Name: Caracterizando Microbiome dinâmica – citometria de fluxo com base em fluxos de trabalho de culturas puras de comunidades naturais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Aprenda a usar citometria de fluxo para analisar dinâmicas de comunidades microbianas em ecossistemas naturais e biotecnológicos. Este método permite monitoramento rápido e econômico do microbioma com amostragem em intervalos curtos.

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Reconhecemos com gratidão o Michael Jahn e Yuting Guo para fornecer o procedimento e conjuntos de dados de cultura pura e a comunidade de lamas activadas, respectivamente. Agradecemos ainda mais Katrin Mörters para análise das amostras de comunidade de biogás. Este trabalho foi financiado pelo e de Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe. V. (FNR, projeto biogás-impressão digital Nr. 22008313) em nome do Ministério Federal alemão para a alimentação e agricultura (BMEL), o programa Central de inovação para as PME (ZIM), do Ministério federal de economia e energia (BMWi) (joao-ABOS, 16KN043222), a Deutsche Bundesstiftung Umwelt (DBU, projeto sob demanda Produktion von Phosphatdünger aus Reststoffen von Brauerei und Kläranlage 33960/01-32), o Ministério Federal alemão de educação e Pesquisa (BMBF) (FZK 03XP0041G), e da Associação Helmholtz orientada para o programa de financiamento (POF III R31 tópico 3 bioenergia).

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Os autores não têm nada para divulgar.

Uma análise bem sucedida das comunidades e populações microbianas requer cytometers bem afinados, uma escolha adequada dos parâmetros da célula e um fluxo de trabalho confiável da amostragem e a fixação para a medição e dados de avaliação. Os parâmetros de célula selecionada devem consorciar-se com os comprimentos de onda de excitação disponíveis. Nós usamos e recomendamos DAPI, que é muito sensível em baixas concentrações; Mas precisa ser animado por um laser UV, que não é compreendido geralmente em citômetro padrão set-ups. Outros corantes, como o SYBR Green I, também mancha populações inteiras ou comunidades mas livrai geralmente resoluções inferiores. Não recomendamos usar procedimentos de peixe ou testes de viabilidade em comunidades microbianas. Essas abordagens são impossíveis de quantificar, verificar e controlar, porque seus efeitos em espécies individuais na Comunidade é incerto. Eles não podem ser confiavelmente testados, enquanto uma parte substancial das comunidades típicas é ainda não está disponível como uma cultura pura.
Passos críticos no protocolo incluem procedimentos de amostragem e fixação, bem como a classificação de célula. A amostragem pode ser complicada pela tendência de certas culturas puras e comunidades microbianas que agregam-se flocos ou aderir às partículas da matriz da amostra. É essencial para dissipar estes agregados e separar as células em uma amostra antes de apresentá-los para análise de fluxo cytometric para garantir resultados confiáveis. Os protocolos de preparação apresentados foram otimizados para permitir análise única célula. Filtração final 50 µm é executada antes da medição para remover qualquer residuais agregados e evitar o bocal de 70 µm de classificador de célula e a cubeta de fluxo do analisador de entupimento. Flocos de células de plantas de tratamento de águas residuais são especialmente abundantes, robusto e vital para a função do sistema. Nós investigamos o planctônicos e lamas com base em comunidades microbianas em tanques diferentes de uma estação de tratamento de águas residuais em grande escala, para testar o protocolo estabelecido. O lodo formando células agregados foram claramente se dissipou e a composição da Comunidade permaneceram estáveis. Além disso, as comunidades planctônicas e baseada em lodo exibiram notável semelhança entre eles em todos os três tanques amostrados (Figura 8, arquivo complementar 1-S10). Estes resultados foram verificados por comparativos 16S rDNA amplicon sequenciamento de um fresco, um formaldeído tratados-, fixado um formaldeído e etanol-e uma amostra classificada10. Não obstante, extraordinariamente desafiador de amostras ambientais, tais como biofilmes fortes ou bactérias que crescem nas cadeias bem ligadas, pode ser impossível de se dissipar. Amostras de solo podem ser particularmente problemáticas, como as partículas onipresentes aparecem no histograma e podem obscurecer as células pela enorme abundância. Em tais casos, métodos de sequenciamento tradicional precisam ser aplicado.
A estabilidade de fixação de cada novo conjunto de amostra deve ser testada antes de projetar o experimento para garantir a validade do resultado. Estabilidade de fixação boa também permite que o pool de coloração e medição de vários pontos de tempo de amostra em um único dia. Além disso, possibilita medições de replicação e retrospectiva célula classificação de pontos de tempo decisivo após a conclusão e avaliação final do experimento. A estabilidade da fixação da cultura pura foi verificada ao longo de 28 dias (Figura 9). Para experiências no local, incluindo o transporte da amostra, a estabilidade de fixação deve ser testada por períodos mais longos (no caso, 60 dias para a comunidade de lamas activadas, 195 dias para a comunidade de biogás, arquivo complementar 1-S9).
A coloração geralmente não é problemática, mas precisa ser controlada com um padrão biológico para permitir a aplicação das ferramentas de bioinformatic avaliação. Usamos a cepa trocista Escherichia coli BL21 (DE3), que foi fixado de acordo com o protocolo ASC e armazenadas para uso em cada lote de coloração.
Além de DAPI, SYBR Green eu já foi aplicado com sucesso para resolver as comunidades microbianas por vários anos14,23,24,25,26. SYBR Green que posso solucionar comunidades em subconjuntos de alta e baixa de ácidos nucleicos (HNA e LNA) usando células vivas em um modus on-line. DAPI, no entanto, é mais específico na sua ligação ao DNA e permite a distinção de mais de 50 subcommunities em conjunto uma amostra mas requer uma etapa de fixação antes da coloração.
Classificação de célula é uma característica marcante desta abordagem e pode ser aplicada se certos subcommunities são de mais interesse. Isso precisa ser enfatizado que nem PFA-(interpretada por apenas 30 min), nem tratamento de etanol ou DAPI coloração10 teve um efeito negativo sobre o sequenciamento de amplicons 16S subsequentes. Potencial influencia da fixação e coloração procedimentos na subcommunity metagenome análises ainda precisam ser testados.
Um monte de informações sobre as funções de comunidade e tendência dinâmica pode ser obtido independente da abordagem classificação quando envolvendo ferramentas de Bioinformática que resolver recursos da Comunidade num nível de célula por célula virtual e conectar esses recursos com abiótico parâmetros.
Recentemente, uma série de novas ferramentas de avaliação de bioinformática, muito útil para ambos o SYBR Green I e as abordagens DAPI, foram desenvolvidos para resolver padrões de comunidade cytometric. Estes são FlowFP27, os pacotes usados neste estudo (flowCHIC20, flowCyBar28), um modelo de deconvolução estabelecido com água fresca comunidades29 e uma ferramenta usada para discriminar cepas de acordo com seus fisiológicos características de30. Além disso, cytometric diversidade pode ser determinado25 e estabilidade mesmo Propriedades de comunidades microbianas agora podem ser seguidas com uma ferramenta on-line10.
Assim, análises de fluxo cytometric têm uma enorme vantagem quando se trata de avaliação rápida das comunidades microbianas e parâmetro abióticos possíveis correlações. No entanto, ainda existem limitações para o método. Não pode ser aplicada de forma verdadeiramente on-line, com a ferramenta flowCyBar, devido ao processo de configuração de portão com base experiente. Além disso, o desenvolvimento de citômetros feitos sob medida, fácil de usar muito avançou a proliferação da abordagem de análise de fluxo cytometric microbiome. Primeiros passos neste sentido são realizadas28.
Futuras aplicações da citometria de fluxo microbiano podem ser vislumbradas em ecologia microbiana, que permite alta frequência de monitoramento dentro da escala de tempos de geração bacteriana e tem sido demonstrado que paradigmas ecológicas são aplicáveis aos dados cytometric5 ,10. O método é muito útil para as sessões de rotina de ambientes naturais, como os controles obrigatórios de água potável na Suíça31. Também pode ser uma ferramenta valiosa para aplicações médicas como humano15 ou animal32 microbiome triagem. Além disso, desenvolvimentos mais recentes em Bioinformática podem permitir citometria de fluxo microbiano ser um sensor integral nos controles do processo de sistemas gerenciados microbianos. Citometria de comunidade microbiana também fornece uma ferramenta de triagem para classificação de célula, que permite maior resolução investigações genômicas de subconjuntos específicos de comunidade.

