Quantificação e Tamanho-profiling de vesículas extracelulares Usando Sintonizável resistiva Pulso Sensing

O objetivo geral do experimento a seguir é quantificar e determinar o perfil de tamanho de vesículas extracelulares utilizando a técnica de detecção resistiva ajustável por pulso. A abordagem padrão consiste em comparar as medidas de bloqueio de corrente obtidas a partir de vesículas extracelulares purificadas com aquelas obtidas a partir de padrões de microesferas de poliestireno. Uma segunda abordagem para caracterização de vesículas extracelulares é adicionar microesferas de poliestireno à amostra, método utilizado ao trabalhar com amostras complexas, como vesículas extracelulares não purificadas.

No meio de cultura celular, os dados resultantes caracterizam o tamanho e o número das vesículas extracelulares, sejam elas purificadas ou não purificadas. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o western blot ou a citometria de fluxo de vesículas extracelulares ligadas a microesferas de látex, é que este método caracteriza diretamente as partículas em fluidos biológicos, sem necessidade de isolamento físico ou marcação. Geralmente, indivíduos novos no método enfrentarão dificuldades porque as vesículas extracelulares são heterogêneas em tamanho.

Ao tentar detectar vesículas menores, vesículas maiores podem entupir o nanoporo. Incluímos algumas dicas e truques práticos ao protocolo para retornar rapidamente a condições viáveis. Tentamos reduzir a produção de vesículas extracelulares e precisávamos de um método para quantificar a concentração de vesículas em cultura celular.Snet.

Na busca por métodos para caracterizar nanopartículas, encontramos a TRPS e modificamos seus protocolos para torná-los mais adequados à caracterização de sobrenadantes de culturas celulares e outros fluidos biológicos. Comece conectando o instrumento TRPS a um computador com o software Eyes on Control Suite instalado. Certifique-se de minimizar interferências elétricas, conforme discutido no protocolo textual.

Agora, escolha o tamanho do nanoporo. Um NP 100 é a melhor opção para vesículas de 70 a 200 nanômetros, enquanto um NP 150 pode ser usado para vesículas de 85 a 300 nanômetros. Um NP 200 é mais adequado para medir vesículas de 100 a 400 nanômetros.

Em seguida, selecione as partículas de calibração de poliestireno complementares para a NP 100 e NP 150; selecione as partículas de calibração CPC 100 para a NP 200. Utilize partículas de calibração CPC 200. Vortexe as partículas de calibração por 30 segundos.

Se ainda estiverem agregados, utilize sonicação e, em seguida, dilua as partículas de calibração em PBS até a concentração desejada. Com base no tamanho dos nanoporos, o volume final deve ser de pelo menos 40 microlitros. Agora, umedeça a câmara de fluido inferior do instrumento aplicando 78 microlitros de PBS e removendo-os imediatamente.

Isso reduz o risco de formação de bolhas sob o nanoporo. Em seguida, coloque o Nanopore nos braços do instrumento. Meça a distância entre os dois braços opostos utilizando paquímetros digitais.

Insira este valor no software no campo denominado alongamento e, após inserido, clique em calibrar alongamento utilizando a roda lateral que controla a distância entre os braços opostos. Estique o nanoporo até 47 milímetros. Após atingir o tamanho desejado, reaplique 78 microlitros de PBS na célula de fluido inferior.

Inicie o processo de calibração colocando a célula de fluido superior sobre a nanoporosidade e fixando a gaiola de proteção. Em seguida, adicione 40 microlitros de partículas de calibração diluídas na célula de fluido superior. Aplique agora uma pressão positiva de pelo menos 0,8 quilopascal.

Usando o módulo de pressão variável ou VPM, selecione uma voltagem positiva e clique em ligar. Em seguida, reduza lentamente o estiramento enquanto analisa o bloqueio. Eventos causados pelas partículas de calibração.

À medida que o estiramento diminui, a altura do bloqueio aumentará gradualmente e, consequentemente, a relação sinal-ruído melhorará. Aumentar a voltagem também pode elevar a altura do bloqueio, mas pode gerar mais ruído RMS. Pare de reduzir o estiramento quando os bloqueios observados ultrapassarem adequadamente os níveis de fundo, conforme observado no painel de traçado do sinal.

Em segundo lugar, observe a taxa de partículas. No entanto, esse valor tem um limite menos rigoroso. A taxa de partículas deve ser idealmente de pelo menos 100 por minuto.

No entanto, se a taxa de partículas for superior a 2000 por minuto, dilua a amostra e recalcibre o instrumento. Uma taxa tão elevada pode levar a medições imprecisas nesta demonstração. Vesículas extracelulares previamente purificadas de uma linhagem celular de tumor cerebral são caracterizadas.

Inicie carregando as partículas de calibração na câmara superior da célula de fluido. Ligue e, em seguida, aplique pressão utilizando o VPM e registre aqui pelo menos 500 partículas de dados. Uma pressão de 0,8 quilopascal é aplicada.

