Name: Métodos para facilitar o crescimento microbiano em fluxos de resíduos de fábricas de celulose e caracterização do potencial de biodegradação de micróbios cultivados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-12T14:15:00.000+00:00
Duration: 16 min 33 s
Description: Aprenda métodos para cultivar microrganismos em licor negro de fábricas de celulose e caracterizar seu potencial de biodegradação usando cromatografia gasosa. Esta técnica auxilia na gestão sustentável de resíduos industriais.

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Gostaríamos de agradecer a Jim McMurray por fornecer o licor negro e ao Dr. David Tilotta e August Meng por sua ajuda com GC-MS. O apoio a Stephanie L. Mathews foi fornecido por uma bolsa de estudos do USDA National Needs Fellowship (número do prêmio 2010-38420-20399).

1. Coleta de Licor Negro e Preparação de Licor Negro para Culturas de Crescimento
<ol>
	<li>Colete uma amostra de licor preto da válvula de saída conectada ao digestor kraft em uma garrafa de vidro estéril e deixe-a esfriar até a temperatura ambiente antes de prosseguir com as seguintes etapas. 
	neutralização</li>
	<li>Adicionar 100 ml de amostra de licor negro a um copo de 500 ml equipado com um agitador.</li>
	<li>Coloque o copo em uma placa de agitação e ajuste a velocidade para média.</li>
	<li>Adicione lentamente gotas de ácido fosfórico até que o licor negro se torne viscoso (viscosidade semelhante ao glicerol).</li>
	<li>Alicote toda a solução de licor preto despejando lentamente em tubos cônicos de 50 ml e centrifugue a 9.300 x g por 30 min.</li>
	<li>Colocar o sobrenadante no copo e medir o pH com fitas de teste de pH. O pellet de lignina precipitada pode ser descartado e tratado como resíduo sólido não perigoso.</li>
	<li>Continue a adicionar ácido fosfórico e centrifugue a solução até que as tiras de pH indiquem um pH neutro do sobrenadante. 
	esterilização</li>
	<li>Passe a solução por um filtro de 0,22 μm para remover qualquer bactéria contaminante e coloque a solução filtrada em um recipiente estéril para armazenamento. Armazene em temperatura ambiente.</li>
</ol>
2. Extração de lignocelulose
Separação de carboidratos
<ol>
	<li>Colocar 5 g de switchgrass, pinheiro ou erva-bermuda (moídos a 1 mm ou a uma granulometria inferior) num erlenmeyer de 500 ml. Em seguida, adicione 200 ml de água destilada ou deionizada, 7,5 g de NaClO2, 2,5 ml de ácido acético glacial e uma barra de agitação ao frasco.</li>
	<li>Colocar o balão num banho de óleo colocado em cima de uma placa de agitação a 80 °C durante 1 hora. Ajustar a velocidade da placa de agitação para média.</li>
	<li>Adicionar ao balão mais 7,5 g de NaClO2 e 2,5 ml de ácido acético glacial. Continue mexendo a 80 °C no banho de óleo por 30 min.</li>
	<li>Repita o passo anterior 2x (Nota: um total de 30 g de NaClO2 e 10 ml de ácido acético glacial são adicionados ao frasco contendo a biomassa lignocelulósica). Resfrie a solução à temperatura ambiente.</li>
	<li>Coloque uma folha de papel de filtro em um funil Büchner. Coloque o funil em cima de um frasco de braço lateral e conecte-o a um aspirador.</li>
	<li>Despeje lentamente a solução no funil.</li>
	<li>Lave o material sólido 3x com 100 ml de água destilada ou deionizada. Descarte o filtrado após lavar o material sólido.</li>
	<li>Reserve 1 g do material sólido e coloque-o sobre uma folha limpa de papel de filtro.</li>
	<li>Seque este material sólido durante a noite em um forno a 50 °C. Depois de retirar a amostra da estufa, coloque num frasco para injetáveis de armazenamento rotulado como 'holocelulose'.</li>
	<li>Adicionar o material sólido restante a 250 ml de NaOH a 10% (v/v) num erlenmeyer de 500 ml. Tampar o balão com uma rolha.</li>
	<li>Colocar a solução numa estufa a 70 °C durante 1 hora agitando a 250 rpm.</li>
