Quantificação e Tamanho-profiling de vesículas extracelulares Usando Sintonizável resistiva Pulso Sensing

O objetivo geral do experimento a seguir é quantificar e dimensionar o perfil de vesículas extracelulares usando detecção de pulso resistivo sintonizável. A abordagem padrão é comparar as medições de bloqueio de corrente feitas de vesículas extracelulares purificadas com aquelas tiradas de padrões de esferas de poliestireno. Uma segunda abordagem para caracterizar vesículas extracelulares é cravar a amostra com esferas de poliestireno, que são usadas ao trabalhar com amostras complexas, como vesículas extracelulares não purificadas.

No meio de cultura celular, os dados resultantes caracterizam o tamanho e o número das vesículas extracelulares, sejam elas purificadas ou não purificadas. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como western blotting ou citometria de fluxo de vesículas ex extracelulares ligadas a esferas de látex, é que esse método caracteriza as partículas diretamente em fluidos biológicos sem a necessidade de isolamento físico ou rotulagem. Geralmente, os indivíduos novos no método terão dificuldades porque as vesículas extracelulares são heterogêneas em tamanho.

Ao tentar detectar as vesículas menores, vesículas maiores podem obstruir o nanoporo. Adicionamos algumas dicas e truques práticos ao protocolo para retornar rapidamente às condições viáveis. Tentamos reduzir a produção de vesículas extracelulares e precisávamos de um método para quantificar a concentração de vesículas em cultura de células. Snet.

Em busca de métodos para caracterizar nanopartículas de nanos, encontramos o TRPS e modificamos seus protocolos para serem mais adequados para caracterização de sles e cultura de células. S sobrenadantes e outros fluidos biológicos Comece conectando o instrumento TRPS a um computador com os olhos no software do conjunto de controle instalado nele. Certifique-se de minimizar a interferência elétrica conforme discutido no protocolo de texto.

Agora, escolha o tamanho do Nanopore. Um NP 100 é a melhor escolha para vesículas de 70 a 200 nanômetros, enquanto um NP 150 pode ser usado para vesículas de 85 a 300 nanômetros. Um NP 200 é mais adequado para medir vesículas de 100 a 400 nanômetros.

Em seguida, selecione as partículas de calibração de poliestireno complementares para o NP 100 e NP 150, selecione as partículas de calibração CPC 100 para o NP 200. Use partículas de calibração CPC 200. Vortex as partículas de calibração por 30 segundos.

Se ainda estiverem agregados, use a sonicação e dilua as partículas de calibração em PBS até a concentração alvo. Com base no tamanho do nanoporos, o volume final deve ser de pelo menos 40 microlitros. Agora molhe a célula de fluido inferior do instrumento aplicando 78 microlitros de PBS e removendo-o imediatamente.

Isso reduz o risco de formação de bolhas sob o nanoporo. Em seguida, coloque o Nanopore nos braços do instrumento. Meça a distância entre os dois braços opostos usando paquímetros digitais.

Insira esse valor no software no campo chamado stretch e, uma vez inserido, clique em calibrar stretch usando a roda lateral que controla a distância entre os braços opostos. Estique o nanoporo para 47 milímetros. Depois de esticado ao tamanho certo, reaplique 78 microlitros de PBS na célula de fluido inferior.

Inicie o processo de calibração colocando a célula de fluido superior no nanoporo e anexando a gaiola de blindagem. Em seguida, adicione 40 microlitros de partículas de calibração diluídas na célula de fluido superior. Agora aplique pelo menos 0,8 quilopascals de pressão positiva.

Usando o módulo de pressão variável ou VPM, selecione um volume positivotage e clique em ligar. Em seguida, reduza lentamente o alongamento enquanto analisa o bloqueio. Eventos causados pelas partículas de calibração.

À medida que o alongamento diminui, a altura do bloqueio aumentará gradualmente e a relação sinal-ruído melhorará. Aumentar a tensão também pode aumentar a altura do bloqueio, mas também pode gerar mais ruído RMS. Pare de reduzir o alongamento quando os bloqueios observados ultrapassarem adequadamente os níveis de fundo, conforme observado no painel de rastreamento de sinal.

Em segundo lugar, observe a taxa de partículas. No entanto, isso tem um corte menos rigoroso. Idealmente, a taxa de partículas deve ser de pelo menos 100 por minuto.

No entanto, se a taxa de partículas for superior a 2000 por minuto, dilua a amostra e recalibre o instrumento. Uma taxa tão alta pode levar a medições imprecisas para esta demonstração. Vesículas extracelulares previamente purificadas de uma linhagem de células tumorais cerebrais são caracterizadas.

Comece carregando as partículas de calibração na prensa de célula de fluido superior. Ligue e aplique pressão usando o VPM e registre pelo menos 500 partículas de dados aqui. Uma pressão de 0,8 quilopascal é aplicada.

