Matriz Hibridização Genômica Comparativa (Array CGH) para a detecção de Genomic copiar o número de variantes

O objetivo geral deste procedimento é organizar a hibridização genômica comparativa para identificar desequilíbrios no genoma que podem levar a uma ampla variedade de doenças genéticas. Isso é feito primeiro rotulando o DNA do paciente com um corante fluorescente. Na segunda etapa, o paciente, o DNA e um DNA de referência rotulado de forma diferente são hibridizados com a matriz.

Em seguida, a matriz é escaneada para medir a quantidade de pacientes e DN de referência em abundância para cada sonda. Na etapa final, a imagem digitalizada é processada para identificar as regiões do genoma onde o DNA do paciente tem mais ou menos material do que o DNA de referência. A hibridização genômica comparativa é usada para determinar se o paciente carrega uma variante do número de cópias que resulta em uma síndrome genética.

A demonstração visual desse método é crítica, pois a montagem da lâmina da matriz pode ser difícil e é fácil para a hibridização. Misture o derramamento para fora da câmara Antes de iniciar a reação de rotulagem. Descongele a placa de 96 poços de nucleotídeos e primers pronta para uso a quatro graus Celsius e protegida da luz por cerca de uma hora.

Depois de descongelado, equilibre a placa coberta por mais 30 minutos em temperatura ambiente, equilibre as amostras de DNA por 15 minutos a 60 graus Celsius neste momento também. Enquanto as amostras estão aquecendo, use um robô de manuseio de líquidos para dispensar água livre de nuclease suficiente em cada poço de uma nova placa de 96 poços. Então, quando o DNA estiver pronto, transfira um micrograma de amostra por poço para a placa de água de 96 poços.

Agora transfira 20 microlitros dos nucleotídeos e primers de equilíbrio para cada uma das placas contendo as amostras de DNA diluídas e sele a placa com tampas de tiras, tendo o cuidado de fazer uma vedação hermética. Em seguida, desnature o DNA a 99 graus Celsius em uma máquina de PCR com tampa aquecida após 10 minutos e jogue os primers resfriando a placa no gelo por cinco minutos. Em seguida, use o robô de manuseio de líquidos para adicionar 10 microlitros de enzima exo DNA polimerase a cada amostra.

Misturar as amostras com pipeta e, em seguida, selar e incubar a placa a 37 graus Celsius durante 16 horas. No dia seguinte, termine a reação com cinco microlitros de tampão de parada por poço Em seguida, remova os nucleotídeos não incorporados. Transfira o conteúdo de cada poço para tubos individuais pré-rotulados de dois mililitros.

Carregue as amostras e as colunas de centrifugação de purificação de DNA em um robô de processamento de coluna de rotação, bem como os tampões associados apropriados. De acordo com as instruções do fabricante, o robô de processamento da coluna giratória ligará o DNA marcado à membrana de sílica com 250 microlitros de tampão de ligação de DNA com alto teor de sal por tubo, após o qual as impurezas serão removidas das membranas com duas lavagens de 500 microlitros de tampão de lavagem cada. O robô adicionará 15 microlitros de tampão de solução com baixo teor de sal às membranas para recuperar as amostras de DNA marcadas purificadas em volumes aproximados de 12 microlitros para hibridizar as amostras.

Em seguida, pré-aqueça um forno de hibridização a 65 graus Celsius e pré-aqueça as lâminas de apoio e as câmaras de hibridização. Para preparar a mistura de hibridização, combine 1,1 microlitros de berço 1D NA, 4,95 microlitros da mistura de bloqueio fornecida pelo fabricante e 24,75 microlitros de tampão de hibridização. Use o robô de manuseio de líquidos para alocar essa mistura em cada poço de uma nova placa de 96 poços, pré-umedecendo cada ponta para aumentar a precisão da transferência.

Em seguida, pipeta 9,35 microlitros da sinalização apropriada, três DNA marcado, seguido por 9,35 microlitros da assinatura apropriada, cinco DNA marcado. Para selar cada poço da placa, quatro amostras por um minuto e gire rapidamente a placa para coletar o conteúdo na parte inferior de cada uma. Bem, desnature o DNA marcado em uma incubadora de pré-hibridização.

Primeiro por três minutos a 95 graus Celsius, seguido por 30 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, trabalhando em uma plataforma aquecida a 42 graus Celsius. Coloque a corrediça de apoio na câmara de hibridização, certificando-se de que a parte transparente da junta esteja alinhada com a parte em janela da câmara de hibridização Usando pontas pré-molhadas.

Agora, pipete lentamente 42 microlitros da mistura de hibridização no centro da posição apropriada da lâmina de suporte da matriz. Tomando cuidado para que o líquido não toque no limite do anel de borracha. Depois que todas as posições forem preenchidas, abaixe cuidadosamente a corrediça da matriz na corrediça de apoio e monte a câmara de hibridização.

Tomando cuidado para que o lado da matriz com escrita esteja voltado para a corrediça de apoio, aperte totalmente o parafuso da câmara de hibridização e inspecione a câmara de hibridização montada, confirmando que não há vazamento de hibridização. Misture fora dos limites do anel de borracha e que cada bolha de ar tenha aproximadamente quatro milímetros de altura. Quando a câmara de hibridização estiver apoiada verticalmente, gire a câmara de hibridização para verificar isso.

Todas as bolhas de ar em cada posição estão se movendo. Se alguma das bolhas estiver presa, dê um tapinha forte na bancada. Em seguida, coloque as câmaras de hibridização no forno rotativo a 65 graus Celsius por 24 horas.

No dia seguinte, mergulhe as câmaras de hibridização no tampão de lavagem um e use um par de pinças de plástico com bordas planas para separar as lâminas. Em seguida, descarte as corrediças da junta e coloque as corrediças da matriz em um rack submerso no novo buffer um. Lave as lâminas de matriz em aproximadamente 700 mililitros de tampão de lavagem por um a cinco minutos, mexendo vigorosamente com uma pulga e um espátula magnética.

Em seguida, transfira as lâminas de matriz para cerca de 700 mililitros de tampão de lavagem, dois por 90 segundos com agitação mais vigorosa no final da segunda lavagem. Levante suavemente as corrediças da matriz para fora do buffer. Eles devem emergir secos.

Em seguida, carregue as lâminas da matriz nos suportes de lâminas do scanner junto com os protetores de lâminas e, em seguida, digitalize as amostras. De acordo com as instruções do fabricante da matriz, cada sonda em uma matriz hibridizada é visualizada como uma mistura de fluorocromos vermelhos e verdes. As proporções de sinal fluorescente vermelho e verde para cada sonda são quantificadas pelo scanner e o software associado as distribui como log duas proporções de acordo com sua posição genômica.

Os traços de matriz resultantes permitem a interpretação de regiões identificadas como genomicamente desequilibradas. Por exemplo, neste traço de uma criança com síndrome de Williams, uma síndrome de microdeleção recorrente mediada por baixas repetições de cópia na região proximal do cromossomo sete, o desequilíbrio genômico foi identificado pelo software com uma linha vermelha. A proporção de log fluorescente prop deve se agrupar em torno de zero, indicando uma proporção verde para vermelha de um para um para regiões normais do genoma.

Traços de matriz dispersa, conforme observado nesta varredura, podem resultar em chamada imprecisa das regiões anormais ou falha na identificação do desequilíbrio genômico e podem ser causados por vários fatores, incluindo má qualidade do DNA ou presença de raios, níveis de ozônio na esfera da atmosfera. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como processar amostras de pacientes para teste por A CGH e produzir dados de boa qualidade para análise downstream e detecção de variação do número de cópias.