	<li>Arrefecer a solução durante 30 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Remover o material sólido com papel de filtro e funil de Büchner fixado a um balão de braço lateral.</li>
	<li>Transferir o material sólido para uma folha limpa de papel de filtro para uma estufa a 50 °C e deixar secar durante a noite.</li>
	<li>Depois de o resíduo ter secado, coloque-o num frasco de armazenamento e rotule-o como "celulose".</li>
	<li>Transferir o filtrado do passo 2.13 para um erlenmeyer de 500 ml e adicionar 30 ml de ácido acético e 250 ml de álcool isopropílico. Tampe o frasco e coloque a solução na bancada por pelo menos 8 horas à temperatura ambiente.</li>
	<li>Transfira toda a solução para tubos cônicos de 50 ml e centrifugue a solução a 9.300 x g por 30 min. Pipete cuidadosamente a solução para fora do tubo cônico e descarte.</li>
	<li>Ressuspender o pellet em 30 ml de água destilada ou desionizada por vórtice.</li>
	<li>Repita as etapas 2.17-2.18 15x para lavar bem o pellet.</li>
	<li>Remova o sobrenadante e guarde o pellet para liofilização. Depois de liofilizada, colete a amostra e coloque-a em um frasco rotulado como 'hemicelulose'. 
	Separação de lignina 
	Protocolo de separação de lignina baseado em Karaaslan et al. 12</li>
	<li>Adicionar 5 g de switchgrass, pinheiro ou erva-bermuda (moída a 1 mm ou a um tamanho de partícula inferior) a 500 ml de uma solução de NaOH 0,25 M e etanol a 30%. Colocar o chorume numa incubadora a 75 °C com agitação a 250 rpm durante 2 horas.</li>
	<li>Resfrie a solução à temperatura ambiente.</li>
	<li>Colocar uma folha de papel de filtro num funil de Büchner em cima de um balão de braço lateral. Conecte a um aspirador e despeje lentamente a solução no funil.</li>
	<li>Descarte o material sólido.</li>
	<li>Adicionar um pé de agitação ao balão que contém o filtrado e colocar o balão sobre uma placa de agitação regulada para velocidade média. Adicionar ácido clorídrico concentrado gota a gota à solução até obter um pH de 2,0 (aproximadamente 20 ml).</li>
	<li>Deixe a solução acidificada descansar durante a noite em temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugue a solução a 9.300 x g por 30 min em tubos cônicos. Pipetar cuidadosamente a solução para fora do tubo cónico e eliminar.</li>
	<li>Ressuspender o pellet em 30 ml de água destilada ou desionizada por vórtice.</li>
	<li>Repita as etapas 2.27-2.28 15x para lavar bem o pellet.</li>
	<li>Após a centrifugação, remova o sobrenadante e guarde o pellet para liofilização. Depois de liofilizada, coloque a amostra em um frasco rotulado como 'lignina'.</li>
</ol>
3. Preparação de culturas de crescimento microbiano
Placas de ágar
<ol>
	<li>Adicione 0,2% (p / v) de produtos de extração de lignocelulose estéreis ao ágar M9 de meio mínimo13 antes de despejar as placas.</li>
	<li>Placas solidificadas com aproximadamente 200 ul de uma cultura bacteriana cultivada em meio mínimo M9 com um OD de aproximadamente 2,0.</li>
	<li>Incubar placas a 37 °C e monitorar o crescimento. 
	Culturas líquidas</li>
	<li>Adicionar 50 ml de meio Luria-Bertani (LB)13 ou M913 esterilizado a um balão esterilizado de 125 ml. Adicione licor negro a 10% (v/v) ou 0,2% (p/v) de produtos de extração de lignocelulose.</li>
	<li>Inocular o meio com 0,1% (v/v) de uma cultura bacteriana a uma diâmetro externo de aproximadamente 2,0.</li>
	<li>Incubar as culturas a 37 °C com agitação a 200 rpm.</li>
	<li>Avalie o crescimento a cada 6 horas durante o período de cultura medindo a densidade óptica (λ = 600 nm). Colocar uma alíquota de 1 ml da cultura numa cubeta. Determinar a densidade óptica da cultura em branco contra meios não inoculados.</li>
	<li>Transfira as bactérias para um frasco de soro anaeróbico no meio da fase logarítmica.
	<ol>
		<li>Para preparar o frasco de soro anaeróbico: feche o frasco de soro com uma rolha de borracha butílica e uma tampa de crimpagem de alumínio em condições aeróbicas e autoclave. Não modifique o espaço livre dentro do frasco de soro após a esterilização.</li>
