Name: Uma plataforma array de hibridização genômica comparativa para detecção eficiente de variações no número de cópias em Medicago truncatula mutantes induzidos por nêutrons rápidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Aprenda a usar hibridização genômica comparativa em array para identificar variações no número de cópias em mutantes de Medicago truncatula induzidos por nêutrons rápidos. Este método sensível auxilia pesquisadores em biologia de leguminosas.

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Financiamento deste trabalho é fornecido em parte por uma concessão do NSF planta Genome Research (IOS-1127155).

Nota: a Figura 1 mostra as cinco etapas para a matriz de protocolo CGH. Eles são: 1) preparação dos materiais de planta; 2) o isolamento de amostras de DNA de alta qualidade; 3) rotulagem e purificação de amostras de ADN; 4) hibridização, lavagem e varredura de matrizes de genoma inteiro; e 5) a análise dos dados CGH. Matrizes de azulejos de genoma inteiro M. truncatula contêm um total de 971.041 prova de oligo exclusivo visando a mais de 50.000 genes ou modelos de gene no genoma (ver tabela de materiais). As sondas originais são espaçadas aproximadamente cada 150 pares de bases (bp) em regiões exônicos e 261 bp em regiões intrônicas do genoma de M. truncatula.
 1. preparação de materiais vegetais <ol><li>Scarify selvagem tipo (WT; M. truncatula cv Jemalong A17) e FN6191 sementes mutantes com ácido sulfúrico concentrado durante 8 min (ver Tabela de materiais). Remova e descarte o ácido sulfúrico para um contentor de resíduos líquido.</li>
	<li>Enxaguar as sementes com água destilada esterilizada três vezes.</li>
	<li>Superfície de esterilizar as sementes com solução 20% durante 10 min.</li>
	<li>Enxaguar as sementes com água destilada esterilizada três vezes.</li>
	<li>Sementes de loja a 4 ° C, durante 3 dias. Após a vernalização, transferência e germinar as sementes no solo para uma semana em uma câmara de crescimento com 16 h/8 h ciclo claro/escuro e 150 µE/m 2 /s da intensidade de luz.</li>
	<li>Transplante de mudas para potes de 1 galão e cultivá-las em uma estufa com ciclo claro/escuro de 16 h/8 h, 150 µE/m 2 /s intensidade luminosa por três a quatro semanas. Recolher amostras de folha jovem de plantas para isolamento do DNA.</li>
</ol> 2. Isolamento de amostras de DNA de qualidade alta <ol><li>tomar 1G de tecido de folha jovem de uma planta e congelá-lo imediatamente em azoto líquido.</li>
	<li>Tecido de folha congelada em nitrogênio líquido com um almofariz e um pilão de pó fino de moer.</li>
	<li>Isolar o DNA genômico com um isolamento de DNA kit (veja a Tabela de materiais).</li>
	<li>Ressuspender purificado amostras de DNA em 50 µ l de autoclave duplo desionizada H 2 O (ddH 2 O) ou tampão TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.0) 1x.</li>
	<li>Concentrações de DNA de medida com um espectrofotômetro (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Avaliar 260 nm/280 nm e 260 nm/230 rácios de nm de amostras de DNA. 
	Nota: As amostras de DNA de alta qualidade devem ter uma relação de nm nm 260/280 &#8805; 1.8 e um rácio de nm nm/260 230 &#8805; 2.0.</li>
	<li>Mais avaliar amostras de DNA, executando-as em 1% gel de agarose. 
	Nota: Amostras de DNA de alta qualidade devem ter alto peso molecular e não devem ser contaminadas por RNA. Idealmente, a concentração final de amostras de DNA deve ser ~ 150 ng / µ l.</li>
</ol> 3. Rotulagem de DNA e purificação <ol><li>diluir 1 µ g de DNA genômico de amostras com DDQ 2 O até um volume final de 20 µ l em um tubo de centrífuga de 500 µ l.</li>
	<li>Adicionar 5 µ l de um primer aleatório (ver Tabela de materiais) para o tubo.</li>
	<li>Vortex o tubo momentaneamente e colocá-lo em um thermocycler para incubar e desnaturar o DNA a 98 ° C por 10 min.</li>
	<li>Pegue o tubo fora do thermocycler e colocá-lo imediatamente em água gelada para esfriar por 5 min.</li>
	<li>Misturas de preparar dois rotulagem conforme mostrado na tabela 1.</li>
	<li>Tubos de adicionar 25 µ l de rotulagem misturas 1 e 2 a referência DNA e DNA da amostra, respectivamente.</li>
	<li>Misture a mistura de rotulagem e DNA pipetando três vezes e girar os tubos brevemente.</li>
	<li>Colocar os tubos em um thermocycler para incubar a 37 ° C por 2 h e em seguida a 65 ° C por 20 min inativar a enzima Klenow-exo (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Adicionar 430 µ l de tampão TE a cada tubo 1x.</li>
