Name: Quantificação e Tamanho-profiling de vesículas extracelulares Usando Sintonizável resistiva Pulso Sensing (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Aprenda a quantificar e caracterizar vesículas extracelulares usando sensibilização por pulso de resistência ajustável. Este método permite análise direta em fluidos biológicos sem isolamento ou marcação prévia.

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1 Protocolo Padrão Operacional 1.1 Configuração do instrumento e Preparação de Amostras <ol><li> Conecte o instrumento a um computador com o software Izon Control Suite instalado. </li><li> Escolha o tamanho nanoporos de usar: para o tamanho e concentração de medição de EVs um NP150 (alvo da escala de tamanho 85-300 nm) ou NP200 (alvo da escala de tamanho 100-400 nm) são os mais utilizados. Quando se trabalha com veículos eléctricos que foram isolados utilizando um protocolo que envolve a remoção de VE de maiores dimensões, por exemplo, por passar a amostra através de um filtro de 220 nm, uma poro NP100 (gama alvo de tamanho 70-200 nm) pode ser utilizado. Ao trabalhar com EVs em uma amostra biológica ou EVs isolados usando um protocolo diferente, o NP200 pode ser usado, como ele vai ficar entupidos com menos frequência. Outras, tais como a nanoporos NP300 (gama de tamanhos alvo 150-600 nm) ou o NP400 (gama de tamanhos alvo 200-800 nm), ou nanoporos ainda maiores, pode ser utilizada para tipos maiores de VE. </li><li> Escolha o calibr poliestirenopartículas ation que complementam o nanopore selecionado no passo 1.1.2. Para uma NP100, NP150 e NP200 nanoporo usar o CPC100, partículas e CP100 CPC200, respectivamente. Para estimar o tamanho exato, garantir que as partículas de calibração têm um tamanho semelhante ao das partículas desconhecidas. </li><li> Para assegurar a homogeneidade das partículas de calibração, brevemente vortex (30 seg). Opcionalmente, aplicar ultra-sons para remover agregados. </li><li> Dilui-se as partículas de calibração em PBS para a concentração desejada num volume de pelo menos 40 ul. Nota: A concentração alvo varia de acordo com o nanopore selecionado no passo 1.1.2. Concentrações alvo são fornecidos com os nanoporos. </li><li> Aplicar e remover diretamente 78 mL de PBS na célula fluido inferior; esta molhagem da célula de fluido inferior reduz o risco de formação de bolhas de ar sob a nanoporo ao aplicar um electrólito para a célula, quando o fluido inferior nanoporo está em posição. </li><li> Coloque a nanoporo para os quatro braços do aparelho. Usepaquímetro para medir a distância entre dois braços opostos e introduzir a distância em mm para o &quot;Stretch&quot; campo de entrada e clique em &quot;calibrar trecho&quot; para calibrar o trecho nanoporos. </li><li> Estique os nanoporos a 47 mm, rodando a roda lateral e, assim, aumentando a distância entre os braços opostos do aparelho, antes de repetir 78 ul de PBS para a célula de fluido inferior. Nota: Interferência elétrica pode influenciar substancialmente a qualidade das medições. Ao usar um laptop para executar o software Izon Control Suite, certifique-se de que o laptop é conectado à rede elétrica usando uma tomada aterrada e plugue. Os telefones móveis mantido perto do instrumento também pode ser uma fonte de interferência eléctrica. Interferência elétrica é observado como picos constantemente utilizadas na atual linha de base, muitas vezes com raiz quadrada (RMS) Ruído&gt; 10 pA dizer. Nota: Quase todo o buffer pode ser usado para diluir partículas de calibração e EVs para TRPS caracterização. A presença de sais é um pré-requisito para o estabelecimento de uma corrente elétrica. Para as medições de VE usar como um tampão PBS. Partículas de calibração devem sempre ser diluído no mesmo tampão como os veículos eléctricos para assegurar medições precisas. </li></ol> 1.2. Determinar as configurações ideais para a medição Nota: Antes da gravação, é importante para estabelecer as configurações de medição ideais. A magnitude do bloqueio causado por uma partícula que passa através da nano-poros é dependente da extensão aplicada e da tensão aplicada. Para medições fiáveis ​​o ruído RMS deve ser &lt;10 pA eo bloqueio magnitude modo deve ser&gt; 0,1 nA. <ol><li> Colocar a célula de fluido superior e gaiola de blindagem no nanoporo e introduzir 40 ul de partículas de calibração diluídos na célula de fluido superior. Use VPM aplicar ≥0.8 pressão positiva kPa. </li><li> Reduzir o trecho aplicada lentamente para 44 milímetros, enquanto a análise dos eventos de bloqueio causados ​​pela calibraçãopartículas. Nota: Quando se reduz o diâmetro dos poros o movimento das partículas através do nanoporo será menos provável e, assim, a taxa de partículas vai diminuir. No entanto, devido ao aumento do bloqueio relativo da poro de bloqueio maior evento ocorra resultando numa melhor relação sinal-para-ruído. Aumentando a tensão pode aumentar ainda mais a magnitude do bloqueio, mas também pode aumentar o ruído RMS. </li><li> Reduzir o trecho até eventos de bloqueio apropriadas (Figura 1C) são observadas no painel &quot;Signal Trace&quot;. (Modo de&gt; 0,1 nA) e a taxa correspondente de