Plataforma microfluídico com multiplexada detecção electrónica do Ordenamento do Rastreamento de Partículas

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar uma plataforma microfluídica que combina a detecção por pulso resistivo com acesso múltiplo por divisão de código para multiplexar a detecção e a determinação do tamanho de partículas em múltiplos canais microfluídicos. Essa tecnologia, denominada microfluidic CODES, pode contribuir para a realização de dispositivos em chip de laboratório totalmente integrados e verdadeiramente portáteis, bem adequados para testes na assistência primária de amostras biológicas em ambientes com recursos limitados. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode rastrear eletronicamente a manipulação espacial e temporal de partículas no chip microfluídico, eliminando a necessidade de um instrumento externo, como um microscópio.

Nossa tecnologia é compatível com litografia macia e pode ser facilmente integrada a um dispositivo microfluídico no qual partículas são fracionadas, fornecendo uma leitura eletrônica direta semelhante à do contador de Coulter. Para iniciar a construção do dispositivo microfluídico, gere um conjunto de quatro códigos de ouro de sete bits. Em seguida, projete quatro layouts eletrodos exclusivos com base nos códigos de ouro utilizando um software de desenho assistido por computador, ou CAD, como o AutoCAD.

Por fim, solicite a fabricação da fotomáscara com o layout do eletrodo projetado junto a um fornecedor de fotomáscaras. Em seguida, mergulhe uma pastilha de vidro borossilicato de quatro polegadas em uma solução piranha na proporção de cinco para um, a 120 graus Celsius, por 20 minutos. Após a limpeza, aqueça a pastilha em uma placa aquecida a 200 graus Celsius por 20 minutos para evaporar a água residual.

Coloque a pastilha limpa e seca em um spin coater. Aplique 2 mililitros de solução de fotoresistência negativa sobre a pastilha e realize o revestimento por centrifugação a 3000 rotações por minuto durante 40 segundos. Seque a pastilha revestida em uma placa aquecedora a 150 graus Celsius por um minuto.

Cubra a pastilha com uma máscara de cromo no padrão de eletrodo desejado. Exponha a superfície do fotoresiste mascarado à luz UV de 365 nanômetros para obter 225 milijoule por centímetro quadrado. Em seguida, aqueça o fotoresiste exposto em uma placa quente a 100 graus Celsius por um minuto.

Imersa a pastilha no revelador de fotoresina por 15 segundos, depois lave a pastilha com padrão em um jato suave de água desionizada e seque a pastilha sob uma corrente de gás nitrogênio. Em seguida, coloque a pastilha com padrão em um evaporador de metal por feixe de elétrons. Deposite uma camada de cromo com espessura de 20 nanômetros e uma camada de ouro com espessura de 80 nanômetros sobre a pastilha a uma taxa de um angstrom por segundo.

Em seguida, grave o fotoresiste subjacente aquecendo ultrassonicamente a pastilha revestida com metal em acetona por 30 minutos a 40 quilohertz e amplitude de 100%. Utilize uma serra de corte para dividir a pastilha em pedaços menores, conforme necessário. Para iniciar a fabricação do molde do canal microfluídico, limpe e seque uma pastilha de silício de quatro polegadas da mesma forma que a pastilha de borossilicato descrita anteriormente.

Coloque a bolacha de silício em um espalhador por centrifugação e aplique quatro mililitros de solução de fotolito negativo. Faça a deposição por centrifugação da bolacha a 500 rpm durante 15 segundos, depois a 1.000 rpm durante 15 segundos e, finalmente, a 3.000 rpm durante 60 segundos. Posicione a bolacha com a face voltada para cima sobre um lenço de limpeza de sala limpa embebido em acetona para remover o fotolito residual do verso e das bordas da bolacha.

Asse a pastilha a 65 graus Celsius por um minuto e depois a 95 graus Celsius por dois minutos. Coloque uma máscara de cromo com o padrão dos canais microfluídicos sobre a pastilha seca. Exponha a fotoresistência à luz UV de 365 nanômetros a 180 milijoules por centímetro quadrado e, em seguida, asse novamente a pastilha a 65 e 95 graus Celsius por um e dois minutos, respectivamente.

Coloque a pastilha padronizada em um recipiente com revelador de fotoresina e agite suavemente o recipiente por três minutos. Enxágue a pastilha revelada em isopropanol e seque a pastilha sob um fluxo de gás nitrogênio. Asse a pastilha a 200 graus Celsius por 30 minutos, depois use um perfilômetro para verificar se a fotoresina do padrão possui espessura uniforme ao longo de toda a pastilha.

Coloque a pastilha em um dessecador a vácuo junto com 200 microlitros de triclorossilano em uma placa de Petri descoberta. Deixe a pastilha em repouso no dessecador com o triclorossilano por oito horas para silanizar a superfície da pastilha. Para iniciar a montagem do dispositivo, utilize fita de uso geral para sala limpa para fixar o molde de pastilha de silício em uma placa de Petri com diâmetro de 150 milímetros.

Adicione 50 gramas de uma mistura na proporção de 10 para 1 de pré-polímero de polidimetilsiloxano à placa de Petri e desgaseifique a mistura em um dessecador a vácuo durante uma hora. Cure a mistura desgaseificada a 65 graus Celsius por pelo menos quatro horas. Utilize um bisturi para recortar a camada de PDMS curada e, em seguida, retire a camada curada do molde com pinça.

