Métodos para facilitar o crescimento microbiano em fluxos de resíduos de fábricas de celulose e caracterização do potencial de biodegradação de micróbios cultivados

O objetivo geral do experimento a seguir é determinar a capacidade de um microrganismo ou consórcio de microrganismos de utilizar o licor negro residual de celulose para crescimento, os componentes do licor negro que estão sendo usados para o crescimento e os produtos produzidos pelo metabolismo microbiano desse resíduo de polpa. Isso é conseguido coletando o licor Black residual de polpação e preparando-o para uso como componente do meio de cultura. Como segunda etapa, são extraídos componentes lignocelulósicos, que são usados para determinar as necessidades de fonte de carbono dos microrganismos.

Em seguida, os meios são preparados, inoculados e analisados quanto ao crescimento microbiano, a fim de determinar a capacidade dos microrganismos de crescer no licor negro e seus componentes. Os resultados mostram a utilização do licor negro como única fonte de carbono para o crescimento e síntese de produtos metabólicos pelo isolado ambiental microbiano com base em seu crescimento visualizado em placas de ágar de meio mínimo e por GCMS. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando estávamos discutindo a possibilidade de micróbios crescerem em resíduos de celulose e que poderíamos isolar esses micróbios diretamente de uma fábrica de celulose.

A principal vantagem da técnica de extração de celulose zignal sobre o método existente hoje, como o branqueamento por hidróxido de sódio, é que o branqueamento com cloreto de sódio oferece alta e maior pureza. A demonstração visual desse método é crítica. Como as etapas de preparação de amostras de celulose Theo e GCMS são difíceis de aprender, e isso se deve ao número de etapas necessárias e à determinação visual necessária para verificar a conclusão do processo.

Este método não só pode fornecer informações sobre a degradação microbiana do licor negro, mas também pode ser aplicado a fluxos de resíduos industriais contendo materiais de celulose Magno, como resíduos de culturas, resíduos florestais e resíduos sólidos urbanos. Para iniciar este procedimento, colete a amostra de licor negro da válvula de saída conectada ao digestor artesanal e a uma garrafa de vidro estéril e deixe-a esfriar até a temperatura ambiente antes de prosseguir para a próxima etapa. Em seguida, adicione 100 mililitros da amostra de licor preto a um copo de 500 mililitros equipado com uma barra de agitação e agite a amostra em velocidade média.

Neutralize o licor negro adicionando ácido fosfórico gota a gota até que se torne viscoso. Seguindo esta alíquota toda a solução de licor preto em tubos cônicos de 50 mililitros e centrifugue as amostras a 9.300 Gs por 30 minutos. Para separar os carboidratos, coloque cinco gramas de switchgrass moído de um milímetro ou menor e uma barra de agitação em um frasco de 500 mililitros.

Em seguida, adicione 200 mililitros de água destilada, 7,5 gramas de clorito de sódio e 2,5 mililitros de ácido acético glacial. Coloque o frasco em um banho de óleo colocado em cima de uma placa de agitação a 80 graus Celsius por uma hora. Em seguida, adicione mais 7,5 gramas de cloreto de sódio e 2,5 mililitros de ácido acético glacial ao frasco.

Continue mexendo a 80 graus Celsius por 30 minutos depois de repetir a etapa anterior duas vezes. Deixe a solução esfriar até a temperatura ambiente. Em seguida, filtre-o através de um funil de buchner sob vácuo para isolar o material sólido.

Lave o material sólido três vezes com 100 mililitros de água destilada. Em seguida, colete um grama do material sólido e coloque-o em uma folha limpa de papel de filtro. Coloque o sólido a 50 graus Celsius para secar durante a noite.

Depois de remover a amostra do forno no dia seguinte, transfira-a para um frasco de armazenamento rotulado como célula oca. Adicione o material sólido restante a um balão de 500 mililitros contendo 250 mililitros de hidróxido de sódio a 10% e tampe o frasco com a rolha. Colocar a solução numa incubadora a 70 graus Celsius durante uma hora com agitação a 250 RPM.