		<li>Transferir toda a cultura de 50 ml do balão de 125 ml para o frasco de soro estéril selado, utilizando uma seringa.</li>
		<li>Incubar a 37 °C com agitação a 200 rpm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Preparação de amostras para GC-MS
Prepare amostras de acordo com Raj, Reddy e Chandra14. O controle negativo usado para comparação consiste em meio mínimo M9 com 10% de licor negro e também é chamado de amostra não inoculada.
<ol>
	<li>Centrifugar culturas bacterianas não inoculadas e inoculadas (50 ml) a 9.300 x g por 30 min após 450 horas de incubação.</li>
	<li>Transferir 10 ml do sobrenadante para um tubo de ensaio de vidro. (Observação: o plástico é incompatível com os produtos químicos nas etapas a seguir.)</li>
	<li>Acidifique o sobrenadante com HCl concentrado a pH 1-2.</li>
	<li>Adicione 3 volumes de acetato de etilo (30 ml), tampe o tubo e misture invertendo 4-6x.</li>
	<li>Coloque uma pequena quantidade de Na2SO4 anidro (1-2 g) em um tubo de ensaio de vidro limpo.</li>
	<li>Recolha cuidadosamente a camada orgânica (topo) da solução de acetato de etilo pipetando com uma pipeta Pasteur de vidro descartável.</li>
	<li>Coloque a camada orgânica no tubo de ensaio com Naanidro 2SO4.</li>
	<li>Desidrate a camada orgânica sobre Naanidro 2SO4 batendo suavemente no tubo de ensaio para misturar. Aos poucos, adicione pequenas quantidades de Naanidro 2SO4e misture até que não haja grandes aglomerados.</li>
	<li>Coloque uma folha de papel de filtro em um funil Büchner em cima de um balão de braço lateral preso a um aspirador.</li>
	<li>Despeje a solução no funil. Descarte o material sólido.</li>
	<li>Transferir a solução para um balão de evaporação e evaporar o filtrado utilizando um evaporador rotativo.</li>
	<li>Colocar 3 mg de resíduo de extracção de acetato de etilo num frasco para injetáveis de cromatografia âmbar de 2 ml.</li>
	<li>Dissolver o resíduo com a adição de 100 μl de 1,4-dioxano e 10 μl de piridina.</li>
	<li>Adicionar 50 μl de N,O-Bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida com trimetilcolorsilano 99:1% (BSTFA). Em seguida, coloque em uma incubadora a 60 °C com agitação por 15 min.</li>
	<li>Conservar as amostras a 4 °C até à utilização.</li>
</ol>
5. GC-MS
Equipar o cromatógrafo de fase gasosa (GC) com interface com um espectrómetro de massa (MS) com uma coluna capilar apolar e hélio como gás de arraste com um caudal de 1 ml/min.
<ol>
	<li>Depois de estabilizar a temperatura da estufa a 50 °C, injectar 1 μl da amostra com uma proporção de divisão de 1/50.</li>
	<li>Manter a coluna a 50 °C durante 5 min e aumentar para 280 °C a 5 °C/min. Manter a temperatura final de 280 °C durante 20 min.</li>
	<li>Manter a linha de transferência entre o cromatógrafo de fase gasosa e o espectrómetro de massa a 300 °C.</li>
	<li>Selecione um atraso de solvente de 15 min.</li>
	<li>Registre os espectros de massa de ionização de elétrons entre a faixa de 10-500 (m / z) com energia eletrônica de 70 eV.</li>
	<li>Derivatizar e cromatógrafo padrão como acima. Identifique compostos comparando os tempos de retenção de padrões ou dados adquiridos no banco de dados espectral de massa do National Institute of Standards and Technology (NIST).</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Este protocolo descreve uma combinação de técnicas que visa identificar microrganismos que podem degradar os resíduos de polpação, as fontes de carbono utilizadas durante o crescimento em resíduos de polpação e os produtos metabólicos microbianos produzidos quando cultivados em resíduos de polpa. Mostramos o sucesso deste protocolo com o isolado ambiental microbiano: um anaeróbio facultativo que pode crescer com 10% de licor negro e usar os componentes de extração de lignocelulose como únicas fontes de carbono para o cre...