Os microrganismos desempenham um papel vital em muitos aspectos do ser humano vivo. Eles são os principais drivers bióticos dos planetas carbono, nitrogênio, fósforo e enxofre ciclos1e ato como degradante,2,3 , bem como sintetizar4 Biocatalisadores em várias indústrias, tais como tratamento de águas residuais 5 ou biotecnologia6. Eles ainda constituem a microbiome humano, que está influenciando diretamente a saúde humana e metabolismo7,8. Portanto, as informações sobre estrutura, função e comportamento dinâmico de microorganismos, em resposta ao seu ambiente imediato, são necessárias se pretendemos inteiramente compreender e manipular esses sistemas. Próxima geração de sequenciamento (NGS) é a tecnologia estabelecida para a resolução de microbiome estrutura e função9. No entanto, a análise e avaliação de dados NGS não é possível gerar informações quantitativas e é ainda caro, demorado e de nenhuma maneira pronta para fornecer resultados no local dentro de corredores de desempenho. Algumas bactérias exibem geração vezes abaixo de 1h e causa estruturas comunitárias em certos ambientes10em constante mudança. Na sequência de tal dinâmica, usar abordagens de sequenciamento excederia a capacidade financeira e da força de trabalho de laboratórios mais científicos.
Em contraste, citometria de fluxo pode fornecer impressões digitais de comunidade semelhante aos dados NGS, mantendo uma maior eficiência de tempo, mão de obra e custo. Aqui, apresentamos técnicas de fluxo cytometric capazes de seguir a comunidade microbiana dinâmica em linha a nível de célula única. Ao contrário de NGS, citometria de fluxo não fornece afiliação filogenética ou informações sobre genes funcionais, mas oferece números de telemóvel quantitativa. Utilizando citometria de fluxo, comunidades microbianas podem ser resolvidas em subcommunities com a dispersão de luz distinta e propriedades de fluorescência (forward scatter (FSC) e dispersão lateral (SSC) fornecem indicações de tamanho da célula e granularidade, respectivamente). A abordagem apresentada utiliza predominantemente célula tamanho - e DNA montante informações relacionadas que estão associados a certos tipos de células e Estados fisiológicos (crescimento). O conteúdo de DNA é quantificado usando o UV-excitável 4', tintura de 6-diamidino-2'-phenylindole (DAPI), que se liga para regiões ricas A-T do DNA e nem pode resolver diferentes níveis cromossômicos. Combinando DAPI fluorescência e FSC mais de 50 subcommunities podem ser distinguidos e monitorados por abundâncias sendo alterado ao longo do tempo11. As variações de abundância de subcommunity podem ser correlacionadas com as mudanças no ambiente microambientais, tais como pH e produto títulos12, com parâmetros globais, tais como o tempo de13,14, ou em caso de intestino ou saliva microbiomes com determinados tratamentos médicos,15. Essas correlações revelam chaves subcommunities responsáveis por determinadas funções na rede metabólica de toda a Comunidade. Os subcommunities chaves podem então ser especificamente promovidos suprimidas, alterando os microambientes circundantes ou classificados para posterior sequenciamento15 ou proteomic investigação16.
No entanto, citometria de fluxo da comunidade microbiana não é ainda amplamente estabelecida devido a um número bastante baixo de fluxo cytometric dispositivos capazes de resolver as populações microbianas ou comunidades corretamente. Além disso, a falta de experiência, comunidade pipelines de análise e avaliação de dados eficaz pode representar uma barreira de entrada para os investigadores microbiome análise desafios. Nós estabelecemos a fluxos de trabalho abrangentes para abordar estas questões. Para ilustrar sua aplicabilidade geral, vamos apresentar-lhes sobre três conjuntos de amostra exemplar (arquivo complementar 1-S1), ou seja, eu) uma cultura pura (PC) para aplicações biotecnológicas cultivados em meios claramente definidos (Pseudomonas putida KT 2440 na glicose), ii) uma comunidade de laboratório complexo em claro médio (comunidade de lamas activadas (ASC), em efluente sintético) e iii) uma comunidade complexa de ambientes naturais em uma matriz densa (comunidade de biogás (BC), em silagem de milho).
Diversos fatores influenciam a escolha do protocolo para cada um desses conjuntos de amostra. Congelação profunda renuncia a utilização de produtos químicos tóxicos, mas principalmente está limitada a ambientes de laboratório devido ao uso de nitrogênio líquido para cobertura de choque. A estabilização de formaldeído e etanol subsequente fixação permite a amostragem em massa sem a necessidade de preparação de alíquota e tem provado para ser estável durante longos períodos. No entanto, amostras de ricos em proteínas, tais como saliva humana15 podem ser problemáticas, porque flocos de proteína, denaturized pelo formaldeído, podem causar sinal desfavorável para rácios de ruído. A secagem da amostra vai levar mais tempo (cerca de 1 h no total) dos procedimentos nesta comparação, mas pode ser executada no site sem produtos químicos tóxicos. Que produz pelotas estáveis em tubos, que podem ser facilmente enviados sem precauções de risco adicional ou refrigeração. Além disso, muitos métodos alternativos de fixação foram propostos11. É altamente recomendável para testar a estabilidade de resolução e a fixação de diferentes protocolos, aquando da introdução de um novo conjunto de amostra.
Usamos dois citômetros diferentes para analisar os conjuntos: i) uma pesquisa altamente sofisticada e cara, centralizado classificador da pilha e ii) um aplicativo focado banco Analisador superior que aparece mais adequado para aplicação no local5. O BC foi medido com o analisador de bancada superior, enquanto o PC e ASC foram medidos com o classificador de célula. A análise da amostra exemplar três conjuntos diferentes procedimentos necessários para a reprodutibilidade otimizada, estabilidade de amostra e conveniência de fluxo de trabalho. O seguinte protocolo especificará as seções para os três sistemas diferentes.

