Uma plataforma array de hibridização genômica comparativa para detecção eficiente de variações no número de cópias em Medicago truncatula mutantes induzidos por nêutrons rápidos

O objetivo geral deste protocolo de hibridização genômica comparativa baseado em matriz é identificar rapidamente as variações do número de cópias em mutantes induzidos por bombardeio rápido de nêutrons da planta leguminosa Medicago truncatula. Este método ajuda a responder a questões-chave no campo da biologia das leguminosas. Tais como, facilitar a identificação de empatógenos em local baixo envolvidos na regulação do desenvolvimento de nódulos em leguminosas.

A principal vantagem dessa técnica é que ela é da mais alta reputação e sensível na detecção de variações no número de cópias, como mutações de deleção nos mutantes de bombardeio de nêutrons da leguminosa Medicago truncatula. Demonstrando este procedimento estarei eu e Hongcheng Wang, Host Doctor Fellows do Laboratório Genético. Congele rapidamente um grama de tecido foliar jovem coletado de plantas individuais em nitrogênio líquido.

Em seguida, use um almofariz e pilão e triture o tecido foliar congelado até formar um pó fino dentro do nitrogênio líquido. Extraia as amostras de DNA genômico do tipo selvagem e mutante do pó fino usando um kit de isolamento de DNA. Use tubos de centrífuga de 500 microlitros para diluir um micrograma de cada tipo selvagem e DNAs genômicos mutantes com água destilada dupla até um volume final de 20 microlitros.

Em seguida, adicione cinco microlitros de primer aleatório aos tubos da centrífuga. Rapidamente vórtice os tubos e, após uma rápida rotação, coloque-os em um termociclador por 10 minutos para desnaturar as amostras de DNA a 98 graus Celsius. Após 10 minutos, remova os tubos do termociclador e coloque-os instantaneamente em água gelada por cinco minutos.

Em seguida, prepare duas misturas de rotulagem e adicione 25 microlitros de mistura de rotulagem como um e dois aos tubos de DNA selvagem e mutante, respectivamente. Pipete o DNA e a mistura de rotulagem três vezes e, em seguida, gire brevemente os tubos. Após a centrifugação, incube os tubos no termociclador a 37 graus Celsius por duas horas e depois a 65 graus Celsius por 20 minutos para inativar a enzima exo Klenow.

Em seguida, adicione 430 microlitros de One X TE Buffer e misture o conteúdo em cada tubo. Em seguida, gire brevemente os tubos e transfira a solução nos tubos para colunas de purificação com dois tubos de coleta de mililitros. Centrifugar as colunas de depuração a 14 000 vezes G durante 10 minutos e rejeitar o fluxo.

Adicione 480 microlitros de One X TE Buffer a cada coluna e centrifugue novamente a 14.000 vezes G por 10 minutos. Descarte o fluxo. Transfira cada um dos DNAs marcados com tipo selvagem e mutante da parte inferior da coluna para novos tubos de centrífuga.

Depois de medir o volume de cada um dos DNAs marcados com a pipeta, ajuste o volume final para 80 microlitros com One X TE Buffer e, em seguida, meça a concentração dos DNAs marcados em um espectrofotômetro. Em seguida, misture volumes equivalentes de DNAs do tipo mutante e selvagem para hibridizar sondas em um chip de micro array para hibridização comparativa. Traga o volume final para 160 microlitros com One X TE Buffer.

Em seguida, prepare a solução de hibridização e pipete-a três vezes para misturar bem três agentes com DNA misto. Depois de girar brevemente os tubos, incube-os em um termociclador a 98 graus Celsius por 10 minutos e a 37 graus Celsius por 20 minutos. Lembre-se de definir a temperatura para 67 graus Celsius para pré-aquecer o forno de hibridização quatro horas antes da hibridização.

