Caracterizando Microbiome dinâmica – citometria de fluxo com base em fluxos de trabalho de culturas puras de comunidades naturais

Este método pode ajudar a responder a questões-chave em ecologia microbiana e biotecnologia, por exemplo, quais conceitos ecológicos impulsionam qualquer ecossistema. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser usada para fechar a dinâmica rápida do microbioma com o regime de amostragem de intervalo curto, mantendo-se altamente econômica. Este método pode ser usado para obter informações sobre comunidades microbianas biotecnológicas e naturais e também sobre microbiomas animais e humanos para estados nutricionais e de saúde.

Demonstrando o procedimento estará Florian Schattenberg, técnico e operador de SediMeter em nosso laboratório. Para secar uma amostra da comunidade de biogás, use uma ponta de pipeta modificada de um mililitro para transferir 200 microlitros do digerido viscoso para um tubo de dois mililitros contendo 1,7 mililitros de PBS. Após uma mistura completa, coloque os tubos em um banho ultrassônico por um minuto para dissolver quaisquer agregados de células grandes e anexar as células aderidas aos resíduos das células vegetais.

Após a sonicação, misture bem a amostra e filtre as células através de um filtro de malha de poros de 50 micrômetros em um tubo de plástico de 2 mililitros. Divida o filtrado em quatro alíquotas de 400 microlitros e centrifugue as alíquotas duas vezes, descartando completamente o sobrenadante nas duas vezes para desidratar mecanicamente a amostra de micróbio o mais completamente possível. Em seguida, seque a amostra em uma centrífuga a vácuo aquecida para criar um pellet estável e armazene o pellet a quatro graus Celsius protegido da luz.

Para estabilização e fixação de amostras de lodo ativado, centrifugue quatro mililitros das células e ressuspenda o pellet em quatro mililitros de dois por cento de formaldeído em PBS. Após 30 minutos em temperatura ambiente, centrifugue a amostra de célula estabilizada e fixe o pellet em quatro mililitros de etanol a 70% para armazenamento de menos 20 graus Celsius. Misture e transfira 0,6 mililitros da suspensão de célula fixa para um tubo de vidro contendo 1,4 mililitros de PBS e, após uma mistura completa, sonice por 10 minutos, conforme demonstrado.

No final da sonicação, colete as células por centrifugação e ressuspenda o pellet em dois mililitros de PBS fresco. Após uma mistura completa, sonicar as células como acabamos de demonstrar por cinco minutos e ajustar o OD 700 nanômetros para 035 com PBS fresco. Colete as células por centrifugação e ressuspenda o pellet em um mililitro de tampão de permeabablização contendo ácido cítrico 0,11 molar e 4,1 milimolar tween 20, com mistura completa, por 20 minutos de incubação à temperatura ambiente.

Em seguida, colete as células por centrifugação e ressuspenda completamente o pellet em dois mililitros de solução de coloração contendo 0,68 DAPI micromolar, para incubação em pelo menos 60 minutos à temperatura ambiente, protegida da luz. Para calibração de cordão, carregue a mistura de grânulos para calibração linear no citômetro de fluxo e meça os grânulos continuamente enquanto manipula as posições do bico e da óptica do laser para pré-calibrar o instrumento na faixa linear. Quando os picos do grânulo puderem ser encaixados em um modelo de calibração predefinido, mude para o modo log e carregue uma amostra de grânulo de calibração logarítmica.

Ajuste os picos logarítmicos do cordão ao modelo de calibração predefinido para ajustar o hardware do instrumento e use a configuração de ganho do tubo fotomultiplicador para fazer os ajustes finais necessários na posição do cordão O aspecto mais crítico deste procedimento é manter medições consistentes para permitir a comparabilidade entre os experimentos. Portanto, a calibração diária do citômetro e o uso de grânulos nas pálpebras biológicas dos tocos são vitais para o sucesso da diálise lenta do microbioma citrómico. Quando as células estiverem prontas, misture e filtre as amostras e adicione a mistura de esferas logarítmicas às células.