Opcionalmente, uma medição com múltiplas pressões também pode ser realizada para isso: aumente a pressão aplicada e registre um segundo arquivo de calibração. Os incrementos de pressão devem ser de pelo menos 0,2 quilopascal agora; remova a amostra da célula superior e lave a célula três vezes com 100 microlitros de PBS por lavagem. Após as lavagens, seque a célula fluida superior com papel livre de fiapos.

Adicione a seguir a amostra experimental. A corrente de base deve estar dentro de 3% da corrente observada ao medir as partículas de calibração. Caso contrário, bata levemente ou gire a tampa de proteção, aplique o êmbolo ou remova completamente o nanoporo e lave-o com água desionizada.

Se a corrente observada for boa, aplique exatamente as mesmas pressões utilizadas nas partículas de calibração. Em seguida, registre pelo menos 500 partículas e salve o arquivo de dados. Se houver uma interrupção súbita na detecção de partículas, uma queda na corrente de base ou um aumento súbito no ruído RMS, pause a gravação e tente desobstruir o nanoporo.

Como antes, pipete a amostra para cima e para baixo. Bata ou gire a tampa protetora, aplique o êmbolo ou remova completamente o nanoporo e lave com água desionizada. Outra estratégia é aumentar o alongamento do nanoporo até 47 milímetros e maximizar a pressão do VPM por cerca de cinco minutos.

Como isso também pode desconectar o NPO no software. Vá até a guia analisar dados e comece a processar os dados clicando com o botão direito na opção de arquivos não processados e selecione a opção processar arquivos. Em seguida, para associar os arquivos de amostra e de calibração, clique na caixa de seleção ao lado da amostra.

Na coluna calibrada, selecione os arquivos correspondentes e confirme. As opções. O software exibirá diferentes características da amostra, como tamanho, distribuição, duração da linha de base, largura total, valores máximos em meia altura e análises de concentração.

O seguinte procedimento é utilizado para amostras como fluidos biológicos que causam entupimento excessivo com o método padrão de preparação: centrifugue pelo menos 50 microlitros de cultura celular. Colete o sobrenadante contendo as vesículas extracelulares por sete minutos a 300 Gs. Prepare também um controle com meio sozinho da mesma forma, tanto para a amostra quanto para o controle. Transfira 20 microlitros do sobrenadante para novos tubos e adicione 20 microlitros de PBS e 10 microlitros da solução estoque diluída de esferas de poliestireno de 335 nanômetros, com 10 milhões de esferas por mililitro.

Agora, configure o instrumento como antes, utilizando um Nanoporos NP 200 e meça a amostra controle contendo apenas microesferas no meio. Primeiro, para garantir precisão, a detecção de fundo de partículas pequenas não relacionadas às microesferas deve ser minimizada para menos de 10% das detecções de microesferas. Em seguida, meça cada amostra uma vez antes de registrar as réplicas.

Isso distribuirá as condições flutuantes dos nanoporos entre as amostras. Cada amostra deve ser medida três vezes, finalizando com a remedição da amostra contendo apenas as microesferas de calibração. Posteriormente, durante a análise dos dados, utilize um software de planilha eletrônica para realizar os cálculos de concentração.

Um exemplo de cálculo está incluído no protocolo escrito. Vesículas extracelulares foram purificadas a partir do sobrenadante de cultura celular de U 87 M-G-E-G-F-R-V três, por ultracentrifugação, e então medidas utilizando o protocolo descrito com esferas de calibração de 115 nanômetros. Uma distribuição de tamanho para as vesículas extracelulares foi obtida.

As vesículas extracelulares também foram quantificadas diretamente a partir do sobrenadante de cultivo celular de glioblastoma, utilizando a abordagem alternativa que adiciona ao exemplo um padrão conhecido. Duas populações de nanopartículas foram observadas. As vesículas extracelulares menores e o padrão maior conhecido, com a estimativa de tamanho das duas populações baseada no padrão conhecido, identificaram a população de vesículas como maior que 140 nanômetros.

Vesículas extracelulares menores podem ter sido detectadas utilizando uma abertura de nanoporo menor, mas teria havido mais entupimentos. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em uma a quatro horas, dependendo do número de amostras analisadas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que as amostras podem exigir ajustes septais ao protocolo.

Por exemplo, amostras constituídas por vesículas maiores podem exigir o uso de nanoporos maiores com alongamento relativamente elevado, e os procedimentos de medição podem ser facilitados pela filtração ou centrifugação das amostras para remover detritos celulares, que podem obstruir o nanoporo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como caracterizar vesículas extracelulares utilizando TRPS. Dependendo da sua amostra de vesículas extracelulares, você pode aplicar o protocolo padrão ou utilizar o método ajustado de adição de padrão interno.