Plataforma microfluídico com multiplexada detecção electrónica do Ordenamento do Rastreamento de Partículas

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar uma plataforma microfluídica que combina detecção de pulso resistivo com divisão de código, acesso múltiplo para multiplexar a detecção e dimensionamento de partículas em vários canais microfluídicos. Essa tecnologia, chamada de CODES microfluídicos, pode ajudar a realizar dispositivos de chip de laboratório totalmente integrados e verdadeiramente portáteis que são adequados para o teste de ponto de atendimento de amostras biológicas em ambientes com recursos limitados. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode rastrear eletronicamente a manipulação espacial e temporal de partículas no chip microfluídico, eliminando a necessidade de um instrumento externo, como um microscópio.

Nossa tecnologia é compatível com litografia suave e pode ser facilmente integrada a um dispositivo microfótico onde as partículas são fracionadas para fornecer uma leitura eletrônica direta semelhante ao contador Coulter. Para iniciar a construção do dispositivo microfluídico, gere um conjunto de códigos de ouro de quatro e sete bits. Em seguida, projete quatro layouts de eletrodos exclusivos com base nos códigos de ouro usando um design auxiliado por computador ou software CAD, como o AutoCAD.

Finalmente, tenha o Photomasked com o layout de eletrodo projetado fabricado por um fornecedor de Photomask. Em seguida, mergulhe um wafer de vidro de borossilicato de quatro polegadas em uma solução de piranha de cinco para um a 120 graus Celsius por 20 minutos. Após a limpeza, aqueça o wafer em uma placa quente a 200 graus Celsius por 20 minutos para evaporar a água residual.

Coloque o wafer limpo e seco em um revestidor giratório. Aplique 2 mililitros de solução fotorresistente negativa no wafer e gire a camada a 3000 rotações por minuto por 40 segundos. Seque o wafer revestido em uma placa quente a 150 graus Celsius por um minuto.

Cubra o wafer com uma máscara cromada no padrão de eletrodo desejado. Exponha a superfície fotorresistente mascarada à luz UV de 365 nanômetros para atingir 225 milijoules por centímetro quadrado. Asse o fotorresistente exposto em uma chapa quente a 100 graus Celsius por um minuto.

Mergulhe o wafer no revelador fotorresistente por 15 segundos, depois lave o wafer padrão em um spray suave de água deionizada e seque o wafer sob uma corrente de gás nitrogênio. Em seguida, coloque o wafer padronizado em um evaporador de metal de feixe de elétrons. Deposite uma camada de cromo de 20 nanômetros de espessura e uma camada de ouro de 80 nanômetros de espessura no wafer a uma taxa de um Angstrom por segundo.

Em seguida, grave o fotorresistente subjacente aquecendo ultrassônico o wafer revestido de metal em acetona por 30 minutos a 40 kilohertz e 100% de amplitude. Use uma serra de corte em cubos para cortar o wafer em pedaços menores, conforme necessário. Para começar a fabricar o molde de canal microfluídico, limpe e seque um wafer de silício de quatro polegadas da mesma forma que o wafer de borossilicato descrito anteriormente.

Coloque o wafer de silício em um revestidor giratório e aplique quatro mililitros de solução fotorresistente negativa. Gire o wafer a 500 rpm por 15 segundos, depois a 1.000 rpm por 15 segundos e, finalmente, a 3.000 rpm por 60 segundos. Coloque o wafer voltado para cima em um lenço umedecido em acetona para remover o fotorresistente residual da parte de trás e das bordas do wafer.

Asse o wafer a 65 graus Celsius por um minuto e depois a 95 graus Celsius por dois minutos. Coloque um padrão de máscara cromada para os canais microfluídicos no wafer seco. Exponha o fotorresistente à luz UV de 365 nanômetros a 180 milijoules por centímetro quadrado e, em seguida, asse o wafer novamente a 65 e 95 graus Celsius por um e dois minutos, respectivamente.

Coloque o wafer padronizado em um recipiente com revelador fotorresistente e agite suavemente o recipiente por três minutos. Enxágue o wafer desenvolvido em isopropanol e seque o wafer sob uma corrente de gás nitrogênio. Asse o wafer a 200 graus Celsius por 30 minutos e, em seguida, use um profilômetro para verificar se o fotorresistente padrão é uniformemente espesso em todo o wafer.

Coloque o wafer em um dessecador a vácuo junto com 200 microlitros de triclorosilano em uma placa de Petri descoberta. Deixe o wafer descansar no dessecador com o triclorosilano por oito horas para silanizar a superfície do wafer. Para começar a montar o dispositivo, use fita de sala limpa de uso geral para fixar o molde de wafer de silício em uma placa de Petri de 150 milímetros de diâmetro.

Adicione 50 gramas de uma mistura de 10 a um de pré-polímero de polidimetilsiloxano à placa de Petri e desgaseifique a mistura em um dessecador a vácuo por uma hora. Cure a mistura desgaseificada a 65 graus Celsius por pelo menos quatro horas. Use um bisturi para cortar a camada de PDMS curada e, em seguida, retire a camada curada do molde com uma pinça.