A polpação de madeira é um processo quimicamente intensivo que foi otimizado ao longo de muitos anos para criar um sistema com o mínimo de desperdício. No entanto, alguns resultados desse processo podem ser usados para produzir produtos de maior valor. O licor negro é um exemplo. É gerado a partir do processo kraft, que é o método de polpação química dominante, representando 85% da produção mundial de lignina1. O processo kraft (Figura 1) utiliza temperatura (160-200 °C), pressão (120 psig) e os produtos químicos contidos no licor branco (hidróxido de sódio e sulfeto de sódio) para dissolver a lignina das fibras de madeira2,3. O licor negro contém lignina, ácidos orgânicos e subprodutos de degradação de polissacarídeos4. É incinerado para produzir vapor e recuperar produtos químicos na caldeira de recuperação que fornece energia térmica para os processos de fabricação e polpação de papel a jusante. O volume de licor negro gerado pela polpação pode exceder a quantidade que a caldeira de recuperação pode processar efetivamente. Descartar o licor negro como efluente afeta negativamente a flora e a fauna aquáticas e, portanto, não é uma opção. A aplicação de organismos microbianos que poderiam usar licor negro para crescimento seria benéfica em termos de aumento da recuperação química e geração de produto(s) de valor agregado que melhoraria a análise geral do ciclo de vida do sistema de polpação. A conversão química e biológica de monômeros derivados de lignina produziu com sucesso vanilina e ácido cinâmico para uso como adoçantes alimentares e aditivos de fragrâncias, fenol usado para plásticos e resinas e ciclohexano, que poderia ser usado como combustível5.
Trabalhos anteriores sobre biodegradação desse resíduo de celulose foram focados na despolimerização de lignina. O Instituto Internacional de Lignina (ILI) relata que entre 40 e 50 milhões de toneladas de lignina são produzidas a cada ano (http://www.ili-lignin.com/aboutlignin.php). Apenas 1,5% dessa lignina é usada para processos industriais comerciais6. A despolimerização da lignina pelas enzimas lacase e peroxidase produzidas por fungos da podridão branca dos gêneros Phanerochaete e Trametes tem sido estudada longamente7. Bactérias do solo conhecidas por degradar compostos aromáticos como Nocardia e Rhodococcus8, Pseudomonas putida mt-29 e Streptomyces viridosporus T7A10 também demonstraram ser capazes de degradação da lignina. A degradação bacteriana dos resíduos de polpação é promissora porque algumas bactérias podem prosperar nas condições salinas e alcalinas (pH 10-14) que caracterizam os efluentes de resíduos de polpação11. Embora a lignina seja o principal componente do licor negro, os microrganismos também podem degradar os outros componentes que compõem o licor negro. Essas técnicas não identificam exclusivamente microrganismos degradadores de lignina, mas servem para identificar microrganismos que podem ser aplicados diretamente no licor negro residual de polpação, em vez de seus constituintes processados.
O licor preto foi coletado e modificado para crescimento microbiano por meio de neutralização e esterilização por filtro. Os requisitos de crescimento microbiano foram identificados para um isolado microbiano ambiental por experimentos de crescimento mínimo de meio em componentes lignocelulósicos produzidos por um novo protocolo de extração de lignocelulose. Os meios de crescimento foram analisados por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) para determinar os produtos metabólicos do isolado microbiano ambiental quando cultivado em licor negro como única fonte de carbono. A combinação dessas técnicas fornece uma ferramenta de avaliação para determinar a capacidade metabólica de um microrganismo quando cultivado em resíduos de fábricas de celulose, como o licor negro. O uso de tais técnicas também oferece informações sobre o valor da aplicação de microrganismos específicos aos resíduos da fábrica de celulose para a geração de subprodutos.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dioxano (Certificado ACS)</td> <td>Fisher</td><td>D111</td><td>Inflamável, químico pré-oxidável</td></tr><tr><td>Licor Negro</td><td>Departamento de Biomateriais Florestais da Universidade Estadual da Carolina do Norte</td><td>N / A</td><td>pH 12,72, 13,67% sólidos</td></tr><tr><td>Etanol (grau microbiológico)</td> <td>Fisher</td><td>BP2818</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de etila (grau de reagente ACS)</td> <td>EMD</td><td>EX0240-9</td><td>Inflamável</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial (ACS certificado)</td><td>EMD</td><td>AX0073</td><td>Guaiacol corrosivo</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>PHR1136</td><td>Nocivo por ingestão,</td></tr><tr><td>coluna capilar HP-5</td> corrosiva <td>Agilent</td><td>19091J-577</td><td>60 m x 0,18 mm de diâmetro interno, 0,18 &mu; m de espessura</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico (certificado ACS)</td><td>EMD</td><td>HX0603P</td><td></td></tr><tr><td>N,O-Bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida com trimetilclorosilano 99:1% (BSTFA)</td><td>Fluka</td><td>15238</td><td>Inflamável, causa queimaduras na pele e lesões oculares com contato</td></tr><tr><td>Na2SO4 (grau FCC)</td><td>VWR</td><td>BDH8026</td><td></td></tr><tr><td>NaClO2 (80%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>244155</td><td>Inflamável, tóxico&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>NaOH (certificado ACS)</td><td>EMD</td><td>1.06498.1000</td><td></td></tr><tr><td>Fitas de teste de pH Alkacid Corrosivo</td><td>Ácido</td> Fosfórico Fisher <td>A979</td><td></td></tr><tr><td>(certificado ACS)</td><td>Espectrômetro de massa Fisher</td><td>A242</td><td></td></tr><tr><td>Polaris Q&nbsp;</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piridina (99%)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12005</td><td>Inflamável, tóxico em contato com a pele</td></tr><tr><td>Switchgrass</td><td>Cherry Research Farm Goldsboro, NC</td><td>N/A</td><td>Colhido em agosto de 2011</td></tr><tr><td>Cromatógrafo de gás traço Thermo Finnigan</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman no. 1 papel de filtro</td><td>Whatman</td><td>1001-150</td><td></td></tr></tbody></table>