partícula&gt; 100 / min. Nota: A taxa de partículas é um menos rigoroso de corte, no entanto, como medidas de pelo menos 500 partículas são ideais, as taxas de partículas de &lt;100 / min fará gravação durações de pelo menos 5 min. Partículas maiores do que as taxas de 2,000 / min, pode resultar em menos medições precisas (no caso presente, a diluição da amostra deve ser realizada). </li></ol> 1.3 Medição de calibraçãoPartículas, Lavagem do celular Fluid Uper e medição da amostra <ol><li> Nesta secção VE do sobrenadante da cultura celular da linha celular de glioblastoma multiforme U87-MG / EGFRvIII são caracterizados. O isolamento e a preparação desses veículos eléctricos tenha sido previamente descrito e visualizado 18. </li><li> Coloque as partículas de calibração da célula de fluido superior. Aplique uma pressão (por exemplo, 0,8 kPa) usando o VPM e gravar&gt; 500 partículas. </li><li> Se a execução de uma medição de pressão de múltiplos, aumentam a pressão aplicada (por exemplo, para 1,0 kPa) e gravar um segundo ficheiro de calibração. Nota: Um mínimo de 0,2 kPa diferença é necessária. </li><li> Retirar a amostra de calibração a partir da célula de fluido superior. Lava-se a célula de fluido superior 3 vezes com 100 ul de PBS para remover partículas residuais. Antes de introdução da amostra na célula de fluido superior, utilize tecido que não solte fiapos para remover qualquer PBS residual da célula fluido superior. </li><li> Introduzir a amostra de fluido para a célula superior. Certifique-se a corrente da linha de base é a menos de 3% da corrente da linha de base observada na medição das partículas de calibração. Se não menos de 3%, aplicam-se a estratégia descrita abaixo para estabilizar a corrente de linha de base. Aplicar as pressões exatas como aplicado às partículas de calibração e gravar os arquivos de exemplo. Nota: A taxa de trama de partículas deve apresentar detecção de partículas constante (Figura 2a). Em caso de interrupção repentina de detecção de partículas, uma queda súbita da corrente de linha de base, ou um aumento repentino na RMS de ruído, os poros podem ser obstruídos; assim, interromper a gravação. No fim de restabelecer a linha de base, da torneira ou torcer a tampa de protecção, aplicar o êmbolo, ou remover completamente os nanoporos e lavá-lo com água desionizada e substituí-la sobre o instrumento. Observação: Como alternativa, aumentar o alongamento nanoporo a 47 mm, combinada com a pressão máxima do VPM durante aproximadamente 5 min. </li></ol> Análise de Dados 1.4 <ol><li> Clique no botão &quot;; Guia Analisar dados &quot;para entrar na seção de análise do software. Processo de calibração e arquivos de exemplo clicando com o botão direito no &quot;Arquivos do processo&quot; &quot;Arquivos não processados&quot; e selecione. </li><li> Clique na caixa ao lado da amostra na coluna &quot;calibrado&quot; para acoplar os arquivos de exemplo para as gravações de calibração. Selecione os arquivos de amostra e calibração correspondentes e clique em &quot;OK&quot;. Observação: ao usar a opção de calibração multi-pressão, selecione a guia &quot;Calibração Multi-pressão&quot; sobre a esquerda para alguns vários exemplos para vários arquivos de calibração. </li><li> Uma vez acoplado com sucesso, o software de controlo Izon Suite irá apresentar diferentes características de amostras, tais como uma distribuição de tamanho (Figura 2b), a duração da linha de base, metade do valor máximo de largura total (FWHM) e uma análise de concentração. Opcionalmente: Para cada amostra, os pontos de dados individuais podem ser exportados como um arquivo separado por vírgulas. </li></ol> 2.lternative Protocol - Spiking amostras com calibração Beads Nota: Em geral, o procedimento operacional padrão pode ser utilizado quando se trabalha com EVs isoladas. Ao trabalhar com EVs não-isolados em amostras biológicas, ou preparações EV isoladas contaminados com grandes agregados de proteínas, a operação do aparelho pode ser um desafio. Estes desafios consistem principalmente de uma alta taxa de bloqueio de nanoporos (queda súbita da corrente de linha de base), impossibilidade de recuperar as correntes de linha de base dentro de 3% da medição de calibração ou diferenças significativas nas taxas de partículas entre amostras idênticas (Figura 3A). Para as amostras que apresentam estas dificuldades um protocolo alternativo para quantificar EVs foi desenvolvido 17. Esta metodologia baseia-se na introdução de grandes contas de calibração de poliestireno para a amostra de interesse (Figura 3b). Um procedimento pormenorizado para este protocolo alternativo é discutido abaixo. 