Corte o PDMS em pedaços pequenos. Perfure os orifícios do canal microfluídico de entrada e saída com um perfurador de biópsia. Coloque o padrão de camada PDMS voltado para baixo na fita de sala transparente para limpar a superfície microusinada.

Enxágue o substrato de vidro com eletrodo previamente preparado com acetona, isopropanol e água deionizada. Seque o substrato sob uma corrente de gás nitrogênio. Coloque a camada PDMS e o substrato em um grupo gerador de plasma de RF a 100 miliwatts com os lados da micromáquina voltados para cima.

Ative as superfícies da micromáquina no plasma de oxigênio por 30 segundos. Em seguida, use um microscópio óptico para alinhar a camada PDMS padrão com os eletrodos de superfície. Uma vez alinhadas, permita que as superfícies entrem em contato físico para selar a camada de PDMS no substrato de vidro.

É crucial que o padrão do eletrodo de revestimento no substrato de vidro esteja devidamente alinhado com os canais microfluídicos do PDMS. Uma vez alinhada corretamente, a interação da partícula com o eletrodo de superfície gerará uma forma de onda de código desejada para multiplexação. Asse o dispositivo montado a 70 graus Celsius por cinco minutos, com o vidro voltado para baixo.

Por fim, solde os fios nas almofadas de contato do eletrodo para concluir a montagem do dispositivo. Para iniciar o experimento, coloque o dispositivo microfluídico em um microscópio óptico. Conecte o eletrodo de referência do dispositivo à porta de saída de sinal de um amplificador de travamento e aplique uma onda senoidal de 400 kilohertz.

Conecte os eletrodos do sensor positivo e negativo a dois amplificadores de transimpedância independentes. Conecte ambos os amplificadores de transimpedância ao vol diferencialtage entradas do amplificador de travamento com o sinal positivo do sensor a ser subtraído do sinal negativo do sensor. Conecte a saída do demodulador do amplificador de bloqueio a uma unidade de aquisição de dados.

No software de aquisição de dados, defina um samptaxa de amostragem para o bloqueio ampsaída do amplificador de 1 Megahertz. Configure uma câmera de alta velocidade para registrar opticamente a operação do dispositivo conforme visto ao microscópio. Desenhe uma suspensão celular preparada em uma seringa.

Fixe a seringa de amostra em uma bomba de seringa e conecte a seringa ao canal de entrada. Direcione o canal de saída para um recipiente de resíduos. Use a bomba de seringa para acionar a suspensão da célula através do dispositivo a uma taxa de fluxo constante enquanto registra o sinal de modulação de impedância.

Após a conclusão do experimento, processe os dados elétricos com um software de análise. Compare o sinal elétrico processado com as imagens da câmera de alta velocidade para criar uma curva de calibração para o tamanho da célula. Uma suspensão celular foi fluída através de um dispositivo sensor microfluídico com quatro padrões de eletrodos exclusivos derivados de códigos de sensores ortogonais.

Todos os quatro sinais do sensor foram registrados a partir de uma única saída elétrica. O sensor individual associado a cada sinal registrado foi identificado pela correlação dos sinais do sensor gravados com todos os códigos possíveis, o que produziu picos de autocorrelação claramente distinguíveis. As formas de onda produzidas pelos sinais interferentes da detecção simultânea de células em todos os quatro canais foram resolvidas com um algoritmo iterativo.

Uma forma de onda registrada foi correlacionada com todos os códigos possíveis e o maior pico de autocorrelação foi identificado. O sinal do sensor individual correspondente foi reconstruído e subtraído da forma de onda de entrada. O sinal residual foi passado para a próxima iteração à medida que a entrada e o processo continuaram até que o sinal residual não produzisse picos de autocorrelação.

Os sinais estimados foram refinados com base em um algoritmo de otimização que buscava o melhor ajuste entre as formas de onda reconstruídas e as originais registradas usando a aproximação de mínimos quadrados. A localização, o tamanho e o tempo da célula para cruzar o sensor foram então determinados a partir do número do canal, amplitude, duração e tempo relativo dos sinais estimados do sensor. O procedimento foi validado pela comparação dos sinais elétricos com as medidas ópticas da câmera de alta velocidade.

Uma vez dominada, essa técnica é muito fácil de implementar, pois é muito simples do ponto de vista do hardware. Não possui componente ativo no chip. É diretamente compatível com litografia suave e o processamento do sinal depende de um algoritmo computacional simples.

Seguindo este protocolo, você pode fabricar chips microfluídicos com sensores elétricos multiplex baseados em código e decodificar sinais elétricos para medição bioanalítica. Essa tecnologia de detecção eletrônica versátil e escalável pode ser prontamente integrada a vários dispositivos microfluídicos para realizar ensaios quantitativos rastreando espacialmente as partículas à medida que são processadas no chip. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como projetar, fabricar e implementar uma tecnologia CODES microfluídica.