métodos para facilitar o crescimento microbiano em fluxos de resíduos de fábricas de celulose e caracterização do potencial de biodegradação de micróbios cultivados

Methods for Facilitating Microbial Growth on Pulp Mill Waste Streams and Characterization of the Biodegradation Potential of Cultured Microbes

O processo kraft é aplicado a lascas de madeira para separação de lignina dos polissacarídeos dentro da lignocelulose para celulose que produzirá um papel de alta qualidade. O licor negro é um resíduo de polpação gerado pelo processo kraft que tem potencial para bioconversão a jusante. No entanto, a natureza recalcitrante dos recursos de lignocelulose, seus derivados químicos que constituem a maior parte do carbono orgânico disponível no licor negro e seu pH básico apresentam desafios para a biodegradação microbiana desse resíduo. Os métodos de coleta e modificação do licor negro para o crescimento microbiano visam a utilização desse resíduo de celulose para converter a lignina, os ácidos orgânicos e os subprodutos da degradação de polissacarídeos em produtos químicos valiosos. As técnicas de extração de lignocelulose apresentadas fornecem um método reprodutível para a preparação de substratos de crescimento de lignocelulose para a compreensão das capacidades metabólicas de microrganismos cultivados. O uso de cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas permite a identificação e quantificação dos produtos de fermentação resultantes do crescimento de microrganismos nos resíduos de polpa. Esses métodos, quando usados em conjunto, podem facilitar a determinação da atividade metabólica de microrganismos com potencial para produzir produtos de fermentação que agregariam maior valor ao sistema de polpação e reduziriam o desperdício de efluentes, aumentando assim os lucros potenciais da moagem de papel e oferecendo usos adicionais para o licor negro.

A coleta e modificação do licor negro gerado no processo de polpação kraft (Figura 1) permitirá o uso desse resíduo da polpação para determinar a capacidade de biodegradação de um isolado bacteriano individual ou de uma cultura mista. A Figura 2 mostra o crescimento aeróbio medido pela densidade óptica do isolado microbiano ambiental cultivado em meio LB isoladamente e em meio LB suplementado com 10% de licor negro neutralizado. Esses resultados indicam que esta bactéria cresce na presen...

Os resíduos industriais podem ser coletados e modificados para analisar o crescimento microbiano. As técnicas de extração de lignocelulose fornecem componentes para analisar a capacidade específica de biodegradação. A cromatografia gasosa-espectrometria de massa identifica produtos de fermentação de microrganismos cultivados em resíduos de polpa. Esses métodos determinam a capacidade metabólica dos microrganismos de degradar os resíduos de polpa.

Métodos para facilitar o crescimento microbiano em fluxos de resíduos de fábricas de celulose e caracterização do potencial de biodegradação de micróbios cultivados

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high ...

