Matriz Hibridização Genômica Comparativa (Array CGH) para a detecção de Genomic copiar o número de variantes

O objetivo geral deste procedimento é realizar a hibridização genômica comparativa para identificar desequilíbrios no genoma que podem levar a uma grande variedade de doenças genéticas. Isso é realizado primeiramente marcando o DNA do paciente com um corante fluorescente. Na segunda etapa, o DNA do paciente e um DNA de referência marcado de forma diferente são hibridizados ao arranjo.

Em seguida, o arranjo é escaneado para medir a quantidade de DNA do paciente e do referência ligada a cada sonda. Na etapa final, a imagem escaneada é processada para identificar as regiões do genoma onde o DNA do paciente possui mais ou menos material do que o DNA de referência no arranjo final. A hibridização genômica comparativa é utilizada para determinar se o paciente possui uma variante no número de cópias que resulta em uma síndrome genética.

A demonstração visual deste método é essencial, pois a montagem da lâmina do arranjo pode ser difícil e é fácil ocorrer vazamento da hibridização. Misture o conteúdo derramado para fora da câmara antes de iniciar a reação de marcação. Deixe descongelar a placa de 96 poços pronta para uso, contendo nucleotídeos e iniciadores, a quatro graus Celsius e protegida da luz por cerca de uma hora.

Uma vez descongelado, equilibre a placa tampada por mais 30 minutos à temperatura ambiente; neste mesmo período, equilibre as amostras de DNA por 15 minutos a 60 graus Celsius. Enquanto as amostras estão aquecendo, use um robô de manipulação líquida para dispensar água livre de nucleases suficiente em cada poço de uma nova placa de 96 poços. Em seguida, quando o DNA estiver pronto, transfira um micrograma da amostra por poço para a placa de 96 poços contendo água.

Agora, transfira 20 microlitros dos nucleotídeos e iniciadores em equilíbrio para cada poço da placa contendo as amostras de DNA diluído e sela a placa com tampas em tira, tomando cuidado para garantir um selamento hermético. Em seguida, desnature o DNA a 99 graus Celsius em uma máquina de PCR com tampa aquecida após 10 minutos e hibride os iniciadores mediante resfriamento rápido da placa em gelo por cinco minutos. Depois, utilize o robô de manipulação líquida para adicionar 10 microlitros da enzima polimerase DNA exo clean out a cada amostra.

Misture as amostras com pipeta e, em seguida, feche e incube a placa a 37 graus Celsius por 16 horas. No dia seguinte, interrompa a reação com cinco microlitros de tampão de parada por poço. Em seguida, remova os nucleotídeos não incorporados. Transfira o conteúdo de cada poço para tubos individuais pré-rotulados de dois mililitros.

Carregue as amostras e as colunas de centrifugação para purificação de DNA em um robô processador de colunas de centrifugação, bem como os tampões associados apropriados. De acordo com as instruções do fabricante, o robô processador de colunas de centrifugação ligará o DNA marcado à membrana de sílica com 250 microlitros de tampão de ligação de DNA de alta salinidade por tubo, após o que as impurezas serão removidas das membranas com duas lavagens de 500 microlitros de tampão de lavagem cada. Em seguida, o robô adicionará 15 microlitros de tampão de solução de baixa salinidade às membranas para recuperar as amostras de DNA marcado purificado em volumes aproximados de 12 microlitros para hibridização das amostras.

A seguir, pré-aqueça um forno de hibridização a 65 graus Celsius e aqueça previamente as lâminas de suporte e as câmaras de hibridização. Para preparar a mistura de hibridização, combine 1,1 microlitros de DNA cot-1, 4,95 microlitros da mistura bloqueadora fornecida pelo fabricante e 24,75 microlitros do tampão de hibridização. Utilize o robô de manipulação líquida para distribuir esta mistura em cada poço de uma nova placa de 96 poços, umedecendo previamente cada ponteira para aumentar a precisão da transferência.