Em seguida, deixe a solução esfriar até a temperatura ambiente Após 30 minutos, isole o material sólido por meio de filtração a vácuo usando um funil de buchner. Depois que o resíduo sólido for seco durante a noite em um forno a 50 graus Celsius, coloque-o em um frasco de armazenamento rotulado como celulose. Transferir o filtrado para um balão de 500 mililitros e adicionar 30 mililitros de ácido acético e 250 mililitros de cápsula de álcool isopropílico e colocar a solução resultante na bancada durante pelo menos oito horas à temperatura ambiente.

Quando terminar, transfira toda a solução para tubos cônicos de 50 mililitros e centrifugue a amostra a 9.300 Gs por 30 minutos. Após a centrifugação, pipetar cuidadosamente a solução para fora dos tubos cónicos e eliminar. Em seguida, lave os pellets com 30 mililitros de água destilada por vórtice e centrifugue a 9.300 Gs por 30 minutos.

Repita esta etapa 15 vezes para lavar bem o pellet. Após a centrifugação, remova o sobrenadante para isolar o pellet para liofilização. Depois que a amostra for liofilizada, coloque-a em um frasco rotulado com hemicelulose.

Para a separação da lignina, adicione cinco gramas de switchgrass moído de um milímetro ou menor a uma solução de 500 mililitros de hidróxido de sódio molar ponto 25 e etanol a 30%. Coloque a pasta em uma incubadora a 75 graus Celsius com agitação a 250 RPM por duas horas. Depois de filtrar a solução fria, adicione uma barra de agitação ao frasco e coloque-a em cima de uma placa de agitação ajustada para velocidade média.

Adicionar ácido clorídrico concentrado gota a gota ao filtrado até obter um pH de dois. Deixe a solução descansar durante a noite em temperatura ambiente. Uma vez transferida a solução para tubos cónicos de 50 mililitros, centrifugar as amostras a 9 300 GS durante 30 minutos.

Quando terminar, pipete cuidadosamente a solução para fora do tubo cônico e descarte. Lave o pellet com 30 mililitros de água destilada por vórtice e centrifugue a 9.300 Gs por 30 minutos. Repita esta etapa 15 vezes para lavar bem o pellet.

Após a centrifugação, remova o nadante supino para isolar o pellet para liofilização. Depois de liofilizado, coloque a amostra em um frasco rotulado com lignina. Adicione 50 mililitros de meio mínimo M nine estéril a um frasco estéril de 125 mililitros.

Em seguida, adicione 10% em volume do licor negro à mídia. Para inoculação, adicione 0,1% em volume de uma cultura bacteriana durante a noite à mistura, incube as culturas a 37 graus Celsius em uma incubadora com agitação a 200 RPM. Na fase logarítmica intermediária, transferir as bactérias para um frasco de soro anaeróbio estéril selado usando uma seringa após a centrifugação das culturas bacterianas inoculadas e inoculadas pela ONU.

Após 450 horas de crescimento, adicione 10 mililitros de cada sobrenadante em tubos de ensaio de vidro separados. Acidifique cada sobrenadante com ácido clorídrico concentrado adicionado gota a gota a pH um a dois. Para cada amostra, adicionar 30 mililitros de acetato de etilo ao supra nadante.

Depois de tampar o tubo de ensaio, misture a solução invertendo o tubo quatro a seis vezes. Em seguida, coloque um a dois gramas de sulfato de sódio anidro em um tubo de ensaio de vidro limpo. Colete cuidadosamente a camada orgânica superior pipetando com a pipeta de pastagem de vidro descartável.

Coloque a camada orgânica no tubo de ensaio contendo o sulfato de sódio anidro. Desidrate a camada orgânica sobre sulfato de sódio anidro batendo suavemente no tubo de ensaio para misturar gradualmente. Adicione pequenas quantidades de sulfato de sódio anidro e misture até que não haja grandes aglomerados.

Em seguida, filtrar a solução através de um funil de buchner sob vácuo, transferir a solução para um balão de evaporação e evaporar o filtrado por meio de um evaporador rotativo. Quando terminar, coloque três miligramas dos resíduos de extração de acetato de etilo em um frasco para cromatografia âmbar de dois mililitros. Dissolva o resíduo com 100 microlitros de quatro dioxanos e 10 microlitros de piridina.