Em seguida, coloque uma lâmina de gaxeta na base da câmara de hibridização e carregue 490 microlitros da solução de hibridização sobre ela após 20 minutos de incubação a 37 graus Celsius no termociclador. Para formar a câmara de hibridização, cubra a corrediça da junta com o chip de micro matriz do genoma Medicago truncatula, cubra a câmara de hibridização e aperte-a firmemente com os grampos. Incube a câmara de hibridização montada no forno de hibridização a 67 graus Celsius por 40 a 48 horas.

Enquanto isso, prepare duas loiças de lavagem com 250 mililitros de tampão de lavagem um mantidos à temperatura ambiente. Em seguida, faça um prato de lavagem deslizante com o tampão de lavagem dois mantido a 37 graus Celsius. Em seguida, prepare um frasco de lavagem de lâminas com 70 mililitros de acetonitrila e outro frasco de lavagem de lâminas com 70 mililitros de solução de estabilização e desenho.

Coloque os dois frascos de lavagem deslizante em uma hotte em temperatura ambiente. Após a incubação, remova a câmara de hibridização do forno de hibridização e solte os grampos da câmara para abrir a tampa. Em seguida, remova o chip de micro matriz na corrediça da junta e coloque-os na travessa deslizante com o Wash Buffer One.

Isole o chip de micro array da corrediça de cobertura. Em seguida, transfira o chip de micro array para o segundo prato de lavagem deslizante com o Wash Buffer One. Usando uma barra de agitação, mexa suavemente a solução em uma placa de agitação magnética em temperatura ambiente por cinco minutos.

Coloque o chip de micro array no prato de lavagem deslizante com o tampão de lavagem dois pré-aquecido e, em seguida, mexa com a barra de agitação para lavar a solução a 37 graus Celsius por um minuto. Remova o chip de micro array e coloque-o no frasco de lavagem de slides contendo acetonitrila em um exaustor para lavar por 30 segundos. Transfira o micro chip de matriz para o frasco de lavagem de lâminas com solução de estabilização e secagem e lave novamente por 30 segundos.

Remova cuidadosamente o chip e seque por um minuto dentro da hotte. Digitalize o chip de microarray usando um scanner com resoluções de dois micrômetros. Um software de mapeamento de sinal foi usado como interface para analisar a distribuição de proporções normalizadas de log dois de sinais do tipo mutante versus selvagem em oito cromossomos.

Para supressões putativas, considera-se o valor da razão logarítmica dois igual ou inferior a menos dois vírgula cinco. A análise de segmentação do software demonstra uma região de deleção estimada de 22 kilobases no cromossomo quatro mostrado no gráfico. A análise das bordas de deleção flanqueadas pelas sondas de micro array mostra uma proporção média reduzida de log dois normalizado.

O gráfico também mostra seis outros genes anotados, incluindo o gene filho que abrange a região excluída. O gene Son é responsável pelo controle da nodulação em Metecago truncatula. Em seguida, a amplificação por PCR feita para confirmar as bordas de deleção mostra um produto de um vírgula cinco quilobases amplificado do mutante FN6191, mas não no tipo selvagem.

O sequenciamento de DNA foi feito para mostrar a junção de deleção no mutante FN6191 mostrado na seta preta. Também foi feito um sequenciamento que confirmou a localização das bordas de exclusão. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em 72 horas se for executada corretamente.

Para obter dados de alta qualidade, lembre-se de manter a concentração de ozônio baixa na sala onde realiza o procedimento. Após este procedimento, outras medidas, como reações em cadeia da polimerase de todo o sequenciamento do genoma, podem ser realizadas para responder a perguntas adicionais, como o tamanho e as variações do número de cópias no genoma. O evento e a validação desta técnica abriram caminho para os pesquisadores explorarem a variação do número de cópias que induzem aos mutantes e as variantes naturais em espécies de plantas que não são passíveis de mutagênese insercional, como Garden P. Não se esqueça de que trabalhar com acetonitrila, estabilização e solução de secagem pode ser extremamente perigoso.

Precauções, como usar proteção ocular, evitar o contato direto com os agentes e trabalhar com cuidado são absolutamente essenciais.