2.1. AmostraPreparação Nota: Quando a preparação de amostras utilizando o método alternativo, é desejado que a estabelecer uma relação de VE-a-gota de cerca de 1 Além disso, é essencial incluir uma &quot;pérola de calibragem só&quot; amostra, para permitir &quot;gating&quot; exactas do Esferas de calibração e determinar o número de partículas de fundo (para agregados de proteína exemplo) presentes no buffer. <ol><li> Centrifugar 100 ul de sobrenadante de cultura celular durante 7 minutos a 300 xg </li><li> Adicionam-se 20 ul do sobrenadante a 20 ul de PBS e 10 uL de 75 vezes diluído 335 nm esferas de poliestireno (estoque 7e10 / ml). </li></ol> 2.2. Medição Amostra <ol><li> Use a estratégia descrita na seção 1.2 para determinar as configurações de instrumentos ideais. </li><li> Meça o &#39;talão de calibração apenas &quot;amostra em primeiro lugar. Assegure-se que a detecção de pequenas partículas de não-fundo do grânulo é a mais baixa possível (&lt;10% dos grânulos). </li><li> Meça cada indivíduo sample uma vez antes que a gravação se replica de modo a distribuir em condições de flutuação nanopore igualmente sobre as diferentes amostras. Medir pelo menos 3 repetições de cada amostra. </li><li> Meça novamente o &quot;talão de calibração apenas&quot; amostra depois de terminar a gravação de todas as amostras. </li></ol> 2.3. Análise de Dados Nota: Ao utilizar o protocolo alternativo, de uso exclusivo do software Izon Control Suite não é suficiente para o cálculo de concentração. Software de folha de cálculo adicional é necessária. Quadro 1 indica um exemplo do cálculo da concentração de amostras descritas na Figura 3. <ol><li> Abra o &quot;talão de calibração apenas&quot; amostra e um ou mais arquivos de exemplo. </li><li> Determine quais bloqueio evento tamanho (em nA) pode ser usado como um ponto de corte para a distinção entre EVs e esferas de poliestireno. Determinar o valor de bloqueio (nA), que corresponde à base esquerda da população esferas de poliestireno ( <strong&gt; Figura 3b). Nota: garantir a igualdade de configuração da caixa-tamanhos de todas as medições (pode ser ajustado em &#39;ViewSettings&#39; que é acessado clicando no botão &quot;pop-up&quot; abaixo &quot;Traço Blockade Individual&quot;). </li><li> Recuperar os valores da contagem total de partículas para cada amostra clicando na aba &quot;Análise de Partículas Resumo&quot; da amostra. </li><li> Filtre os conjuntos de dados que utilizam o nível de corte determinado no passo 2.3.2. selecionando a opção &quot;Filtragem de dados&quot; pop-up. Mostrar só partículas menores que o cut-off. </li><li> Recuperar os valores da contagem de VE para cada amostra a partir da &quot;Análise de Partículas Resumo&quot;. </li><li> Subtrair o valor de VE de partículas totais para determinar a quantidade de grânulos de calibragem. </li><li> Determinar a relação VE-a-bead, dividindo pela contagem VE contagem dos grânulos de calibração. </li><li> Determinar a relação média de fundo pela média das proporções determinadas para cada um e# 8220; talão apenas &quot;amostra de calibração. Subtrair este valor de cada amostra individual. </li><li> Multiplicar o valor ajustado da VE-a-pérola por a concentração de esferas de calibração para determinar a concentração de VE para cada amostra. </li><li> Multiplicar a concentração encontrada no passo 2.3.9 pelo factor de diluição VE introduzido pela adição de grânulos de calibração para a amostra de VE. Nota: No exemplo de configuração de exemplo, a diluição total de amostra em PBS e grânulos de calibragem é de 2,5 vezes e, portanto, a concentração encontrada no passo 2.3.9 deve ser multiplicado por 2,5 para determinar a concentração da amostra em bruto VE. </li><li> Calcular as estatísticas, como as médias, desvio padrão e erro padrão da média para cada grupo de repetições. Nota: em alguns casos, se sobrepõem entre EVs e esferas de poliestireno perfurantes é observado. Se for necessária uma correção para a subestimação da concentração EV, amostras sem esferas de poliestireno perfurantes também devem ser medidos. Use o mesmo cutfora, conforme determinado no passo 2.3.2 para determinar uma relação de &quot;pérola-a-VE&quot;, para calcular a proporção de veículos eléctricos que se encontram no intervalo de contas de poliestireno perfurantes. Esta relação de talão para VE deve ser adicionado à razão de VE-a-bead determinada no passo 2.3.8. </li></ol> 2.4. Opcional: EV Distribuição do Tamanho de utilizar o método alternativo. <ol><li> Abra uma gravação da amostra duas vezes na Suite Software de controle. </li><li> Defina as opções de filtro de uma das amostras para apenas partículas display maior do que o ponto de corte acima determinado. Isto irá exibir apenas as partículas de calibração. </li><li> Definir a amostra filtrada para &quot;arquivo de calibragem&quot; e digite o tamanho das esferas modo de calibração. </li><li> Casal do arquivo de amostra eo &quot;arquivo de calibragem&quot; criado no passo 2.4.3 conforme descrito em 1.4.2. O arquivo de amostra irá agora mostrar uma distribuição de tamanho de ambos os EVs e contas de calibração com base nas contas de calibração perfurantes. Nota: A ópera padrãoprotocolo ting na maioria das vezes suficiente para a determinação do tamanho-distribuição de EVs. Por vezes, no entanto, os componentes do tampão exactas não são conhecidas (por exemplo, no plasma ou urina), o que torna impossível preparar uma amostra de grânulos de calibração no mesmo tampão como os veículos eléctricos de interesse. Uma amostra enriquecida com partículas de VE de calibração pode ser usado para a VE-estimativa tamanho nestas condições específicas. </li></ol>