Corte o PDMS em pequenos pedaços. Fure os orifícios dos canais microfluídicos de entrada e saída com um furador de biópsia. Coloque a camada de PDMS com a face do padrão voltada para baixo sobre fita adesiva transparente para limpar a superfície micromecanizada.

Lave o substrato de vidro com eletrodo previamente preparado com acetona, isopropanol e água desionizada. Seque o substrato sob um fluxo de gás nitrogênio. Coloque a camada de PDMS e o substrato em um gerador de plasma RF ajustado em 100 miliwatts, com os lados micromecanizados voltados para cima.

Ative as superfícies da micromáquina em plasma de oxigênio por 30 segundos. Em seguida, utilize um microscópio óptico para alinhar a camada de PDMS com padrão às eletrodos da superfície. Após o alinhamento, permita que as superfícies entrem em contato físico para selar a camada de PDMS sobre o substrato de vidro.

É fundamental que o padrão do eletrodo de revestimento no substrato de vidro esteja adequadamente alinhado com os canais microfluídicos de PDMS. Uma vez corretamente alinhado, a interação da partícula com o eletrodo de superfície gerará uma forma de onda de código desejada para multiplexação. Incube o dispositivo montado a 70 graus Celsius por cinco minutos, com o lado de vidro voltado para baixo.

Finalmente, solde os fios aos contatos dos eletrodos para concluir a montagem do dispositivo. Para iniciar o experimento, coloque o dispositivo microfluídico sobre a platina de um microscópio óptico. Conecte o eletrodo de referência do dispositivo à porta de saída do sinal de um amplificador com trava de fase e aplique uma onda senoidal de 400 quilohertz.

Conecte os eletrodos sensores positivo e negativo a dois amplificadores transimpedância independentes. Conecte ambos os amplificadores transimpedância às entradas diferenciais de tensão do amplificador de bloqueio, de modo que o sinal do sensor positivo seja subtraído do sinal do sensor negativo. Conecte a saída do demodulador do amplificador de bloqueio a uma unidade de aquisição de dados.

No software de aquisição de dados, defina uma taxa de amostragem para a saída do amplificador com bloqueio de 1 megahertz. Configure uma câmera de alta velocidade para gravar opticalmente o funcionamento do dispositivo conforme visto ao microscópio. Aspire uma suspensão celular preparada para dentro de uma seringa.

Fixe a seringa com a amostra em uma bomba de seringa e conecte a seringa ao canal de entrada. Direcione o canal de saída para um recipiente de resíduos. Utilize a bomba de seringa para impulsionar a suspensão celular através do dispositivo a uma taxa de fluxo constante, enquanto grava o sinal de modulação de impedância.

Após a conclusão do experimento, processe os dados elétricos com um software de análise. Compare o sinal elétrico processado com as imagens da câmera de alta velocidade para criar uma curva de calibração para o tamanho celular. Uma suspensão celular foi fluída através de um dispositivo sensor microfluídico com quatro padrões exclusivos de eletrodos derivados de códigos sensores ortogonais.

Os quatro sinais dos sensores foram registrados a partir de uma única saída elétrica. O sensor individual associado a cada sinal registrado foi identificado por meio da correlação dos sinais dos sensores registrados com todos os códigos possíveis, o que gerou picos de autocorrelação claramente distinguíveis. As formas de onda produzidas pelos sinais de interferência provenientes da detecção simultânea de células nos quatro canais foram resolvidas com um algoritmo iterativo.

Uma forma de onda gravada foi correlacionada com todos os códigos possíveis e o pico de autocorrelação mais alto foi identificado. O sinal correspondente do sensor individual foi reconstruído e subtraído da forma de onda de entrada. O sinal residual foi encaminhado para a próxima iteração como entrada, e o processo continuou até que o sinal residual não produzisse mais picos de autocorrelação.

Os sinais estimados foram refinados com base em um algoritmo de otimização que busca o melhor ajuste entre as formas de onda reconstruídas e as formas de onda originais registradas, utilizando a aproximação dos mínimos quadrados. A localização da célula, seu tamanho e o tempo para atravessar o sensor foram então determinados a partir do número do canal, amplitude, duração e tempo relativo dos sinais estimados dos sensores. O procedimento foi validado pela comparação dos sinais elétricos com medições ópticas provenientes da câmera de alta velocidade.

Uma vez dominada, esta técnica é muito fácil de implementar, pois é muito simples do ponto de vista de hardware. Ela não possui componentes ativos no chip. É diretamente compatível com litografia macia e o processamento de sinal depende de um algoritmo computacional simples.

Após seguir este protocolo, você poderá fabricar chips microfluídicos com sensores elétricos multiplex baseados em códigos e decodificar sinais elétricos para medições bioanalíticas. Essa tecnologia de detecção eletrônica versátil e escalonável pode ser facilmente integrada a diversos dispositivos microfluídicos para realizar ensaios quantitativos por meio do rastreamento espacial e temporal de partículas enquanto são processadas no chip. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como projetar, fabricar e implementar a tecnologia microfluídica CODES.