A seguir, pipete 9,35 microlitros do DNA marcado apropriado com sinalização três, seguido por 9,35 microlitros do DNA marcado apropriado com sinalização cinco. Sobre cada poço, feche a placa, centrifugue as amostras por um minuto e dê uma breve centrifugação rápida para recolher o conteúdo no fundo de cada poço. Desnaturar o DNA marcado em um incubador de pré-hibridização.

Primeiro por três minutos a 95 graus Celsius, seguido por 30 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, trabalhe em uma plataforma aquecida a 42 graus Celsius. Coloque a lâmina de apoio na câmara de hibridização, garantindo que a parte transparente da junta esteja alinhada com a parte janelada da câmara de hibridização usando ponteiras pré-umedecidas.

Agora, pipete lentamente 42 microlitros da mistura de hibridização no centro da posição apropriada da lâmina suporte da matriz, tomando cuidado para que o líquido não toque a borda do anel de borracha. Após preencher todas as posições, abaixe cuidadosamente a lâmina da matriz sobre a lâmina suporte e monte a câmara de hibridização.

Certifique-se de que o lado do arranjo com a escrita esteja voltado para a lâmina de suporte, em seguida aperte completamente o parafuso da câmara de hibridização e inspecione a câmara montada, confirmando que não há vazamento de hibridização fora dos limites do anel de borracha e que cada bolha de ar tenha aproximadamente quatro milímetros de altura. Quando a câmara de hibridização estiver apoiada verticalmente em sua extremidade, gire-a para verificar isso.

Todas as bolhas de ar em cada posição estão se movendo. Se alguma das bolhas estiver presa, dê uma leve batida firme na câmara sobre a bancada. Em seguida, coloque as câmaras de hibridização na estufa rotativa a 65 graus Celsius por 24 horas.

No dia seguinte, mergulhe as câmaras de hibridização no tampão de lavagem um e use um par de pinças plásticas de borda plana para separar as lâminas. Em seguida, descarte as lâminas com juntas e coloque as lâminas do arranjo em uma grade submersa em tampão fresco um. Lave as lâminas do arranjo em aproximadamente 700 mililitros de tampão de lavagem por um a cinco minutos, agitando vigorosamente com um agitador magnético e um ímã em forma de pulga.

Em seguida, transfira as lâminas do arranjo para cerca de 700 mililitros de tampão de lavagem, duas vezes por 90 segundos, com agitação mais vigorosa ao final da segunda lavagem. Levante cuidadosamente as lâminas do arranjo do tampão. Elas devem emergir secas.

Em seguida, carregue as lâminas do arranjo nos porta-lâminas do escâner juntamente com os protetores de lâmina e, depois, escaneie as amostras. De acordo com as instruções do fabricante do arranjo, cada sonda em um arranjo hibridizado é visualizada como uma mistura de fluorocromos vermelho e verde. As proporções entre o sinal fluorescente vermelho e verde para cada sonda são quantificadas pelo escâner e o software associado as registra como logaritmos na base dois, de acordo com sua posição genômica.

Os traçados da matriz resultante permitem a interpretação de regiões identificadas como geneticamente desbalanceadas. Por exemplo, neste traçado de uma criança com síndrome de Williams, uma síndrome de microdeleção recorrente mediada por repetições de baixa cópia na região proximal do cromossomo sete, o desequilíbrio genômico foi identificado pelo software com uma linha vermelha. A razão logarítmica fluorescente proporcional deve agrupar-se próximas a zero, indicando uma razão verde para vermelho de um para um em regiões normais do genoma.

Rastos em arranjo disperso, como observados nesta varredura, podem resultar em chamadas imprecisas de regiões anormais, ou na falha na identificação do desequilíbrio genômico, e podem ser causados por diversos fatores, incluindo baixa qualidade do DNA ou a presença de raios, níveis de ozônio na esfera atmosférica. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como processar amostras de pacientes para teste por A CGH e produzir dados de boa qualidade para análise posterior e detecção de variações no número de cópias.