	<li>Misturar o conteúdo e girar os tubos brevemente.</li>
	<li>Transferência da solução no tubo em uma coluna de purificação com uma coleção de 2 mL do tubo (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Centrífuga da coluna de purificação a 14.000 x g durante 10 min.</li>
	<li>Descartar o passar solução.</li>
	<li>Adicionar 480 µ l 1 x buffer de TE para cada coluna.</li>
	<li>Centrifugar a coluna novamente a 14.000 x g, durante 10 min.</li>
	<li>Eliminar a solução passagem.</li>
	<li>Transferir a amostra de DNA etiquetada que permanece na parte inferior da coluna para um novo tubo de centrifuga.</li>
	<li>Medir o volume da amostra do DNA rotulado com uma pipeta e trazer o volume final de 80 µ l com tampão TE 1x.</li>
	<li>Medir a concentração da amostra do DNA etiquetada usando um espectrofotômetro (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Misturar uma quantidade igual de rotuladas amostra de DNA e DNA de referência e trazer o volume final a 160 µ l de tampão TE 1x com o.</li>
	<li>Adicionar 256 µ l de 2x do tampão de hibridização, 50 µ l de DNA humano berço-1 e 50 µ l de 10 × agente bloqueio de protocolo (ver Tabela de materiais) e misturá-los bem pipetando por três vezes.</li>
	<li>Gire os tubos brevemente e colocá-los em um thermocycler para incubar a 98 ° C por 10 min.</li>
	<li>Incubar os tubos a 37 ° C por 20 min.</li>
</ol> 4. Hibridização, lavagem e digitalização das matrizes do genoma <ol><li>pré-aquecer o forno de hibridização a 67 ° C pelo menos 4 h antes do início da hibridação.</li>
	<li>Colocar um slide de vedação na base de uma câmara de hibridação.</li>
	<li>Carga 490 µ l da solução de hibridação partir 3.23 passo a lâmina junta.</li>
	<li>Cobrir o slide junta com um chip de microarray do genoma de Medicago truncatula para formar uma câmara de hibridação.</li>
	<li>Colocar as tampas de câmara de hibridação e aperte a câmara firmemente com grampos.</li>
	<li>Coloque a câmara de hibridação montado para o forno de hibridização e incubar a 67 ° C por 40-48 h.</li>
	<li>Slide preparar três pratos de lavagem: dois com 250 mL de tampão de lavagem mantidos em temperatura, e uma com tampão II de lavagem mantida a 37 ° C.</li>
	<li>Slide Prepare dois frascos de lavagem: um com 70 mL acetonitrilo e outro com solução de secagem e estabilização de 70 mL; manter os dois em uma coifa em temperatura ambiente (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Retire a câmara de hibridação do forno e remova os grampos da câmara e tampa.</li>
	<li>Mover a microplaqueta de microarray e Gaxeta deslize para um prato de lavagem de slide com tampão de lavagem eu e separam o chip no slide de tampa de.</li>
	<li>Mover o microarray chip para a lavagem de slide segunda prato com tampão de lavagem eu e circular suavemente a solução com uma barra de agitação em uma placa de agitação magnética em temperatura ambiente por 5 min.</li>
	<li>Transferência do microarray do chip para o terceiro slide lavar prato com tampão de lavagem previamente aquecido II e lavá-lo suavemente com uma barra de agitação em uma placa de agitação magnética a 37 ° C por 1 min.</li>
	<li>Transferir o chip de microarray para um slide lavar a jarra com acetonitrilo em uma coifa e lavá-lo por 30 s.</li>
	<li>Transferir o chip de microarray para um slide jar com estabilização de lavagem e secagem de solução e lave-o por 30 s.</li>
	<li>Tire o chip lentamente e secá-lo por 1 min.</li>
	<li>Scan o chip de microarray usando um scanner (ver Tabela de materiais) de 2 µm de resolução. Definir parâmetros para salvar várias imagens e todo deslize varreduras. Definir canais 1 e 2 de ganhos de 100% e cancelar o auto ganho.</li>
</ol> 5. Análise de dados de CGH <ol><li>extrato da fluorescência Cy3 e Cy5 intensidades para cada sonda na matriz usando o software de digitalização (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Análise de segmentação de utilização do software para detectar variações de número de cópia (CNVs) entre a amostra DNA e o DNA de referência. Use um limite dos segmento média de log 2 amostra/referência relação ± 2,5 desvios-padrão para determinar CNVs.</li>
	<li>Inspecionar a distribuição das taxas de amostra/referência 2 log através do genoma inteiro usando um software de mapeamento de sinal (ver Tabela de materiais).</li>
</ol>