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O desenvolvimento do protocolo apresentado e da escrita deste manuscrito foi apoiado financeiramente, em parte, pela Fundação holandesa Cérebro, Schumacher Fundação Kramer, eo Fundo Bohnenn. A produção deste vídeo-artigo foi parcialmente sponsorted por Izon.

Os protocolos descritos neste metodologias oferta manuscrito para quantificação e caracterização do tamanho de EVs usando TRP. As principais vantagens da plataforma TRP são o pequeno tamanho da amostra, duração da medição relativamente curto ea ausência de manipulação de amostra necessário. Pré-requisito para a medição TRPS preciso é manter condições idênticas entre calibração e amostras de medições. Isso engloba o uso de tampões idênticos, bem como as configurações do instrumento idênticas, tais como tamanho nanoporos, tensão e pressão aplicada. O VPM inicial carece de um mecanismo de ajuste exacto da pressão aplicada, fazendo assim com que pequenas diferenças na pressão aplicada entre as amostras. Além disso, a evaporação do fluido de escorvamento no VPM pode induzir pequenas diferenças de pressão quando a medição em diferentes pontos de tempo e, por conseguinte, o VPM deve frequentemente ser re-condicionadas. Estas limitações foram potencialmente resolvidos pela introdução do VPM2, quetem um aumento de escala baseado clique, e baseia-se pressão de ar. O protocolo alternativo descrito neste artigo é particularmente adequado para a medição de VE em amostras biológicas não purificadas 17. Acreditamos que os componentes do tampão, tais como, açúcares, lípidos, proteínas e outros detritos maiores, pode, em alguns casos, influenciar as condições de medição demais para o protocolo padrão a ser aplicável. A adição de contas de calibração para a amostra em vez de comparar duas medidas separadas introduz &#39;calibração em tempo real &quot;. Este método é especialmente adequado quando se comparam as amostras (por exemplo, plasma de sangue de dadores diferentes que têm diferentes) e / ou desconhecidos conteúdo fundo fluídicos. Embora existam diferenças entre os EVs e partículas de poliestireno (por exemplo, densidade de partículas e de carga superficial), modelos teóricos, bem como dados experimentais ressaltam a usabilidade de esferas de poliestireno para a quantificação eo tamanho de perfis de EVs,sob a condição de que a pressão é aplicada significativa 15,19. Para minimizar a influência de forças eletrocinéticos, o uso do relativamente maior NP150 / NP200 nanoporos e pressão positiva significativa é aconselhável. EVs e contas de calibração são distinguidos pelo tamanho. Por conseguinte, o nanoporo tem de ser aberto por aplicação de estiramento, para um diâmetro, onde é observada a detecção de ambos os veículos eléctricos e as partículas maiores de calibração. Uma vez que a abertura do poro irá diminuir a sensibilidade em relação a partículas mais pequenas, só EVS maior do que um certo tamanho está gravado (geralmente VE&gt; 120 nm, quando se utiliza um cordão de calibração 335 nm). O limite mínimo de detecção de veículos eléctricos pode ser reduzida para cerca de 90 nm, utilizando 203 nm em grânulos de calibragem de um nanoporo NP150. No entanto, essa configuração pode ser inviável quando EVs maiores induzir obstrução freqüente do nanopore. A presença destes VE obstruindo pode obrigar à utilização de uma configuração em que uma população de VE, demasiado pequena para reach o limiar de detecção, e não será detectado. A dificuldade de operar o sistema aumenta quando se tenta medir partículas menores do que 100 nm em tamanho. Em tais casos, a detecção pode ser melhorada aumentando a concentração de sal de electrólito. Um aumento da concentração de iões irão induzir o aumento relativamente grandezas bloqueio de partículas pequenas (maior relação sinal-ruído). A viabilidade desta técnica para medições de EVs tem de ser validado, porém, como concentrações elevadas de sal pode influenciar o volume de EVs. Em conclusão, a plataforma de PG pode ser utilizado para a quantificação directa e caracterização do tamanho do VE. Uma vez que não é necessário qualquer isolamento ou manipulação VE (anticorpo rotulagem de ligação ou fluorescente), a plataforma é adequado para a quantificação directa VE em fluidos biológicos. Um protocolo alternativo está previsto que pode ser benéfico para as amostras em que os componentes do tampão induzir cloggin poro significativaeventos g, tornando a utilização segura do protocolo padrão inviável.

As vesículas de origem celular são muito abundantes nos fluidos corporais 1. Essas vesículas chamadas extracelulares (VE) (50 - 1000 nm em tamanho) são formados por fusão de corpos ou de multi-vesicular com a membrana celular ou por brotamento directo no exterior da membrana celular. Nos últimos anos, o interesse científico em EVs aumentou consideravelmente, resultando em uma infinidade de publicações com foco no EV, em que novas funções e características de EVs são descritos 1. VE estão agora acreditava estar envolvido numa grande variedade de processos fisiológicos e patológicos tais como a transdução de sinal, regulação imune, e a coagulação do sangue 1-4. No cancro, VE parecem desempenhar um papel na formação de nichos premetastatic 5,6, transferência de conteúdo pró-canceroso 7,8 e estimulação da angiogénese 8. Além disso, VE são explorados como agentes de entrega de agentes terapêuticos 9. Apesar destes developments, quantificação confiável de EVs continua sendo um desafio. Tradicionalmente, são utilizados métodos de quantificação indiretos, que contam com a quantificação do teor de proteína total ou proteínas específicas. Embora amplamente utilizado, estas técnicas não são responsáveis ​​por diferenças proteína-per-EV, e não discriminam entre contaminando agregados proteicos e proteínas em EVs. Além disso, essas técnicas requerem isolamento de veículos eléctricos, que em muitos casos torna a comparação das concentrações de VE em amostras biológicas impossível. Portanto, os esforços são empreendidos para desenvolver novos métodos que permitem a medição EV mais precisa e direta 10. Este relatório descreve o uso de sensoriamento pulso ajustável resistiva (TRP) para a quantificação confiável e tamanho de perfis de EVs. Actualmente, o qNano instrumento (Figura 1a) é a plataforma única disponível comercialmente para PG. Em TRP, uma membrana elástica não-condutor pontuado with um poro de tamanho nano está separando duas células do líquido. Uma das células do fluido é enchido com a amostra de interesse, enquanto que a outra célula é preenchido com electrólito livre de partículas. Através da aplicação de uma tensão, uma / fluxo de corrente eléctrica é estabelecida iónico, que é alterado no momento da transferência das partículas através do poro (Figura 1b). A magnitude deste bloqueio actual (&#39;pulso resistiva&#39;) é proporcional ao volume da partícula 11 (Figura 1c). A duração do bloqueio pode ser utilizada para avaliar o potencial zeta das partículas, que se baseia em características das partículas, tais como a carga ou a forma 12. Tamanho das partículas de perfis desconhecidos pode ser realizada por comparação dos impulsos resistivos causadas pelas partículas desconhecidas, com os impulsos de resistivos causadas por partículas de calibração com um diâmetro conhecido. Além da magnitude de um evento de bloqueio, a taxa de que estes ocorrem é medido. Esta taxa contagem relies relativas a concentração de partículas. Uma vez que a concentração e taxa de bloqueios são linearmente proporcional 13, usando uma única amostra de calibração com partículas de concentração conhecida e tamanho de partícula permite a medição da concentração de 14 e 11 de distribuição de tamanho de uma amostra desconhecida. O movimento das partículas através do nanoporo é determinado por electro kinetic- forças electroforéticas (e electro-osmótico) e fluidos 15. Ao utilizar o módulo de pressão variável (VPM) de uma diferença de pressão entre as células do líquido pode ser induzida como uma força adicional. Aplicando pressão positiva aumenta a taxa de fluxo de partículas, o que pode ser benéfico quando a concentração das partículas é baixa. Além disso, a pressão pode ser aplicada para reduzir o efeito das forças de electro-cinético. Isto é especialmente importante quando se utiliza nanoporos com diâmetro pequeno em relação poro (NP100, NP150 e NP200 possivelmente) utilizado com freqüência para a detecção de EVs.Para esses nanoporos, mesmo quando se aplica uma pressão significativa, as forças eletro-cinética pode, dependendo da carga da superfície da partícula, permanecem nonnegligible 16. Através da medição da taxa de partículas em várias pressões, uma electro-cinético corrigido, e, portanto, mais precisos, a concentração EV pode ser calculado. Aqui, os protocolos detalhados são fornecidos para determinar a distribuição do tamanho e concentração de veículos eléctricos. Junto ao protocolo de funcionamento regular, uma abordagem alternativa é descrito onde as amostras são incrementadas com esferas de poliestireno de tamanho e concentração de 17 conhecido. Esta técnica de calibração em tempo real pode ser utilizado para ultrapassar alguns dos problemas técnicos encontrados quando se mede os VE directamente em fluidos biológicos, tais como urina, plasma e sobrenadante de cultura celular, ou quando a estabilidade do nanoporo durante um longo período de tempo de medição não pode ser assegurada.