<table><tbody><tr><td>Sistema Milli-Q Synthesis A10</td><td>Merck, Darmstadt, (GER)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioPak Ultrafiltration Cartridge</td><td>Merck, Darmstadt, (GER)</td><td>CDUF BI0 01</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo Legacy cell sorter</td><td>Beckman-Coulter, Brea, Califórnia (EUA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Innova 90C</td><td>Coherent, Inc , Santa Clara (EUA)</td><td></td><td>334 nm - 364 nm, 100 mW</td></tr><tr><td>Innova 70C&nbsp;</td><td>Coherent, Inc , Santa Clara (EUA)</td><td></td><td>488 nm, 400 mW</td></tr><tr><td>Genesis MX488-500 STM OPS</td><td>Coherent, Inc , Santa Clara (EUA)</td><td></td><td>488 nm, 400 mW</td></tr><tr><td>Xcyte CY-355-150</td><td>Lumentum, Milpitas, Califórnia, EUA</td><td></td><td>355 nm, 150 mW</td></tr><tr><td>Tubos fotomultiplicadores R928 e R3896</td><td>Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japão)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td> <td>Summit 4.3Beckman-Coulter, Brea, Califórnia (EUA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 e micro; m&nbsp; Sondas Moleculares FluoSpheres</td><td>, Eugene, Oregon (EUA)</td><td>F8815</td><td>350/440 azul fluorescente</td></tr><tr><td>2 &mu; m YG FluoSpheres</td><td>Molecular Probes, Eugene, Oregon (EUA)</td><td>F-8827</td><td>505/515 contas fluorescentes verde-amarelas&nbsp;</td></tr><tr><td>0,5 &mu; m Microesferas de carboxilato Fluoresbrite BB</td><td>PolyScience, Niles, Illinois (EUA)</td> <td>18339</td><td>360/407</td></tr><tr><td>1 &mu; m Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres</td><td>PolyScience, Niles, Illinois (EUA)</td><td>17458</td><td>360/407 azul fluorescente</td></tr><tr><td>1 &micro; Sondas Moleculares mYG FluoSpheres</td><td>, Eugene, Oregon (EUA)</td><td>F-13081</td><td>505/515 contas fluorescentes verde-amarelas&nbsp;</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (EUA)</td><td>CAS no. 7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (EUA)</td><td>CAS no. 7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Cyflow Space&nbsp;</td><td>Sysmex Corporation, Kobe (Japão)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV Laser Genesis CX,Coherent</td><td>, Inc, Santa Clara (EUA)</td><td></td><td>355 nm, 150 mW</td></tr><tr><td>H6779-32 série PMTs</td><td>Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japão)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FloMax software</td><td>Sysmex Partec GmbH, G&ouml; rlitz, (GER)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>todos os filtros ópticos</td><td>Carl Zeiss, Jena (GER)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (EUA)</td><td>CAS no. 7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth, Karlsruhe (GER)</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10.0.8r1</td><td>FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (EUA)</td><td></td><td>Número de compilação: 42398</td></tr><tr><td>R-software v.3.4.3</td><td>R Core Team</td><td></td><td></td></tr><tr><td>flowCHIC</td><<td>a href="http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html">http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>flowCyBar</td><td><a href="http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html">http://www.bioconductor.org/packages/devel/ bioc/html/flowCyBar.html</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