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<li>Horvath, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+nodule-specific+cysteine+rich+peptide%2C+NCR169%2C+abolishes+symbiotic+nitrogen+fixation+in+the+Medicago+truncatula+dnf7+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Loss of the nodule-specific cysteine rich peptide, NCR169, abolishes symbiotic nitrogen fixation in the Medicago truncatula dnf7 mutant.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15232-15237 (2015).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antimicrobial+peptide+essential+for+bacterial+survival+in+the+nitrogen-fixing+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An antimicrobial peptide essential for bacterial survival in the nitrogen-fixing symbiosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15238-15243 (2015).</li>
<li>Noble Research Institute. Medicago truncatula Mutant Database. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php">https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php</a> (2017).</li>
<li>Burton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+genotyping+with+the+next+generation+of+CGH+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22MLO+Med+Lab+Obs%22%5BJournal%5D)">SNP genotyping with the next generation of CGH microarray.</a> MLO Med Lab Obs. 45 (7), (2013).</li>
</ol>

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Nós desenvolvemos uma plataforma CGH baseada em array para a detecção e caracterização de bombardeamento de neutrões rápidos (FNB)-induzido mutantes em M. truncatula CV Jemalong A17. Para demonstrar o uso da matriz método CGH na detecção de mutações genéticas, realizamos análise de protocolo do mutante FN6191, que exibiu um fenótipo de hipernodulação em contraste com plantas de tipo selvagem, quando inoculados com S. tem Sm1021. Para a análise de segmentação, um segmento foi considerado significativo se...