<table><tbody><tr><td><a href="http://www.izon.com/trps-with-qnano/">qNano instrument</a></td><td>Izon Science Ltd.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td><a href="http://www.izon.com/products/components-and-consumables/vpm/">Módulo de pressão variável</a></td><td>Izon Science Ltd.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td><a href="http://www.izon.com/products/components-and-consumables/nanopores/">Nanopore</a></td><td>Izon Science Ltd.</td><td>NP100, NP200</td><td>A escolha do nanoporo varia de acordo com a partícula alvo. Diferentes nanoporos estão disponíveis para diferentes tamanhos de alvo.</td></tr><tr><td>Calibração de Partículas</td><td>Izon Science Ltd.</td>As partículas de calibração <td>CPC100, CPC200, CPC400</td><td>estão disponíveis em diferentes tamanhos.</td></tr><tr><td>Banho de sonicação</td><td>Múltiplo disponível</td><td></td><td>O banho básico de sonicação é suficiente</td></tr> <tr><td>(Mini) vórtice</td><td>Vários disponíveis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecidos sem elevação</td><td>Múltiplos disponíveis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td> <td>Vários disponíveis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computador</td><td></td><td></td><td></td>baseado</tr><tr><td>em Windows Izon Control Suite 2.2</td><td>Ciência Izon Ltda.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Software de planilha</td><td>Múltiplos disponíveis</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificação e tamanho-profiling de vesículas extracelulares usando sintonizável resistiva pulso sensing

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Vesículas extracelulares (SVE), incluindo &#39;microvesículas&#39; e &#39;exossomos &quot;, são muito abundantes em fluidos corporais. Nos últimos anos temos assistido a um tremendo aumento no interesse em EVs. VE demonstraram desempenhar um papel importante em vários processos fisiológicos e patológicos, incluindo a coagulação, as respostas imunes e cancro. Além disso, VE têm potencial como agentes terapêuticos, por exemplo, como veículos de entrega de drogas, ou como a medicina regenerativa. Por causa de seu pequeno tamanho (50 a 1000 nm) quantificação precisa e tamanho de perfis de EVs é tecnicamente desafiador. Este protocolo descreve como sintonizável de detecção de impulsos tecnologia resistiva (PG), utilizando o sistema de qNano, pode ser utilizado para determinar a concentração e tamanho de veículos eléctricos. O método, que se baseia na detecção de veículos eléctricos sobre a sua transferência através de um poro de tamanho nanométrico, é relativamente rápido, é suficiente a utilização de pequenos volumes de amostra e não requer a purificação e concentração de EVs. Próxima ao protocolo de funcionamento regular de uma abordagem alternativa é descrita usando amostras contendo esferas de poliestireno de tamanho e concentração conhecida. Este tempo real técnica de calibração podem ser utilizadas para superar problemas técnicos encontrados quando os VE medindo directamente em fluidos biológicos.