Agora misture e carregue a amostra no citômetro e crie uma porta para incluir as células coradas e excluir o ruído e as contas. Em seguida, analise o conjunto de amostras consecutivamente a uma velocidade máxima de 3.000 eventos por segundo até que 250.000 células sejam detectadas dentro da porta da célula. Para analisar os dados de citometria de fluxo, desenvolva um modelo de porta mestre para uso em todas as amostras.

Comece carregando os arquivos padrão de citometria de fluxo em um programa de análise de citometria de fluxo apropriado e processe as amostras sucessivamente. Carregue as amostras, clique duas vezes em uma medição e selecione os parâmetros dos eixos X e Y, em seus respectivos menus suspensos para abrir um gráfico de dispersão direta versus fluorescência DAPI. Use a ferramenta de desenho de polígono para reproduzir a porta da célula de medição gerada anteriormente para excluir as contas e o ruído e nomeie a porta de acordo.

Arraste a entrada do portão de célula para a lista de grupos de todas as amostras e clique duas vezes no portão de célula para exibir seletivamente apenas os eventos da célula. Defina as subcomunidades predominantes em uma amostra com a ferramenta de porta elíptica e agrupe-as. Em seguida, adicione alocações adicionais de subcomunidade e amostras subsequentes até que o modelo de portão mestre se ajuste a todas as amostras.

Controle o modelo do portão mestre com o método de varredura de dispersão lateral para resolver o agrupamento de subcomunidades próximas umas das outras. Em seguida, adicione todas as subcomunidades ao editor de tabelas e defina a estatística de saída como frequência do pai. Use o editor de tabelas para exportar as abundâncias relativas da subcomunidade para um software de planilha apropriado e adapte a formatação dos dados de acordo com as diretrizes do manual da barra lateral.

Em seguida, para visualizar a dinâmica e as correlações da subcomunidade, instale e carregue o pacote R e carregue e normalize o arquivo txt. Os gráficos de fluorescência de dispersão direta versus DAPI revelam os estados do ciclo celular de culturas de cepas puras em diferentes pontos de uma cultura em lote. O uso de um modelo de porta mestra permite a quantificação da proporção de células com um, dois ou vários cromossomos, revelando, por exemplo, a capacidade desse micróbio representativo de replicar seus cromossomos mais rapidamente do que seu tempo de geração.

Ao investigar comunidades microbianas complexas ao longo do tempo, o ritmo e o significado da mudança da comunidade podem ser facilmente visualizados com uma sequência de gráficos de pontos. As subcomunidades dominantes em diferentes estágios do experimento podem ser claramente identificadas usando a ferramenta de código de barras citométrico. A combinação desses dados com a distribuição de frequência das abundâncias relativas da subcomunidade permite a seleção de portões que demonstram mudanças significativas na abundância em pontos-chave no tempo.

A visualização desses dados em um gráfico de escala multidimensional não métrico pode facilitar uma compreensão mais profunda da dinâmica da comunidade. As comunidades de biogás podem potencialmente enfrentar heterogeneidades espaciais devido a limitações de agitação. Os pontos de amostra exemplares da comunidade de biogás exibem pouca heterogeneidade espacial, mas temporal pronunciada.

Fortes correlações positivas ou negativas com parâmetros abióticos, como tight de produtos, podem ajudar na compreensão e otimização de ecossistemas e processos biotecnológicos. Além disso, facilitam a identificação de portões de interesse especial para posterior triagem e análise. Ao estabelecer este procedimento, é aconselhável avaliar diferentes procedimentos de fixação e coloração para avaliar seu desempenho e estabilidade para cada novo conjunto de amostras.

Após a classificação, outras abordagens, como cercas amplicômicas, metagenômica e proteômica, podem ser aplicadas para selecionar as principais comunidades que fornecem informações sobre a afiliação protogenética em estados de atividade fora das vias metabólicas. Este método abriu o caminho para ecologistas microbianos e engenheiros de bioprocessos seguirem a dinâmica do microbioma ecossistemas naturais e controlados com um investimento razoável de recursos.