Leguminosas (Fabaceae) são a terceira maior família de plantas, com muitas espécies economicamente importantes, tais como a soja (Glycine max) e alfafa (Medicago sativa). Os legumes podem interagir com bactérias fixadoras de nitrogênio solo, geralmente chamado de Rhizobia desenvolver nódulos de raiz no qual o dinitrogênio atmosférico é reduzido a amônia para uso pela planta hospedeira. Como tal, o cultivo de culturas de vegetal requer pouca entrada de fertilizantes nitrogenados e, portanto, contribui para uma agricultura sustentável. Culturas de vegetal produzem folhas e sementes com conteúdo de alta proteína, servindo como forragem excelente e colheitas de grão. No entanto, a espécie vegetal cultivada geralmente têm estruturas complexas do genoma, fazendo estudos funcionais de genes que desempenham papéis-chave em processos específicos de vegetal pesados. Medicago truncatula foi adotado extensamente como uma espécie de modelo para estudos de vegetal principalmente porque (1) ele possui um genoma diploide com um tamanho relativamente pequeno genoma haploide (~ 550 Mbp); (2) plantas estàvel transformam-se para estudos funcionais do gene; e (3) que está intimamente relacionado com alfafa (M. sativa), a rainha das forragens e muitas outras culturas economicamente importantes para estudos de translação. Recentemente, a sequência do genoma de M. truncatula cv Jemalong A17 tem sido lançado1,2. Anotação do genoma mostra que existem mais de 50.000 genes previstos ou modelos de gene no genoma. Para determinar a função da maioria dos genes do M. truncatula genoma é uma tarefa desafiadora. Para facilitar estudos funcionais de genes, uma coleção abrangente de mutantes no intervalo de mais de 150.000 M1 linhas foi gerada usando o mutagenesis de bombardeio (FNB) nêutrons rápidos em M. truncatula cv Jemalong A173 ,4. Nêutron rápido, um agente mutagénico ionização de alta energia, tem sido usado na geração de mutantes em muitas espécies de plantas, incluindo Arabidopsis5,6, arroz (Oryza sativa)7, tomate (Solanum lycopersicum), soja (Glycine soja; G. máx)8,9, cevada (Hordeum vulgare) e Lotus japonicus10. Uma grande parte das mutações derivadas de mutagénese FNB são devido a exclusões de DNA que variam em tamanho de alguns pares de bases a mega pares de base9,11. Muitos genes associados fenótipo foram com êxito identificado e caracterizado4,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19. anteriormente, clonagem molecular dos genes subjacentes de mutantes FNB baseou-se em uma abordagem baseada em mapa, que é demorado e limita o número de mutantes para ser caracterizada a nível molecular. Recentemente, várias abordagens complementares, incluindo métodos baseados em transcrição, genoma telhar hibridação genômica comparativa baseada em array (CGH) para detecção de variação número do DNA cópia e sequenciamento do genoma inteiro, têm sido empregada para facilitar o caracterização de mutantes de exclusão em diversos organismos, incluindo animais e plantas20,21,22,23,24,25, 26,,27,28,29,30,31.
Para facilitar a caracterização de mutantes FNB em M. truncatula, uma todo-genoma baseada em array genômica hibridação comparativa (CGH) plataforma foi desenvolvida e validada. Conforme relatado em sistemas de animais, a plataforma CGH baseada em array permite a detecção de variações de número de cópia (CNVs) ao nível do genoma inteiro em mutantes M. truncatula FNB. Além disso, as lesões podem ser confirmadas por PCR e fronteiras de exclusão podem ser identificadas por sequenciamento. Em geral, a plataforma CGH matriz é uma ferramenta eficiente e eficaz na identificação de lesões em mutantes de M. truncatula FNB. Aqui, o procedimento CGH matriz e caracterização de PCR das fronteiras de exclusão em um mutante FNB M. truncatula são ilustrados.
O seguinte protocolo fornece etapas experimentais e informações sobre os reagentes, equipamentos e ferramentas de análise para os investigadores que estão interessados na realização de análise de hibridação genômica comparativa baseada em array (CGH) do genoma inteiro do número de cópia variações nas plantas. Como exemplo, Medicago truncatula FN6191 mutante foi usado para identificar regiões de exclusão e associados com fenótipos mutantes de genes candidatos. M. truncatula FN6191 mutante, originalmente isolada de um neutrão rápido exclusão induzida por bombardeio mutante coleção32 (ver Tabela de materiais), exibiu um fenótipo de hipernodulação após a inoculação com o solo bactéria, tem Sihorhizobium Sm1021, em contraste com as plantas do tipo selvagem.

<table><tbody><tr><td>Medicago truncatula matriz de genoma, 1 x 1 M</td><td>Agilent</td><td>G4123A</td><td></td></tr><tr><td>Medicago truncatula FN6191 (mutante)</td><td>In house</td><td>FN6191</td><td></td></tr><tr><td>Medicago truncatula Jemalong A17 (referência)</td><td>In house</td><td>A17</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Plant Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>69104</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop Espectrofotômetro</td><td>Thermo Scientific</td><td>1000D</td><td></td></tr><tr><td>SureTag Kit de Rotulagem de DNA</td><td>Agilent</td><td>5190-3400</td><td></td></tr><tr><td>Primer Aleatório</td><td>Agilent</td><td>5190-3399</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004-1L</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>MJ research</td><td>PTC-200</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Labnet international Inc</td><td>Spectrafuge 24D</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Estabilização e Secagem</td><td>Agilent</td><td>5185-5979</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Hibridização Oligo aCGH/ChIP-on-chip</td><td>Agilent</td><td>5188-5380</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de vedação da câmara de hibridização Agilent</td><td></td><td>G2505</td><td></td></tr><tr><td>Human Cot-1 DNA</td><td>Agilent</td><td>5190-3393</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lavagem oligo aCGH/ChIP-on-chip 1 e 2</td> Câmara de hibridização <td>Agilent</td><td>5188-5221</td><td></td></tr><tr><td>, inoxidável</td> Forno de hibridização <td>Agilent</td><td>G2534A</td><td></td></tr> Colunas de purificação <tr><td></td><td>Agilent</td><td>G2545A</td><td></td></tr><tr><td>Scanner</td> a laser <td>Agilent</td><td>5190-3391</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Roche</td><td>MS200</td><td></td></tr><tr><td>NimbleScan 2.6</td><td>Roche Mapa de Sinais Nimblegen</td><td>5225035001</td><td></td></tr><tr><td>1.9</td> Mapa de Sinais <td>Roche Nimblegen1.9</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

uma plataforma array de hibridização genômica comparativa para detecção eficiente de variações no número de cópias em medicago truncatula mutantes induzidos por nêutrons rápidos