Para utilizar o instrumento PG, um nanoporo não condutor tem de ser colocado nas quatro braços da máquina (Figura 1-A) e uma voltagem (Figura 1b) tem de ser aplicado. Uma vez que uma corrente eléctrica da linha de base é estabelecida, pulsos resistivos causadas por partículas que passam através dos poros vai ser detectado, tal como ilustrado na Figura 1c. VE foram purificados a partir do sobrenadante de cultura de células da linha de células de glioblastoma U87-MG / EGFRvIII por ultracentrifugação. Uma partícula de taxa de trama estável é observado quando se mede os veículos eléctricos isolados (Figura 2a) em um nanoporo NP100. Esta partícula de taxa de trama estável é necessário para uma medição da concentração do VE fiável. Após o emparelhamento da gravação VE-amostra para uma gravação de 115 nm de calibração de poliestireno, esferas de uma distribuição de tamanho (Figura 2b) e estimar a concentração do VE-amostra pode ser obtida (dados não mostrados). <p class= &quot;&quot;&gt; VE jove_content também foram quantificados directamente em cultura de células de glioblastoma sobrenadante. Ao medir EVs em amostras biológicas, nanoporos entupimento muitas vezes resulta em interrupções e / ou flutuações nas parcelas da taxa de partículas (Figrue 3a). Isso resulta em estimativas de concentração EV imprecisas. Ao cravar a amostra com esferas de poliestireno de tamanho e concentração conhecida, uma relação VE-a-esferas pode ser determinada. Figura 3b ilustra os resultados obtidos após a cultura sobrenadante de células com esferas de poliestireno de cravação de 335 nm de tamanho. Duas populações claras são observados. As partículas que induzem um bloqueio de menos de 0,46 nA são determinados EVs, as partículas maiores são determinadas esferas de poliestireno. A proporção de VE para esferas de poliestireno é usado para calcular a concentração de matéria-VE (Tabela 1). Figura 3c ilustra o cálculo do tamanho das duas populações com base nos grânulos de poliestireno perfurantes. A re configuração nanoporos usadoconsultados na detecção de VE&gt; 140 nm em tamanho. Este pode ser reduzido através da redução da abertura nanoporo, no entanto, isto irá também resultar em mais eventos de entupimento. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1: qNano instrumento e modo de funcionamento. (A) Fotografias do instrumento. Um nanoporo é posicionado no aparelho, a separação de uma célula de fluido inferior de uma célula de fluido superior. As células do líquido são protegidos de interferências elétricas ambiental pela tampa de proteção. (B) Ilustração delineando ajustável sensor de pulso resistiva (TRP). A nanoporos elástico não-condutor é separar duas células do líquido. Através da aplicação de uma tensão de uma corrente eléctrica é estabelecida através da poro furado no nanoporo. Como vesículas extracelulares mover através do nanoporo, o fluxo iónico é alterada e detectada como um pulso resistiva. Em TRP o tamanho da abertura pode ser nanoporo sintonizado (redução ou aumento), alongando a nanoporo, aumentando a distância entre os braços opostos do instrumento, ou reduzir esta distância. (C) Exemplo ilustrativo de pulsos resistivos. A magnitude de um único pulso resistiva é proporcional ao volume da partícula:. Pulsos maiores indicam partículas maiores <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig1highres.jpg" target="_blank">por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2: Particle contar-enredo e tamanho distribuição obtida a partir da medição EVs isoladas de U87-MG / EGFRvIII sobrenadante de cultura de células (A) Particle contar-plot indicando detecção geral de partículas constante.. Breve redução de particObservou-se detecção le entre 80 e 100 segundos de gravação. Após interromper a gravação e batendo na tampa de proteção, a taxa estabilizou depois de partículas que a gravação foi retomada. (B) A distribuição de tamanho de EVs isoladas é traçado depois de calibrar a amostra desconhecida (EVs) a 115 nm esferas de calibração de poliestireno. (5 nm tamanho bin). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3: TRPS quantificação de EVs em cultura celular sobrenadante utilizando o protocolo alternativo. (A) tramas de taxa de partículas típicos, obtidos durante a medição VE directamente num fluido biológico. Entupimento dos poros provoca breves interrupções e flutuações na taxa de detecção de partículas. Cadatrama representa uma medição repetição da mesma amostra. gráficos (B) três réplicas de distribuição de tamanho das células obtidas após a cultura sobrenadante picos com 335 nm grânulos de calibração de poliestireno. Todas as partículas que induzem um pulso resistiva de menos de 0,46 nA são seleccionados como VE. (C) As esferas de poliestireno cravado podem ser utilizados para se obter um tamanho de distribuição da amostra. (5 nm tamanho bin). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Medição </td><td> Só Calibração # 1 </td><td> Só Calibração # 2 </td><td> Sobrenadante # 1 </td><td> Sobrenadante # 2 </td><td> Sobrenadante # 3 </td></tr><tr><td> Corrente média (NA) </td><td> 117 </td><td> 120 </td> &lt;td&gt; 116 </td><td> 118 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> Taxa de Partículas </td><td> 172 </td><td> 194 </td><td> 250 </td><td> 246 </td><td> 196 </td></tr><tr><td> corte utilizado (NA) </td><td> 0,46 </td><td> 0,46 </td><td> 0,46 </td><td> 0,46 </td><td> 0,46 </td></tr><tr><td> Total de partículas </td><td> 303 </td><td> 317 </td><td> 489 </td><td> 488 </td><td> 454 </td></tr><tr><td> Vesículas extracelulares </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 213 </td><td> 215 </td><td> 213 </td></tr><tr><td> Grânulos de calibragem cravado </td><td> 300 </td><td> 316 </td><td> 276 </td><td> 273 </td><td> 241 </td></tr><tr><td> EVs / contas de calibração </td><td> 0,01 </td><td> 0.003 </td><td> 0,772 </td><td> 0,788 </td><td> 0.884 </td></tr><tr><td> Amostra - fundo </td><td></td><td></td><td> 0.765 </td><td> 0,781 </td><td> 0,877 </td></tr><tr><td> Vesículas extracelular (10 7) / Ml </td><td></td><td></td><td> 7.14 </td><td> 7,29 </td><td> 8.18 </td></tr><tr><td> Amostra 2.5x diluído </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> EVs concentração Raw (10) 7 / ml </td><td></td><td></td><td> 17.85 </td><td> 18.22 </td><td> 20.46 </td></tr></tbody></table> Tabela 1:. Cálculo Exemplo de concentração EV usando o protocolo alternativo Um valor de cut-off é determinado para distinguir os VE de grânulos de calibragem. Posteriormente, o número total de veículos eléctricos e os grânulos podem ser recuperados. Para cada medição do rácio de VE-a-pérola é calculada. A quantidade de partículas de base do electrólito (por exemplo, os agregados de proteína) é calculada a média da razão de VE-a-pérola para as medições individuais da &#39;apenas grânulos de calibragem de&#39; amostra. Para cada amostra, o rácio de fundo é subtraído a partir do índice obtido. Este adjusterelação d é multiplicado pela concentração dos grânulos de calibração para a amostra (neste exemplo: 9.33e7 / ml). Para determinar a concentração de matéria-VE, a concentração obtida é multiplicada pelo factor de diluição total VE (neste exemplo: 2,5).

Vesículas extracelulares desempenham papéis importantes em processos fisiológicos e patológicos, incluindo a coagulação, as respostas imunes e cancro ou como agentes terapêuticos potenciais na entrega da droga ou medicina regenerativa. Este protocolo apresenta métodos para a quantificação e caracterização tamanho de vesículas extracelulares isolados e não-isolados em vários fluidos usando ajustável sensor de pulso resistiva.

