Explorando a Aplicação da Biosensição Baseada em Espalhamento Raman Aprimorado em Superfícies de SEVs individuais no diagnóstico e terapêuticas de doenças

Usamos espalhamento Raman aprimorado de superfície combinado com aprendizado de máquina para enfrentar diagnósticos precoces do câncer e também entregamos aplicações biomédicas. Um desafio experimental chave é a heterogeneidade inerente nas amostras de exossomos, os dados espectroscópicos altamente complexos e de alta dimensão, que é ainda mais agravada pela baixa relação sinal-ruído. Para começar, pipetee aproximadamente cinco microlitros da pequena amostra de vesícula extracelular sobre o substrato plasmônico designado.

Coloque o substrato em um dessecador para deixar a gota secar completamente por aproximadamente 15 minutos. Depois, transfira o substrato seco para um microscópio Raman confocal. Usando o software de instrumento WiRE versão 4.4, inicie a coleta de dados.

Ajuste o laser de excitação para 785 nanômetros a cinco miliwatts e calibre o sistema. Para adquirir espectros do substrato dourado, realize-se uma varredura de reconhecimento em uma área de 300 por 300 micrômetros para localizar vesículas individuais usando modo estático com passo de 10 micrômetros, exposição de 0,1 segundo e 50% de potência laser. Uma vez localizadas as vesículas, realize mapeamento de alta resolução em modo estático dentro de uma grade de cinco por cinco usando um passo de um micrômetro, 0,2 segundo de exposição por ponto e 50% de potência a laser.

Em seguida, adquira espectros do substrato de grafeno realizando as seguintes varreduras. Filtre os espectros brutos iniciais e exclua aqueles que exibam ruído excessivo ou formas espectrais anormais. Aplique um filtro Savitsk-Golay a cada espectro para reduzir o fundo de fluorescência e suavizar os dados espectrais.

Calcule a relação sinal para ruído de cada espectro usando o método pico-linha de base ou o método do desvio padrão. Para cada espectro, calcule a razão sinal-ruído como a razão entre a intensidade máxima após a subtração da linha de base em uma banda Raman representativa e o desvio padrão do ruído. Estima o ruído subtraindo uma versão suavizada de Savitsky-Golay do espectro, usando um tamanho de janela de 11 e uma ordem polinomial de três do espectro original.

Ordene todos os espectros em ordem crescente da relação sinal-ruído e avalie a persistência dos picos diagnósticos ao longo dos espectros ranqueados para determinar o limiar. Depois, defina o limiar no ponto em que qualquer um desses picos desaparece no ruído de base, correspondendo a uma razão sinal-ruído de 28. Exclua espectros que estejam abaixo do limiar de relação sinal-ruído de 28 para garantir que apenas espectros de alta qualidade sejam mantidos para análise a jusante.

E normalizar cada espectro restante até sua intensidade máxima ou a área total sob a curva. Atribua um rótulo a cada medição espectral com base em sua origem, como um paciente com câncer gástrico ou um controle saudável. Insira os dados espectrais rotulados em um classificador de vetor de suporte com um kernel linear e aplique uma divisão estratificada de embaralhamento para validação cruzada de cinco vezes para garantir uma representação equilibrada em cada dobra.

Agora, faça a média das métricas de precisão em todas as dobras para avaliar o desempenho geral do modelo. Por fim, utilize análise discriminante linear, ou LDA, para reduzir a dimensionalidade do conjunto de dados de espalhamento Raman aprimorado pela superfície para visualização. Empregue o modelo treinado de análise linear discriminante para realizar a classificação direta entre os grupos de amostra.

Espectros Raman com os espectros médios correspondentes revelaram assinaturas moleculares distintas em cada tipo de amostra adquiridas de pequenas vesículas extracelulares isoladas de amostras de tecido, sangue e saliva. A análise discriminante linear revelou um agrupamento claro dos dados das vesículas extracelulares de acordo com seu tecido de origem, sangue ou saliva. A classificação binária usando um classificador de vetores de suporte alcançou a maior precisão para amostras de tecido com 90,1%, seguida por sangue com 70,9% e saliva com 60,7%, divisões de classificação baseadas em LDA separando claramente amostras de câncer saudáveis e gástricos em dados extracelulares de vesículas extracelulares derivadas do tecido.

Classificações semelhantes baseadas em LDA para dados extracelulares de vesículas extracelulares derivadas de sangue e saliva mostraram uma separação menos ótima entre amostras saudáveis e de câncer. Os espectros Raman de vesículas incubadas por doxorrubicina sem grafeno apresentaram picos consistentes em aproximadamente 1.081, 1.206 e 1.440 centímetros inversos. Com grafeno, foram observados um pico D adicional de aproximadamente 1.350 centímetros inversos e um pico G de aproximadamente 1.580 centímetros inversos servindo como padrões internos.

A razão entre o pico de doxorrubicina em 442 centímetros inversos e o pico de grafeno G aumentou com maiores concentrações de medicamentos e tempos de incubação mais longos. Estabelecemos uma impressão digital bioquímica de uma única vesícula para distinguir as fontes da doença que mostram potencial para diagnóstico precoce. Três vantagens principais da nossa técnica.

Primeiro, é altamente sensível. Dois, é não invasivo. e terceiro, não requer lisação, nem a decomposição física das partículas.

No futuro, correlacionaremos o perfil espectral ao perfil proteômico, o que, por sua vez, ajudaria a correlacionar o conteúdo do exoma com funções específicas, como comunicação celular e transporte.