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

Os mutantes são inestimáveis recursos genéticos para estudos de função do gene. Para gerar conjuntos de mutante, três tipos de agentes mutagénicos podem ser utilizados, incluindo biológicos tais como o T-DNA ou transposon, produto químico como Metanossulfonato de etila (EMS), ou físico, como a radiação de ionização. O tipo de mutação observada varia de acordo com o mutagênico utilizado. Para ionização radiação induzida por mutantes, mutações incluem a exclusão, a duplicação ou rearranjo. Enquanto T-DNA ou mutagénese transposon-baseado é limitado a espécies que são suscetíveis a transformação, mutagênese química ou física pode ser aplicado a uma ampla gama de espécies. No entanto, a caracterização das mutações derivadas de mutagênese química ou física tradicionalmente baseia-se numa abordagem de clonagem baseados no mapa, que é a mão de obra intensiva e demorado. Aqui, nós mostramos que uma plataforma de hibridação genômica comparativa baseada em array (protocolo) do genoma de alta densidade pode ser aplicada para eficientemente detectar e caracterizar cópia números variações (CNVs) em mutantes derivados de mutagênese de bombardeio (FNB) de neutrões rápidos em Medicago truncatula, uma espécie de vegetal. Análise de sequências do genoma inteiro mostra que existem mais de 50.000 genes ou modelos de gene em M. truncatula. No presentes, induzida pelo FNB mutantes em M. truncatula são derivadas de mais de 150.000 linhas M1, representando inestimáveis recursos genéticos para estudos funcionais de genes no genoma. A plataforma de protocolo descrita aqui é uma ferramenta eficiente para caracterizar os mutantes FNB-induzida em M. truncatula.

A Figura 2 mostra a distribuição da proporção de2 registo normalizado do mutante contra WT sinais em todo o genoma inteiro. A análise dos dados CGH revelou uma aproximada 22 kb exclusão no cromossomo 4 que abrange o inteiro SUNN gene33 e diversas outras anotado genes em mutante FN6191 (Figura 2, Figura 3). A região de candidatos excluídos foi coberta por 73...

Este protocolo fornece etapas experimentais e informações sobre os reagentes, equipamentos e ferramentas de análise para pesquisadores interessados na realização de análise de hibridação genômica comparativa baseada em array (CGH) do genoma inteiro das variações números de cópia em plantas.

Uma plataforma array de hibridização genômica comparativa para detecção eficiente de variações no número de cópias em Medicago truncatula mutantes induzidos por nêutrons rápidos

