico do HCV de alta qualidade. Seguindo este procedimento, caracterizar cepas de HCV pode ser testado em sistemas de modelo animal para investigar a aptidão in vivo e as interações do patógeno hospedeiro.

O desenvolvimento de um sistema de cultura de células infecciosas do HCV abriu caminho para os pesquisadores explorarem as etapas de vírion, morfogênese e saída viral do ciclo de replicação do HCV. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar vários ensaios virológicos para caracterizar diferentes estágios do ciclo de replicação do vírus da hepatite C. Não se esqueça de que trabalhar com o vírus da hepatite C pode ser extremamente perigoso e, por precauções de segurança, como o uso de equipamentos de proteção individual adequados, deve sempre ser tomado durante a execução deste procedimento.