Quantificação e Tamanho-profiling de vesículas extracelulares Usando Sintonizável resistiva Pulso Sensing

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

O objetivo geral do experimento a seguir é quantificar e determinar o perfil de tamanho de vesículas extracelulares utilizando a técnica de detecção resistiva ajustável por pulso. A abordagem padrão consiste em comparar as medidas de bloqueio de corrente obtidas a partir de vesículas extracelulares purificadas com aquelas obtidas a partir de padrões de microesferas de poliestireno. Uma segunda abordagem para caracterização de vesículas extracelulares é adicionar microesferas de poliestireno à amostra, método utilizado ao trabalhar com amostras complexas, como vesículas extracelulares não purificadas.No meio de cultura celular, os dados resultantes caracterizam o tamanho e o número das vesículas extracelulares, sejam elas purificadas ou não purificadas. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o western blot ou a citometria de fluxo de vesículas extracelulares ligadas a microesferas de látex, é que este método caracteriza diretamente as partículas em fluidos biológicos, sem necessidade de isolamento físico ou marcação. Geralmente, indivíduos novos no método enfrentarão dificuldades porque as vesículas extracelulares são heterogêneas em tamanho.Ao tentar detectar vesículas menores, vesículas maiores podem entupir o nanoporo. Incluímos algumas dicas e truques práticos ao protocolo para retornar rapidamente a condições viáveis. Tentamos reduzir a produção de vesículas extracelulares e precisávamos de um método para quantificar a concentração de vesículas em cultura celular.Snet.Na busca por métodos para caracterizar nanopartículas, encontramos a TRPS e modificamos seus protocolos para torná-los mais adequados à caracterização de sobrenadantes de culturas celulares e outros fluidos biológicos. Comece conectando o instrumento TRPS a um computador com o software Eyes on Control Suite instalado. Certifique-se de minimizar interferências elétricas, conforme discutido no protocolo textual.Agora, escolha o tamanho do nanoporo. Um NP 100 é a melhor opção para vesículas de 70 a 200 nanômetros, enquanto um NP 150 pode ser usado para vesículas de 85 a 300 nanômetros. Um NP 200 é mais adequado para medir vesículas de 100 a 400 nanômetros.Em seguida, selecione as partículas de calibração de poliestireno complementares para a NP 100 e NP 150; selecione as partículas de calibração CPC 100 para a NP 200. Utilize partículas de calibração CPC 200. Vortexe as partículas de calibração por 30 segundos.Se ainda estiverem agregados, utilize sonicação e, em seguida, dilua as partículas de calibração em PBS até a concentração desejada. Com base no tamanho dos nanoporos, o volume final deve ser de pelo menos 40 microlitros. Agora, umedeça a câmara de fluido inferior do instrumento aplicando 78 microlitros de PBS e removendo-os imediatamente.Isso reduz o risco de formação de bolhas sob o nanoporo. Em seguida, coloque o Nanopore nos braços do instrumento. Meça a distância entre os dois braços opostos utilizando paquímetros digitais.Insira este valor no software no campo denominado alongamento e, após inserido, clique em calibrar alongamento utilizando a roda lateral que controla a distância entre os braços opostos. Estique o nanoporo até 47 milímetros. Após atingir o tamanho desejado, reaplique 78 microlitros de PBS na célula de fluido inferior.Inicie o processo de calibração colocando a célula de fluido superior sobre a nanoporosidade e fixando a gaiola de proteção. Em seguida, adicione 40 microlitros de partículas de calibração diluídas na célula de fluido superior. Aplique agora uma pressão positiva de pelo menos 0,8 quilopascal.Usando o módulo de pressão variável ou VPM, selecione uma voltagem positiva e clique em ligar. Em seguida, reduza lentamente o estiramento enquanto analisa o bloqueio. Eventos causados pelas partículas de calibração.À medida que o estiramento diminui, a altura do bloqueio aumentará gradualmente e, consequentemente, a relação sinal-ruído melhorará. Aumentar a voltagem também pode elevar a altura do bloqueio, mas pode gerar mais ruído RMS. Pare de reduzir o estiramento quando os bloqueios observados ultrapassarem adequadamente os níveis de fundo, conforme observado no painel de traçado do sinal.Em segundo lugar, observe a taxa de partículas. No entanto, esse valor tem um limite menos rigoroso. A taxa de partículas deve ser idealmente de pelo menos 100 por minuto.No entanto, se a taxa de partículas for superior a 2000 por minuto, dilua a amostra e recalcibre o instrumento. Uma taxa tão elevada pode levar a medições imprecisas nesta demonstração. Vesículas extracelulares previamente purificadas de uma linhagem celular de tumor cerebral são caracterizadas.Inicie carregando as partículas de calibração na câmara superior da célula de fluido. Ligue e, em seguida, aplique pressão utilizando o VPM e registre aqui pelo menos 500 partículas de dados. Uma pressão de 0,8 quilopascal é aplicada.Opcionalmente, uma medição com múltiplas pressões também pode ser realizada para isso: aumente a pressão aplicada e registre um segundo arquivo de calibração. Os incrementos de pressão devem ser de pelo menos 0,2 quilopascal agora; remova a amostra da célula superior e lave a célula três vezes com 100 microlitros de PBS por lavagem. Após as lavagens, seque a célula fluida superior com papel livre de fiapos.Adicione a seguir a amostra experimental. A corrente de base deve estar dentro de 3% da corrente observada ao medir as partículas de calibração. Caso contrário, bata levemente ou gire a tampa de proteção, aplique o êmbolo ou remova completamente o nanoporo e lave-o com água desionizada.Se a corrente observada for boa, aplique exatamente as mesmas pressões utilizadas nas partículas de calibração. Em seguida, registre pelo menos 500 partículas e salve o arquivo de dados. Se houver uma interrupção súbita na detecção de partículas, uma queda na corrente de base ou um aumento súbito no ruído RMS, pause a gravação e tente desobstruir o nanoporo.Como antes, pipete a amostra para cima e para baixo. Bata ou gire a tampa protetora, aplique o êmbolo ou remova completamente o nanoporo e lave com água desionizada. Outra estratégia é aumentar o alongamento do nanoporo até 47 milímetros e maximizar a pressão do VPM por cerca de cinco minutos.Como isso também pode desconectar o NPO no software. Vá até a guia analisar dados e comece a processar os dados clicando com o botão direito na opção de arquivos não processados e selecione a opção processar arquivos. Em seguida, para associar os arquivos de amostra e de calibração, clique na caixa de seleção ao lado da amostra.Na coluna calibrada, selecione os arquivos correspondentes e confirme. As opções. O software exibirá diferentes características da amostra, como tamanho, distribuição, duração da linha de base, largura total, valores máximos em meia altura e análises de concentração.O seguinte procedimento é utilizado para amostras como fluidos biológicos que causam entupimento excessivo com o método padrão de preparação: centrifugue pelo menos 50 microlitros de cultura celular. Colete o sobrenadante contendo as vesículas extracelulares por sete minutos a 300 Gs. Prepare também um controle com meio sozinho da mesma forma, tanto para a amostra quanto para o controle. Transfira 20 microlitros do sobrenadante para novos tubos e adicione 20 microlitros de PBS e 10 microlitros da solução estoque diluída de esferas de poliestireno de 335 nanômetros, com 10 milhões de esferas por mililitro.Agora, configure o instrumento como antes, utilizando um Nanoporos NP 200 e meça a amostra controle contendo apenas microesferas no meio. Primeiro, para garantir precisão, a detecção de fundo de partículas pequenas não relacionadas às microesferas deve ser minimizada para menos de 10% das detecções de microesferas. Em seguida, meça cada amostra uma vez antes de registrar as réplicas.Isso distribuirá as condições flutuantes dos nanoporos entre as amostras. Cada amostra deve ser medida três vezes, finalizando com a remedição da amostra contendo apenas as microesferas de calibração. Posteriormente, durante a análise dos dados, utilize um software de planilha eletrônica para realizar os cálculos de concentração.Um exemplo de cálculo está incluído no protocolo escrito. Vesículas extracelulares foram purificadas a partir do sobrenadante de cultura celular de U 87 M-G-E-G-F-R-V três, por ultracentrifugação, e então medidas utilizando o protocolo descrito com esferas de calibração de 115 nanômetros. Uma distribuição de tamanho para as vesículas extracelulares foi obtida.As vesículas extracelulares também foram quantificadas diretamente a partir do sobrenadante de cultivo celular de glioblastoma, utilizando a abordagem alternativa que adiciona ao exemplo um padrão conhecido. Duas populações de nanopartículas foram observadas. As vesículas extracelulares menores e o padrão maior conhecido, com a estimativa de tamanho das duas populações baseada no padrão conhecido, identificaram a população de vesículas como maior que 140 nanômetros.Vesículas extracelulares menores podem ter sido detectadas utilizando uma abertura de nanoporo menor, mas teria havido mais entupimentos. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em uma a quatro horas, dependendo do número de amostras analisadas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que as amostras podem exigir ajustes septais ao protocolo.Por exemplo, amostras constituídas por vesículas maiores podem exigir o uso de nanoporos maiores com alongamento relativamente elevado, e os procedimentos de medição podem ser facilitados pela filtração ou centrifugação das amostras para remover detritos celulares, que podem obstruir o nanoporo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como caracterizar vesículas extracelulares utilizando TRPS. Dependendo da sua amostra de vesículas extracelulares, você pode aplicar o protocolo padrão ou utilizar o método ajustado de adição de padrão interno.