O objetivo geral do experimento a seguir é determinar a capacidade de um microrganismo ou de um consórcio de microrganismos de utilizar o resíduo da polpação conhecido como Black Liquor (Liquor Negro) para crescimento, identificar os componentes do liquor negro que são utilizados para o crescimento e os produtos gerados pelo metabolismo microbiano desse resíduo da polpação. Isso é alcançado mediante a coleta do resíduo da polpação, o Black Liquor, e seu preparo para uso como componente de meio de cultura. Como segundo passo, são extraídos os componentes lignocelulósicos, os quais são utilizados para determinar os requisitos de fonte de carbono dos microrganismos.Em seguida, os meios são preparados, inoculados e analisados quanto ao crescimento microbiano, a fim de determinar a capacidade dos microrganismos de crescer sobre o licor negro e seus componentes. Os resultados demonstram a utilização do licor negro como única fonte de carbono para o crescimento e síntese de produtos metabólicos pelo isolado microbiano ambiental, com base no crescimento visualizado em placas de ágar com meio mínimo e por meio de GC-MS. Tivemos inicialmente a ideia deste método ao discutirmos a possibilidade de microrganismos serem capazes de crescer sobre resíduos da indústria de celulose e de que poderíamos isolar esses microrganismos diretamente de uma fábrica de celulose.A principal vantagem da técnica de extração de celulose zignal em comparação com os métodos existentes atualmente, como o branqueamento com hidróxido de sódio, é que o branqueamento com cloreto de sódio oferece alta e maior pureza. A demonstração visual deste método é fundamental, pois as etapas de preparação da celulose Theo e da amostra para CG-EM são difíceis de aprender, devido ao número de etapas necessárias e à determinação visual exigida para verificar a conclusão do processo.Este método não apenas pode fornecer informações sobre a degradação microbiana do licor negro, mas também pode ser aplicado a efluentes industriais contendo materiais de celulose Magno, como resíduos agrícolas, resíduos florestais e resíduos sólidos urbanos. Para iniciar este procedimento, colete a amostra de licor negro na válvula de saída acoplada ao digestor artesanal e em um frasco de vidro estéril, e deixe esfriar até a temperatura ambiente antes de prosseguir para a próxima etapa. Em seguida, adicione 100 mililitros da amostra de licor negro a um béquer de 500 mililitros equipado com um bastão de agitação e agite a amostra em velocidade média.Neutralize o licor negro adicionando ácido fosfórico gota a gota até que fique viscoso. Em seguida, transfira toda a solução de licor negro para tubos cónicos de 50 mililitros e centrifugue as amostras a 9.300 ×g durante 30 minutos. Para separar os hidratos de carbono, coloque cinco gramas de panicada-militaris moída com partículas de um milímetro ou menores e uma barra de agitação em um frasco de 500 mililitros.Em seguida, adicione 200 mililitros de água destilada, 7,5 gramas de clorito de sódio e 2,5 mililitros de ácido acético glacial. Coloque o frasco em banho-maria a óleo sobre uma placa de agitação a 80 graus Celsius por uma hora. Em seguida, adicione mais 7,5 gramas de cloreto de sódio e 2,5 mililitros de ácido acético glacial ao frasco.Continue agitando a 80 graus Celsius por 30 minutos após repetir o passo anterior duas vezes. Deixe a solução esfriar até a temperatura ambiente. Em seguida, filtre-a através de um funil de Büchner sob vácuo para isolar o material sólido.Lave o material sólido três vezes com 100 mililitros de água destilada. Em seguida, colete um grama do material sólido e coloque-o sobre uma folha limpa de papel de filtro. Deixe o material secar a 50 graus Celsius durante a noite.Após remover a amostra do forno no dia seguinte, transfira-a para um frasco de armazenamento rotulado como célula oca. Adicione o material sólido restante a um balão de 500 mililitros contendo 250 mililitros de hidróxido de sódio 10%, e tampe o balão com a rolha. Coloque a solução em um incubador a 70 graus Celsius por uma hora, sob agitação a 250 RPM.Em seguida, deixe a solução esfriar até a temperatura ambiente. Após 30 minutos, isole o material sólido por filtração a vácuo utilizando um funil de Büchner. Uma vez que o resíduo sólido tenha sido seco durante a noite em uma estufa a 50 graus Celsius, coloque-o em um frasco de armazenamento rotulado como celulose. Transfira o filtrado para um frasco de 500 mililitros e adicione 30 mililitros de