caracterizando microbiome dinâmica – citometria de fluxo com base em fluxos de trabalho de culturas puras de comunidades naturais

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

A investigação de culturas puras e acompanhamento da dinâmica da comunidade microbiana são vitais para compreender e controlar os ecossistemas naturais e aplicações técnicas, conduzidas por microorganismos. Próxima geração métodos de sequenciamento são amplamente utilizados para resolver microbiomes, mas eles geralmente são recursos e tempo intensivo e entregam informações principalmente qualitativas. Análise de fluxo cytometric microbiome não sofrem estas desvantagens e pode fornecer abundâncias subcommunity relativo e absoluto na linha de números de celular. Embora ele não entrega informação filogenética directa, pode realçar a profundidade de análise e resolução de abordagens de sequenciamento. Em contraste com aplicações médicas na pesquisa e configurações de rotina, citometria de fluxo é ainda não amplamente utilizada para análise de microbiome. Informações ausentes em gasodutos de análise de dados e preparação de amostra podem criar uma barreira de entrada para os pesquisadores enfrentam desafios de análise microbiome que seriam muitas vezes aplicações de citometria de fluxo típico. Aqui, apresentamos três fluxos de trabalho abrangentes para culturas puras, comunidades complexas em claro médias e complexas comunidades em matrizes desafiadoras, respectivamente. Descrevemos os procedimentos de amostragem e fixação individuais e otimizado de protocolos para os amostra respectivos conjuntos de coloração. Elaborar a análise cytometric com uma complexa investigação centrada e um dispositivo de topo aplicativo banco focado, descrevemos a célula classificação procedimento e sugerir pacotes de análise de dados. Além disso propomos importantes controles experimentais e aplicam-se os fluxos de trabalho apresentados para a respectiva amostra de moda.