Em seguida, adicione 50 microlitros de uma solução de B-S-T-F-A com 1% de cloro trimetil ao frasco. Colocar a solução numa incubadora a 60 graus Celsius agitando durante 15 minutos. Analise a amostra por GCMS.

A coleta e modificação do licor negro gerado no processo de polpação artesanal será um, usar esse resíduo de polpação para determinar a capacidade de biodegradação de um único isolado bacteriano ou cultura mista. Aqui é mostrado o crescimento aeróbio medido pela densidade óptica de uma cepa ambiental cultivada em meio LB e meio LB suplementado com 10% de licor negro neutralizado. Esses resultados indicam que essa bactéria cresce na presença de licor negro.

O crescimento do isolado ambiental em meio LB é mais rápido do que quando cultivado na presença de licor negro, mas a densidade óptica começa a diminuir após 62 horas. Considerando que o crescimento do isolado ambiental microbiano na presença de licor negro continua a aumentar em densidade óptica até depois de 230 horas de crescimento. A curva de crescimento do isolado ambiental microbiano na presença de licor negro também retrata crescimento bifásico, o que sugere que o licor negro contém mais de uma fonte de carbono que pode ser utilizada pelo isolado ambiental microbiano, e que há uma preferência de utilização de nutrientes exibida pela bactéria.

Mais experimentos são necessários para determinar sua capacidade de utilizar licor negro para necessidades de crescimento. Pode-se também determinar o crescimento de uma bactéria em licor negro não neutralizado ou determinar o efeito do aumento das concentrações de licor negro no crescimento. Depois de demonstrar o crescimento do licor negro, pode-se determinar a utilização da fonte de carbono usando experimentos mínimos de crescimento do meio.

Substratos comerciais que compõem os componentes da lignocelulose podem ser usados como fontes de carbono no meio mínimo. O protocolo de extração de LIGNOCELULOSE apresentado aqui fornece um modelo para determinar os requisitos de crescimento da bactéria retratada Aqui está o crescimento do isolado microbiano ambiental em M nine. Ágar médio mínimo suplementado com cada componente da extração de lignocelulose.

A presença de colônias nas placas de ágar de meio mínimo indica a capacidade do isolado ambiental de degradar as colônias de holocelulose, celulose, hemicelulose e lignina presentes em M nove. Meios mínimos podem sugerir a capacidade do isolado ambiental de degradar ágar em vez de placas. Curvas mínimas de crescimento de meios para culturas líquidas também podem ser usadas para determinar a taxa específica de crescimento em cada fração de lignocelulose, de modo que o ágar, que poderia ser uma fonte potencial de carbono, não precise ser adicionado.

A análise de culturas bacterianas extraídas e derivadas de olhos por GCMS revela os produtos metabólicos produzidos. Aqui é mostrado o espectro GCMS de derivados TMS presentes na amostra não inoculada, o espectro de derivados TMS produzidos pelo isolado microbiano ambiental quando cultivado anaerobicamente e M nove, meio mínimo com 10% de licor negro não neutralizado é retratado aqui. A comparação dos dois espectros revela diferenças nos componentes presentes no meio, sugerindo a presença de produtos de fermentação e a degradação dos componentes do licor negro.

Um pico com tempo de retenção de 39,34 minutos apareceu na amostra inoculada. Um pico com um tempo de retenção de 21 vírgula 84 minutos aumentou na amostra inoculada. Um pico com um tempo de retenção de 25,79 diminuiu na amostra inoculada.

O espectro aqui apresentado é o do padrão guacamole, que foi utilizado para identificar o pico com tempo de retenção de 25,79 minutos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como determinar se um microrganismo ou um consórcio de microrganismos pode degradar o licor negro. Além disso, seguindo este protocolo, você pode usar outros métodos, como curvas de crescimento, para responder a perguntas adicionais sobre a taxa de crescimento de um microrganismo ou microrganismos em várias concentrações de licor negro ou componentes de extrato de celulose de ligon.