ácido acético e 250 mililitros de álcool isopropílico, tampe e deixe a solução resultante sobre a bancada por pelo menos oito horas à temperatura ambiente.Quando terminado, transfira toda a solução para tubos cónicos de 50 mililitros e centrifugue a amostra a 9.300 ×g por 30 minutos. Após a centrifugação, pipete cuidadosamente a solução para fora dos tubos cónicos e descarte-a. Em seguida, lave os pellets com 30 mililitros de água destilada por vortex e centrifugue a 9.300 ×g por 30 minutos.Repita este passo 15 vezes para lavar completamente o pellet. Após a centrifugação, remova o sobrenadante para isolar o pellet e liofilizá-lo. Uma vez que a amostra tenha sido liofilizada, coloque-a em um frasco rotulado hemi celulose.Para a separação da lignina, adicione cinco gramas de capim-elefante moído com tamanho de partícula de um milímetro ou menor a uma solução de 500 mililitros de hidróxido de sódio 0,25 molar e etanol a 30%. Coloque a suspensão em um incubador a 75 graus Celsius com agitação a 250 rpm por duas horas. Após filtrar a solução resfriada, adicione uma barra de agitação ao frasco e coloque-o sobre uma placa de agitação ajustada para velocidade média.Adicione ácido clorídrico concentrado gota a gota ao filtrado até que um pH de dois seja atingido. Deixe a solução repousar durante a noite à temperatura ambiente. Após a transferência da solução para tubos cónicos de 50 mililitros, centrifugue as amostras a 9.300 ×g durante 30 minutos.Quando terminar, pipete cuidadosamente a solução para fora do tubo cônico e descarte. Lave o pellet com 30 mililitros de água destilada por meio de vortex e centrifugue a 9.300 ×g por 30 minutos. Repita este passo 15 vezes para lavar completamente o pellet.Após a centrifugação, remova o sobrenadante para isolar o pellet para liofilização. Uma vez liofilizado, coloque a amostra em um frasco rotulado como lignina. Adicione 50 mililitros de meio mínimo M nove estéril a um frasco estéril de 125 mililitros.Em seguida, adicione 10% em volume da licor negro ao meio. Para a inoculação, adicione 0,1% em volume de uma cultura bacteriana de crescimento noturno à mistura e incube as culturas a 37 graus Celsius em um incubador com agitação a 200 rpm. Na fase logarítmica média, transfira as bactérias para um frasco estéril selado e anaeróbio usando uma seringa, após a centrifugação das culturas bacterianas não inoculadas e inoculadas.Após 450 horas de crescimento, adicione 10 mililitros de cada sobrenadante em tubos de ensaio de vidro separados. Acidifique cada sobrenadante com ácido clorídrico concentrado adicionado gota a gota até pH de um a dois. Para cada amostra, adicione 30 mililitros de acetato de etila ao sobrenadante.Após tampar o tubo de ensaio, misture a solução invertendo o tubo de quatro a seis vezes. Em seguida, coloque um a dois gramas de sulfato de sódio anidro em um tubo de ensaio de vidro limpo. Colete cuidadosamente a camada orgânica superior pipetando com a pipeta de vidro descartável de Pasteur.Coloque a camada orgânica no tubo de ensaio contendo sulfato de sódio anidro. Desidrate a camada orgânica sobre sulfato de sódio anidro batendo suavemente no tubo de ensaio para misturar gradualmente. Adicione pequenas quantidades de sulfato de sódio anidro e misture até que não haja grandes aglomerados.Em seguida, filtre a solução através de um funil de Büchner sob vácuo, depois transfira a solução para um frasco de evaporação e evapore o filtrado utilizando um evaporador rotativo. Ao finalizar, coloque três miligramas dos resíduos da extração com acetato de etila em um vial de cromatografia âmbar de dois mililitros. Dissolva o resíduo com 100 microlitros de 1,4-dioxano e 10 microlitros de piridina.Em seguida, adicione 50 microlitros de uma solução de B-S-T-F-A com 1% de cloreto de trimetila ao vial. Incube a solução em banho-maria a 60 graus Celsius com agitação por 15 minutos. Analise a amostra por GCMS.A coleta e modificação do licor negro gerado no processo artesanal de polpação permitirá, em um primeiro momento, utilizar esse resíduo de polpação para determinar a capacidade de biodegradação de um isolado bacteriano único ou de uma cultura mista. Aqui são mostrados o crescimento aeróbio medido pela densidade óptica de uma linhagem ambiental cultivada em meio LB e em meio LB suplementado com 10% de licor negro neutralizado. Esses resultados indicam que esta bactéria cresce na presença de licor negro.O crescimento do isolado ambiental em meio LB é mais rápido do que quando cultivado