Os seguintes resultados representativos enfatizam a necessidade de repetições e exemplificam técnicas de visualização e análise de dados diferentes em cada um dos três conjuntos de amostra. Eles mostram os resultados de dados possíveis condutas de avaliação adequado para responder às perguntas de pesquisa padrão sobre o respectivo conjunto. No entanto, as técnicas apresentadas não são exclusivas ao conjunto de amostra que são apresentados com. Os dados brutos de citometria de fluxo foi disponibilizados publicamente com ID FlowRepository FR-FCM-ZY46. Anteriormente inseridos dados ASC estão disponíveis sob ID FR-FCM-ZYD7.
Réplicas biológicas e técnicas foram tomadas, elaboradas e analisadas de acordo com protocolos publicados11. Réplicas biológicas do PC e ASC foram retiradas três frascos paralelos. Réplicas biológicas do A.C. foram tomadas como três amostragens subsequentes em um local em uma planta em escala piloto. Três alíquotas de uma amostra foram fixadas, manchadas e analisadas para garantir a reprodutibilidade técnica. A reprodutibilidade dos métodos foi avaliada de acordo com os procedimentos anteriormente publicados11. Um modelo de portão para todas as amostras do conjunto de uma amostra (arquivo complementar 1-S6) foi usado para calcular o desvio padrão (%) por porta.
Para o PC, o desvio-padrão máximo da abundância relativa foi de 3,44%, enquanto o desvio padrão da médio foi de 2,13% (Figura 1). Para o ASC e o BC, os desvios-padrão máximos das abundâncias relativas foram 1,27% e 0,88%, enquanto as médias dos desvios-padrão foram 2,13% e 0,21% (arquivo complementar 1-S8).
Um procedimento padrão, ao investigar uma cultura de linhagem pura, é a preparação de uma curva de crescimento para analisar a fase de retardo, tempos de geração e densidade celular sob condições específicas. Nós combinamos este procedimento com o fluxo cytometric análise fluxo de trabalho para alcançar uma compreensão mais profunda do sistema (Figura 2). O FSC vs DAPI fluorescência parcelas revelaram os Estados do ciclo celular da cultura em diferentes pontos da cultura em lotes. Um modelo de portão mestre (arquivo complementar 1-S6) foi estabelecido para quantificar a proporção de células com um (c1n), dois (c2n) e vários cromossomos (cXn, Figura 2B). A proporção predominante de células inoculadas tinha apenas um cromossomo (93,7% às 0h). Isto mudou drasticamente durante o crescimento exponencial, onde quase todas as células continham mais de um (99,6%, 4 h) e mais metade da população (53,1%) ainda continha mais de dois cromossomos. Isto ilustra p. putidas capacidade de replicar seus cromossomos mais rápido do que seu tempo de geração.
Análise de fluxo cytometric provou muito útil para monitorar a evolução das comunidades microbianas. Ele pode acompanhar a dinâmica da comunidade muito mais perto do que o mais recurso intensivo de métodos moleculares5,10. Nós destacadas essas dinâmicas em um filme e ganhou uma visão geral sobre os turnos de comunidade de lodos ativados ao longo do tempo. Cada um segundo quadro mostra uma trama de fluorescência FSC vs DAPI de um ponto de amostra (arquivo complementar 2). Uma mudança muito distinta entre dia 0 e o dia 4 foi seguida pelo estabelecimento de uma comunidade de núcleo após dia 7. Subcommunities adicionais surgiu no dia 21. Estabelecemos um modelo de portão mestre (arquivo complementar 1-S6) que permitiu a avaliação da dinâmica microbiana em um nível de subcommunity. Os subcommunities dominantes em diferentes fases do experimento foram claramente identificados usando a ferramenta CyBar (Figura 3). Combinando-a com a distribuição de frequência das abundâncias relativa subcommunity ajudou a selecionar gates que são interessante (alteração significativa em abundância, desencadeada em um ponto chave de tempo) e viáveis (mais 5% de abundância relativa) para classificação e mais análise de22.
Aplicações de biorreator de escala industrial podem enfrentar potenciais heterogeneidades espaciais devido a limitações de agitação. Eles também frequentemente estão expostos a alteração de parâmetros operacionais, como alterações na qualidade dos substratos não-sintético. O BC representa um sistema desse tipo e foi amostrado de diferentes localidades em um reator de fluxo dinamicamente conduzido plug. Parcelas de fluorescência o FSC vs DAPI (Figura 4) dos pontos de amostra exemplar mostram apenas pouco espacial, mas pronuncia-se heterogeneidade temporal. O BC foi mais investigado usando ambos, o chique rápida automatizada e o modelo de portão mestre mais aprofundado baseado CyBar abordagem.
Sua natureza automatizada, rápida e imparcial, faz com que o CHIC particularmente interessante para o controle no local de Bioprocessos em um ambiente industrial. Ele compara dados crus .fcs de todas as amostras disponíveis. Dois dessas comparações são exibidos na Figura 5. Os valores resultantes de dissimilaridade confirmam as observações anteriores relativas à heterogeneidade espacial e temporal. A forma de parcelas geradas NMDS a matriz de dissimilaridade de ferramentas CHIC (Figura 6) mais fundamenta este resultado e visualiza-lo em conformidade.
Além disso, calculamos a abundância relativa de 23 subcommunities do A.C. usando um modelo de portão mestre (arquivo complementar 1-S6). Realizou-se uma análise de correlação de 48 amostras de um período de um ano para compreender as relações funcionais na comunidade microbiana. Isto pode ajudar a identificar portas de interesse para investigação futura (classificação de célula 4). Correlações positivas ou negativas com parâmetros abióticos como produto títulos podem ajudar a entender e otimizar os ecossistemas e processos biotecnológicos. A taxa de carregamento orgânico incluída nesta correlação (Figura 7) exemplifica um parâmetro tão abiótico. G5, G4 e G10 exibem correlações positivas e possivelmente poderiam conter espécies fermentativa, enquanto a correlação negativa no G8 pode dica para archaea metanogénicas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig1.jpg"> Figura 1: reprodutibilidade de análise cytometric da pura cultura. Fluorescência de FSC vs DAPI parcelas com grânulos de controle (A, B) e bar parcelas das abundâncias de 3 subcommunity [%] com barras de erro, que representa um desvio padrão de ± (C, D). As abundâncias relativas foram determinadas com o modelo de portão mostrado no arquivo complementar 1-S6. Três réplicas biológicas A, B e C foram tiradas da curva de crescimento em 4 h e três repetições técnicas P1, P2, P3 foram preparados da amostra A e medido três vezes, respectivamente: M1, M2, M3 e são dadas com seus respectivos desvios-padrão. 