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Este trabalho propõe uma nova geração de plataformas analíticas multiparamétricas com maior rendimento para a caracterização de subconjuntos de vesículas extracelulares. O método é baseado em uma combinação de métodos de biossensoriamento multiplexado com análises metrológicas e morfomecânicas por microscopia de força atômica, juntamente com espectroscopia Raman, para qualificar alvos vesiculares presos em um biochip de microarray.

Plataforma Analítica Multimodal em um Chip de Ressonância de Plasmon de Superfície Multiplexada para a Análise de Subconjuntos de Vesículas Extracelulares

Apresentamos aqui um método para fenótipo mecânico de células individuais usando uma plataforma microfluídica baseada em eletrônica chamada detecção de mechano-node-pore (mechano-NPS). Esta plataforma mantém um rendimento moderado de 1-10 células/s enquanto mede as propriedades biofísicas elásticas e viscosas das células.

Mechano-Node-Pore Sensing: Uma plataforma rápida e sem rótulos para medições viscoelásticas de célula única multiparâmetro

Aqui, demonstramos o método de caracterização de vesículas extracelulares (EVs) coletadas de fluidos biológicos, como lágrimas e saliva, de seres humanos. O scanner usado neste método é capaz de detectar o fenótipo, tamanho e contagem total de partículas de EVs a partir de 1 μL da amostra.

Caracterização de Vesículas Extracelulares a partir de Fluidos Biológicos

Aqui, apresentamos um protocolo para analisar pequenas vesículas extracelulares individuais (sEVs) usando espectroscopia Raman aprimorada superficial sem marcação (SERS), possibilitando diagnósticos minimamente invasivos de doenças e avaliação de sEVs como veículos terapêuticos de entrega.

Explorando a Aplicação da Biosensição Baseada em Espalhamento Raman Aprimorado em Superfícies de SEVs individuais no diagnóstico e terapêuticas de doenças

A espectroscopia Raman é uma técnica adequada para o contato não, rótulo sem análise de células vivas, tecidos engenharia de construções e tecidos nativos. Fonte específicos impressões digitais espectrais podem ser gerados e analisados ​​utilizando análise multivariada.

Sem contato, Monitoramento Label livre de células e matriz extracelular utilizando Espectroscopia Raman

Aprenda a quantificar e caracterizar vesículas extracelulares usando sensibilização por pulso de resistência ajustável. Este método permite análise direta em fluidos biológicos sem isolamento ou marcação prévia.

Quantificação e Tamanho-profiling de vesículas extracelulares Usando Sintonizável resistiva Pulso Sensing

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