na presença de licor negro, mas a densidade óptica começa a diminuir após 62 horas. Enquanto isso, o crescimento do isolado microbiano ambiental na presença de licor negro continua aumentando em densidade óptica até após 230 horas de crescimento. A curva de crescimento do isolado microbiano ambiental na presença de licor negro também mostra um crescimento bifásico, o que sugere que o licor negro contém mais de uma fonte de carbono que pode ser utilizada pelo isolado microbiano ambiental, e que existe uma preferência na utilização de nutrientes exibida pela bactéria.São necessários experimentos adicionais para determinar sua capacidade de utilizar licor negro para requisitos de crescimento. Pode-se também determinar o crescimento de uma bactéria em licor negro não neutralizado ou avaliar o efeito de concentrações aumentadas de licor negro sobre o crescimento. Após demonstrar o crescimento em licor negro, pode-se determinar a utilização de fontes de carbono utilizando experimentos de crescimento em meios mínimos.Substratos comerciais que compõem os componentes da lignocelulose podem ser usados como fontes de carbono em meios mínimos. O protocolo de extração de LIGNOCELLULOSE apresentado aqui fornece um modelo para determinar os requisitos de crescimento da bactéria ilustrada. Aqui está o crescimento do isolado microbiano ambiental em ágar M nove, meio mínimo suplementado com cada componente da extração de lignocelulose.A presença de colônias em placas de ágar com meio mínimo indica a capacidade do isolado ambiental de degradar holocelulose, celulose, hemicelulose e lignina. As colônias presentes no meio mínimo M nove podem sugerir a capacidade do isolado ambiental de degradar o ágar em vez das frações de lignocelulose. Curvas de crescimento em meio mínimo para culturas líquidas também podem ser utilizadas para determinar a taxa específica de crescimento em cada fração da lignocelulose, de modo que o ágar, que poderia ser uma fonte de carbono potencial, não precise ser adicionado.A análise por GCMS de extratos e derivados de olhos, bem como de culturas bacterianas, revela os produtos metabólicos produzidos. É mostrado aqui o espectro de GCMS dos derivados de TMS presentes na amostra não inoculada, bem como o espectro dos derivados de TMS produzidos pelo isolado microbiano ambiental quando cultivado anaerobicamente em meio mínimo M nove, contendo 10% de licor negro não neutralizado. A comparação dos dois espectros revela diferenças nos componentes presentes no meio, sugerindo a presença de produtos de fermentação e a degradação de componentes do licor negro.Um pico com tempo de retenção de 39,34 minutos apareceu na amostra inoculada. Um pico com tempo de retenção de 21,84 minutos aumentou na amostra inoculada. Um pico com tempo de retenção de 25,79 minutos diminuiu na amostra inoculada.O espectro mostrado aqui é o do padrão de guac, que foi utilizado para identificar o pico com um tempo de retenção de 25,79 minutos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como determinar se um microrganismo ou um consórcio de microrganismos pode degradar licor negro. Além disso, seguindo este protocolo, você pode utilizar outros métodos, como curvas de crescimento, para responder a questões adicionais sobre a taxa de crescimento de um microrganismo ou microrganismos em diversas concentrações de componentes do licor negro ou do extrato de lignocelulose.

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Research

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Environment

Ambiente

Métodos para Facilitar o Crescimento Microbiano em Fluxos de Resíduos de Usinas de Celulose e Caracterização do Potencial de Biodegradação de Micróbios Cultivados

Fonte: Villela, H. D. M. , et al. Prospectação de Cepas Microbianas para Biorremediação e Desenvolvimento de Probióticos para Pesquisa e Preservação de Metaorganismos. J. Vis. Exp. (2019).Este vídeo demonstra o isolamento de bactérias marinhas degradadoras de poluentes por diluição em série, seleção de colônias e crescimento em meio contendo EE2. Ao usar EE2 como única fonte de carbono, o protocolo identifica cepas bacterianas capazes de metabolizar esse poluente ambiental.

Triagem de Bactérias Marinhas para o Isolamento de Cepas Degradantes de Poluentes

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Isolamento e Triagem da Biodiversidade do Solo para Fungos Envolvidos na Degradação de Materiais Recalcitrantes

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