50.000 eventos foram gravados na porta da cela. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig2.jpg"> Figura 2: análise de ciclo celular de cultura pura, tirada durante uma curva de crescimento experimentar mais 12 h. (A). Fluorescência de FSC vs DAPI parcelas das amostragens de bi-horária que apresentam uma mudança do conteúdo de DNA durante a fase de crescimento exponencial. Esta série de medição não inclui grânulos (ver arquivo complementar 1-S3). (B). curva de crescimento baseado na densidade óptica com barras de erro, que representa um desvio padrão de ± e abundâncias relativas nos subcommunities ao longo do tempo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig3.jpg"> Figura 3: evolução da estrutura da comunidade de lamas activadas durante 24 dias. (A) a flowCyBar com a sobreposição de distribuições de frequência visualizadas em boxplots para as portas individuais que são organizadas pela semelhança das tendências, o correspondente cor chave (B) e uma análise de similaridade em uma trama NMDS sagacidade R &lt; (0,001 C). os terrenos subjacentes são mostrados na sequência do filme em arquivo complementar 2. Abundâncias relativas foram determinadas utilizando o modelo de portão no arquivo 1 - S6 suplementares. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig4.jpg"> Figura 4: ficha de heterogeneidade espacial e temporal da estrutura da comunidade microbiana em escala industrial reator de fluxo biogás. Amostragem (A), a comparação da estrutura da comunidade microbiana dos quatro portas I-IV no dia 223. (B) a comparação entre as variações de estrutura comunidade dependente tempo do dia 0 ao dia 384 no porto II. O barulho foi cortado tardiamente para melhorar a visualização. 250.000 eventos foram medidos na porta celular (arquivo complementar 1-S6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig5.jpg"> Figura 5: comparação da imagem histograma Cytometric — chique. O princípio do algoritmo CHIC é exemplificado pela comparação de duas amostras, representando a heterogeneidade espacial e temporal, respectivamente. (i) imagens CHIC são criadas a partir de arquivos de .fcs depois de selecionar dois parâmetros para exibir (fluorescência FSC vs DAPI). A escala de cinzentos (0-255) códigos a contagem de eventos em um pixel. (ii) CHIC subconjuntos são gerados depois de especificar a área que contém células (aqui: 200 &lt; x &lt; 4000, 200 &lt; &lt; 2200 de y). (iii) XOR combinação imagem é criada através da comparação de pixels entre os subconjuntos. Não há diferença é igual a 0 e é exibida como preto. Diferença máxima é igual a 200 e é exibida como branco. O correspondente valor do XOR é calculado somando os valores de escala de cinza de todos os pixels na imagem de XOR. (iv) sobreposição combinação imagem é criada adicionando-se os valores de tons de cinza dos pixels de subconjuntos. O valor de sobreposição correspondente é calculado contando os pixels de uma imagem de sobreposição que não igual a zero e, portanto, conter informações. (v) valores de dissimilaridade são calculadas dividindo valores XOR e sobreposição. Estas são a base para o enredo NMDS na Figura 6. Ambos os valores de dissimilaridade e o show de enredo NMDS um insignificante espacial- e uma comunidade temporal pronunciada heterogeneidade. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig6.jpg"> Figura 6: CHIC com base em análise de similaridade das amostras comunidade biogás. A amostra de 0-dia foram excluída desta trama devido à sua estrutura extremamente diferentes comunidade distorcendo a análise (arquivo complementar 1-S11). O enredo NMDS confirma a suposição sobre baixo espacial- e maior heterogeneidade temporal feitas usando a ferramenta CHIC e explicado na Figura 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig7.jpg"> Figura 7: análise de correlação na Comunidade biogás. A matriz foi calculada utilizando o coeficiente de ordem de classificação de postos de Spearman e baseia-se a abundância relativa de 23 subcommunities que foram determinadas com o modelo de portão mestre no arquivo complementar 1-S6. Eles foram correlacionados com a taxa de carregamento orgânico (OLR) para 48 amostras de um período de um ano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig8.jpg"> Figura 8: análise de similaridade de planctônicos (P) e lamas com base em comunidades (S) nas águas residuais. Foram colhidas amostras da bacia de lamas clarificador primário (PCL), ativado (AS) e tanque digestor (DT) de uma planta de tratamento de águas residuais em grande escala (lotes do ponto no arquivo complementar 1-S10). Abundâncias relativas foram determinadas utilizando o modelo de portão mostrado no arquivo complementar 1-S6. Essas abundâncias subcommunity também foram analisadas com a ferramenta flowCyBar para criar um CyBar (arquivo complementar 1-S10) e NMDS plot (R &lt; 0,01). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig8large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig9.jpg"> Figura 9: estabilidade de fixação da cultura pura. Amostras do experimento de curva de crescimento levado às 0h foram armazenadas a-80 ° C, com mais de 28 dias após a fixação em 15% de glicerol. Fluorescência de FSC vs DAPI parcelas com controle grânulos são mostrados. Série de medição não inclui grânulos (arquivo complementar 1-S3). 50.000 eventos foram gravados na porta celular (arquivo complementar 1-S6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig9large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Arquivo complementar 1: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/Supplementary-File-1.pdf" target="_blank">por favor clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo complementar 2: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/Supplementary_File_2.gif" target="_blank">por favor clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Análise de fluxo cytometric demonstrou ser valiosa para investigar culturas puras e monitoração dinâmica da comunidade microbiana. Apresentamos três abrangentes fluxos de trabalho, de recolha de amostras para análise de dados, para culturas puras e comunidades complexas em meio clara, bem como em matrizes desafiadoras, respectivamente.