Opcionalmente, uma medição de pressão múltipla também pode ser feita para fazer isso, aumentar a pressão aplicada e registrar um segundo arquivo de calibração. Os incrementos de pressão devem ser de pelo menos 0,2 quilopascals agora, remova a amostra da célula superior e lave a célula três vezes com 100 microlitros de PBS por lavagem. Após as lavagens, limpe a célula de fluido superior com papel sem fiapos.

Adicione a amostra experimental a seguir. A corrente de linha de base deve estar dentro de 3% da corrente observada ao medir as partículas de calibração. Caso contrário, bata ou gire a tampa de blindagem, aplique o êmbolo ou remova completamente o nanoporo e lave-o com água.

Se a corrente observada for boa, aplique exatamente as mesmas pressões aplicadas às partículas de calibração. Em seguida, registre pelo menos 500 partículas e salve o arquivo de dados. Se houver uma interrupção repentina da detecção de partículas, uma queda na corrente de linha de base ou um aumento repentino no ruído RMS, pause a gravação e tente desobstruir o nanoporo.

Como antes, pipete a amostra para cima e para baixo. Bata ou gire a tampa de blindagem, aplique o êmbolo ou remova completamente o nanoporo e lave-o com água DI. Outra estratégia é aumentar o alongamento dos nanoporos em até 47 milímetros e maximizar a pressão do VPM por cerca de cinco minutos.

Como isso também pode UNC desconectar o NPO no software. Vá para a guia analisar dados e comece a processar os dados clicando com o botão direito do mouse na opção de arquivos não processados e selecione a opção processar arquivos. Em seguida, para acoplar a amostra e os arquivos de calibração, clique na caixa de seleção ao lado da amostra.

Na coluna calibrada, selecione os arquivos correspondentes e ok. As escolhas. O software exibirá diferentes características da amostra, como tamanho, distribuição, durações de linha de base, largura total, metade do máximo e análise de concentração.

A abordagem a seguir é usada para amostras como fluidos biológicos que levam ao entupimento excessivo usando o método padrão na preparação, centrifugar pelo menos 50 microlitros de cultura de células. Sobrenadante contendo as vesículas extracelulares por sete minutos a 300 Gs.Prepare também um controle de mídia sozinho da mesma maneira para a amostra e o controle. Transfira 20 microlitros do sobrenadante para novos tubos e adicione 20 microlitros de PBS e 10 microlitros de estoque de esferas de poliestireno diluído de 335 nanômetros a 10 milhões de contas por mililitro.

Agora configure o instrumento como antes, usando um NP 200 Nanopore e meça a amostra de controle de apenas grânulos no meio. Primeiro, para precisão, a detecção de fundo de pequenas partículas sem grânulos deve ser minimizada para menos de 10% das detecções de grânulos. Agora, meça cada amostra uma vez antes de registrar as réplicas.

Isso distribuirá as condições flutuantes dos nanoporos sobre as amostras. Cada amostra deve ser medida três vezes em todo o acabamento, medindo novamente a amostra apenas do grânulo de calibração. Posterior. Durante a análise dos dados, use um software de planilha para fazer cálculos de concentração.

Um exemplo de cálculo está incluído no protocolo escrito. As vesículas extracelulares foram purificadas a partir de cultura de três células U 87 M-G-E-G-F-R-V, sobrenadante por ultracentrifugação e, em seguida, medidas usando o protocolo descrito usando grânulos de calibração de 115 nanômetros. Uma distribuição de tamanho para as vesículas extracelulares foi obtida.

As vesículas extracelulares também foram quantificadas diretamente do sobrenadante da cultura de células de glioblastoma, usando a abordagem alternativa que enriquece a amostra com um padrão. Duas populações de nanopartículas foram observadas. As vesículas extracelulares menores e o padrão conhecido maior, a estimativa de tamanho das duas populações com base no padrão conhecido, identificaram a população de vesículas como maior que 140 nanômetros.

Vesículas extracelulares menores podem ter sido detectadas usando uma abertura de nanoporos menor, mas teria havido mais entupimento Uma vez dominado. Essa técnica pode ser feita em uma a quatro horas, dependendo do número de amostras analisadas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que as amostras podem exigir ajustes septais no protocolo.

Por exemplo, amostras que consistem em vesículas maiores podem exigir o uso de nanoporos maiores em um trecho relativamente grande, e também as medições podem ser facilitadas filtrando nossa centrifugação de amostras para remover detritos celulares, que podem cronometrar o nanoporo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como caracterizar vesículas extracelulares usando TRPS. Dependendo da sua amostra de vesícula extracelular, você pode aplicar o protocolo padrão ou usar o método de pico ajustado.