Caracterizando Microbiome dinâmica – citometria de fluxo com base em fluxos de trabalho de culturas puras de comunidades naturais

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave em ecologia microbiana e biotecnologia, por exemplo, quais conceitos ecológicos impulsionam qualquer ecossistema. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser usada para fechar a dinâmica rápida do microbioma com o regime de amostragem de intervalo curto, mantendo-se altamente econômica. Este método pode ser usado para obter informações sobre comunidades microbianas biotecnológicas e naturais e também sobre microbiomas animais e humanos para estados nutricionais e de saúde.Demonstrando o procedimento estará Florian Schattenberg, técnico e operador de SediMeter em nosso laboratório. Para secar uma amostra da comunidade de biogás, use uma ponta de pipeta modificada de um mililitro para transferir 200 microlitros do digerido viscoso para um tubo de dois mililitros contendo 1,7 mililitros de PBS. Após uma mistura completa, coloque os tubos em um banho ultrassônico por um minuto para dissolver quaisquer agregados de células grandes e anexar as células aderidas aos resíduos das células vegetais.Após a sonicação, misture bem a amostra e filtre as células através de um filtro de malha de poros de 50 micrômetros em um tubo de plástico de 2 mililitros. Divida o filtrado em quatro alíquotas de 400 microlitros e centrifugue as alíquotas duas vezes, descartando completamente o sobrenadante nas duas vezes para desidratar mecanicamente a amostra de micróbio o mais completamente possível. Em seguida, seque a amostra em uma centrífuga a vácuo aquecida para criar um pellet estável e armazene o pellet a quatro graus Celsius protegido da luz.Para estabilização e fixação de amostras de lodo ativado, centrifugue quatro mililitros das células e ressuspenda o pellet em quatro mililitros de dois por cento de formaldeído em PBS. Após 30 minutos em temperatura ambiente, centrifugue a amostra de célula estabilizada e fixe o pellet em quatro mililitros de etanol a 70% para armazenamento de menos 20 graus Celsius. Misture e transfira 0,6 mililitros da suspensão de célula fixa para um tubo de vidro contendo 1,4 mililitros de PBS e, após uma mistura completa, sonice por 10 minutos, conforme demonstrado.No final da sonicação, colete as células por centrifugação e ressuspenda o pellet em dois mililitros de PBS fresco. Após uma mistura completa, sonicar as células como acabamos de demonstrar por cinco minutos e ajustar o OD 700 nanômetros para 035 com PBS fresco. Colete as células por centrifugação e ressuspenda o pellet em um mililitro de tampão de permeabablização contendo ácido cítrico 0,11 molar e 4,1 milimolar tween 20, com mistura completa, por 20 minutos de incubação à temperatura ambiente.Em seguida, colete as células por centrifugação e ressuspenda completamente o pellet em dois mililitros de solução de coloração contendo 0,68 DAPI micromolar, para incubação em pelo menos 60 minutos à temperatura ambiente, protegida da luz. Para calibração de cordão, carregue a mistura de grânulos para calibração linear no citômetro de fluxo e meça os grânulos continuamente enquanto manipula as posições do bico e da óptica do laser para pré-calibrar o instrumento na faixa linear. Quando os picos do grânulo puderem ser encaixados em um modelo de calibração predefinido, mude para o modo log e carregue uma amostra de grânulo de calibração logarítmica.Ajuste os picos logarítmicos do cordão ao modelo de calibração predefinido para ajustar o hardware do instrumento e use a configuração de ganho do tubo fotomultiplicador para fazer os ajustes finais necessários na posição do cordão O aspecto mais crítico deste procedimento é manter medições consistentes para permitir a comparabilidade entre os experimentos. Portanto, a calibração diária do citômetro e o uso de grânulos nas pálpebras biológicas dos tocos são vitais para o sucesso da diálise lenta do microbioma citrómico. Quando as células estiverem prontas, misture e filtre as amostras e adicione a mistura de esferas logarítmicas às células.Agora misture e carregue a amostra no citômetro e crie uma porta para incluir as células coradas e excluir o ruído e as contas. Em seguida, analise o conjunto de amostras consecutivamente a uma velocidade máxima de 3.000 eventos por segundo até que 250.000 células sejam detectadas dentro da porta da célula. Para analisar os dados de citometria de fluxo, desenvolva um modelo de porta mestre para uso em todas as amostras.Comece carregando os arquivos padrão de citometria de fluxo em um programa de análise de citometria de fluxo apropriado e processe as amostras sucessivamente. Carregue as amostras, clique duas vezes em uma medição e selecione os parâmetros dos eixos X e Y, em seus respectivos menus suspensos para abrir um gráfico de dispersão direta versus fluorescência DAPI. Use a ferramenta de desenho de polígono para reproduzir a porta da célula de medição gerada anteriormente para excluir as contas e o ruído e nomeie a porta de acordo.Arraste a entrada do portão de célula para a lista de grupos de todas as amostras e clique duas vezes no portão de célula para exibir seletivamente apenas os eventos da célula. Defina as subcomunidades predominantes em uma amostra com a ferramenta de porta elíptica e agrupe-as. Em seguida, adicione alocações adicionais de subcomunidade e amostras subsequentes até que o modelo de portão mestre se ajuste a todas as amostras.Controle o modelo do portão mestre com o método de varredura de dispersão lateral para resolver o agrupamento de subcomunidades próximas umas das outras. Em seguida, adicione todas as subcomunidades ao editor de tabelas e defina a estatística de saída como frequência do pai. Use o editor de tabelas para exportar as abundâncias relativas da subcomunidade para um software de planilha apropriado e adapte a formatação dos dados de acordo com as diretrizes do manual da barra lateral.Em seguida, para visualizar a dinâmica e as correlações da subcomunidade, instale e carregue o pacote R e carregue e normalize o arquivo txt. Os gráficos de fluorescência de dispersão direta versus DAPI revelam os estados do ciclo celular de culturas de cepas puras em diferentes pontos de uma cultura em lote. O uso de um modelo de porta mestra permite a quantificação da proporção de células com um, dois ou vários cromossomos, revelando, por exemplo, a capacidade desse micróbio representativo de replicar seus cromossomos mais rapidamente do que seu tempo de geração.Ao investigar comunidades microbianas complexas ao longo do tempo, o ritmo e o significado da mudança da comunidade podem ser facilmente visualizados com uma sequência de gráficos de pontos. As subcomunidades dominantes em diferentes estágios do experimento podem ser claramente identificadas usando a ferramenta de código de barras citométrico. A combinação desses dados com a distribuição de frequência das abundâncias relativas da subcomunidade permite a seleção de portões que demonstram mudanças significativas na abundância em pontos-chave no tempo.A visualização desses dados em um gráfico de escala multidimensional não métrico pode facilitar uma compreensão mais profunda da dinâmica da comunidade. As comunidades de biogás podem potencialmente enfrentar heterogeneidades espaciais devido a limitações de agitação. Os pontos de amostra exemplares da comunidade de biogás exibem pouca heterogeneidade espacial, mas temporal pronunciada.Fortes correlações positivas ou negativas com parâmetros abióticos, como tight de produtos, podem ajudar na compreensão e otimização de ecossistemas e processos biotecnológicos. Além disso, facilitam a identificação de portões de interesse especial para posterior triagem e análise. Ao estabelecer este procedimento, é aconselhável avaliar diferentes procedimentos de fixação e coloração para avaliar seu desempenho e estabilidade para cada novo conjunto de amostras.Após a classificação, outras abordagens, como cercas amplicômicas, metagenômica e proteômica, podem ser aplicadas para selecionar as principais comunidades que fornecem informações sobre a afiliação protogenética em estados de atividade fora das vias metabólicas. Este método abriu o caminho para ecologistas microbianos e engenheiros de bioprocessos seguirem a dinâmica do microbioma ecossistemas naturais e controlados com um investimento razoável de recursos.

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Molecular Probe Optimization para determinar mortalidade celular em um fotossintético organismo (<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) Utilizando citometria de fluxo

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Descrevemos aqui uma simples análise da heterogeneidade do compartimento de células B imunes da murina nos tecidos peritônio, baço e medula óssea por citometria de fluxo. O protocolo pode ser adaptado e estendido a outros tecidos do mouse.

Caracterização citométrica de fluxo do desenvolvimento de células B murinas

Este protocolo descreve uma abordagem quantitativa para medir a autoagregação microbiana usando citometria de fluxo de imagem.

Citometria de fluxo de imagem para estudar a autoagregação microbiana

Este protocolo fornece uma diretriz abrangente para a configuração e monitoramento quantitativo de co-culturas, incluindo cianobactérias secretoras de açúcar fotoautotróficas e leveduras heterotróficas.

Montagem e quantificação de coculturas combinando levedura heterotrófica com cianobactérias fototróficas secretoras de açúcar

Fornecemos uma técnica para preservar o floema intacto da árvore e prepará-lo para observação.  Criamos um aparelho chamado sanduíche de floema que permite a introdução e observação de artrópodes, micróbios e outros organismos que habitam os tecidos do floema.

Técnica de Estudos de Artrópodes e comunidades microbianas dentro Árvore Tecidos

Os animais selvagens são comumente parasitados por uma ampla gama de helmintos. Os quatro principais tipos de helmintos são "lombrigas" (nematóides), "vermes de cabeça espinhosa" (acantocéfalos), "vermes" (trematódeos) e "tênias" (cestóides). Aqui descrevemos como os helmintos são coletados de um animal vertebrado e como eles são preservados e taxonomicamente identificados.

Coleta e identificação de helmintos da vida selvagem

Aprenda a usar citometria de fluxo para analisar dinâmicas de comunidades microbianas em ecossistemas naturais e biotecnológicos. Este método permite monitoramento rápido e econômico do microbioma com amostragem em intervalos curtos.

Caracterizando Microbiome dinâmica – citometria de fluxo com base em fluxos de trabalho de culturas puras de comunidades naturais (Vídeo) | JoVE Journal

Caracterizando Microbiome dinâmica – citometria de fluxo com base em fluxos de trabalho de culturas puras de comunidades naturais

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