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

O objetivo geral deste protocolo de hibridização genômica comparativa baseado em matriz é identificar rapidamente as variações do número de cópias em mutantes induzidos por bombardeio rápido de nêutrons da planta leguminosa Medicago truncatula. Este método ajuda a responder a questões-chave no campo da biologia das leguminosas. Tais como, facilitar a identificação de empatógenos em local baixo envolvidos na regulação do desenvolvimento de nódulos em leguminosas.A principal vantagem dessa técnica é que ela é da mais alta reputação e sensível na detecção de variações no número de cópias, como mutações de deleção nos mutantes de bombardeio de nêutrons da leguminosa Medicago truncatula. Demonstrando este procedimento estarei eu e Hongcheng Wang, Host Doctor Fellows do Laboratório Genético. Congele rapidamente um grama de tecido foliar jovem coletado de plantas individuais em nitrogênio líquido.Em seguida, use um almofariz e pilão e triture o tecido foliar congelado até formar um pó fino dentro do nitrogênio líquido. Extraia as amostras de DNA genômico do tipo selvagem e mutante do pó fino usando um kit de isolamento de DNA. Use tubos de centrífuga de 500 microlitros para diluir um micrograma de cada tipo selvagem e DNAs genômicos mutantes com água destilada dupla até um volume final de 20 microlitros.Em seguida, adicione cinco microlitros de primer aleatório aos tubos da centrífuga. Rapidamente vórtice os tubos e, após uma rápida rotação, coloque-os em um termociclador por 10 minutos para desnaturar as amostras de DNA a 98 graus Celsius. Após 10 minutos, remova os tubos do termociclador e coloque-os instantaneamente em água gelada por cinco minutos.Em seguida, prepare duas misturas de rotulagem e adicione 25 microlitros de mistura de rotulagem como um e dois aos tubos de DNA selvagem e mutante, respectivamente. Pipete o DNA e a mistura de rotulagem três vezes e, em seguida, gire brevemente os tubos. Após a centrifugação, incube os tubos no termociclador a 37 graus Celsius por duas horas e depois a 65 graus Celsius por 20 minutos para inativar a enzima exo Klenow.Em seguida, adicione 430 microlitros de One X TE Buffer e misture o conteúdo em cada tubo. Em seguida, gire brevemente os tubos e transfira a solução nos tubos para colunas de purificação com dois tubos de coleta de mililitros. Centrifugar as colunas de depuração a 14 000 vezes G durante 10 minutos e rejeitar o fluxo.Adicione 480 microlitros de One X TE Buffer a cada coluna e centrifugue novamente a 14.000 vezes G por 10 minutos. Descarte o fluxo. Transfira cada um dos DNAs marcados com tipo selvagem e mutante da parte inferior da coluna para novos tubos de centrífuga.Depois de medir o volume de cada um dos DNAs marcados com a pipeta, ajuste o volume final para 80 microlitros com One X TE Buffer e, em seguida, meça a concentração dos DNAs marcados em um espectrofotômetro. Em seguida, misture volumes equivalentes de DNAs do tipo mutante e selvagem para hibridizar sondas em um chip de micro array para hibridização comparativa. Traga o volume final para 160 microlitros com One X TE Buffer.Em seguida, prepare a solução de hibridização e pipete-a três vezes para misturar bem três agentes com DNA misto. Depois de girar brevemente os tubos, incube-os em um termociclador a 98 graus Celsius por 10 minutos e a 37 graus Celsius por 20 minutos. Lembre-se de definir a temperatura para 67 graus Celsius para pré-aquecer o forno de hibridização quatro horas antes da hibridização.Em seguida, coloque uma lâmina de gaxeta na base da câmara de hibridização e carregue 490 microlitros da solução de hibridização sobre ela após 20 minutos de incubação a 37 graus Celsius no termociclador. Para formar a câmara de hibridização, cubra a corrediça da junta com o chip de micro matriz do genoma Medicago truncatula, cubra a câmara de hibridização e aperte-a firmemente com os grampos. Incube a câmara de hibridização montada no forno de hibridização a 67 graus Celsius por 40 a 48 horas.Enquanto isso, prepare duas loiças de lavagem com 250 mililitros de tampão de lavagem um mantidos à temperatura ambiente. Em seguida, faça um prato de lavagem deslizante com o tampão de lavagem dois mantido a 37 graus Celsius. Em seguida, prepare um frasco de lavagem de lâminas com 70 mililitros de acetonitrila e outro frasco de lavagem de lâminas com 70 mililitros de solução de estabilização e desenho.Coloque os dois frascos de lavagem deslizante em uma hotte em temperatura ambiente. Após a incubação, remova a câmara de hibridização do forno de hibridização e solte os grampos da câmara para abrir a tampa. Em seguida, remova o chip de micro matriz na corrediça da junta e coloque-os na travessa deslizante com o Wash Buffer One.Isole o chip de micro array da corrediça de cobertura. Em seguida, transfira o chip de micro array para o segundo prato de lavagem deslizante com o Wash Buffer One. Usando uma barra de agitação, mexa suavemente a solução em uma placa de agitação magnética em temperatura ambiente por cinco minutos.Coloque o chip de micro array no prato de lavagem deslizante com o tampão de lavagem dois pré-aquecido e, em seguida, mexa com a barra de agitação para lavar a solução a 37 graus Celsius por um minuto. Remova o chip de micro array e coloque-o no frasco de lavagem de slides contendo acetonitrila em um exaustor para lavar por 30 segundos. Transfira o micro chip de matriz para o frasco de lavagem de lâminas com solução de estabilização e secagem e lave novamente por 30 segundos.Remova cuidadosamente o chip e seque por um minuto dentro da hotte. Digitalize o chip de microarray usando um scanner com resoluções de dois micrômetros. Um software de mapeamento de sinal foi usado como interface para analisar a distribuição de proporções normalizadas de log dois de sinais do tipo mutante versus selvagem em oito cromossomos.Para supressões putativas, considera-se o valor da razão logarítmica dois igual ou inferior a menos dois vírgula cinco. A análise de segmentação do software demonstra uma região de deleção estimada de 22 kilobases no cromossomo quatro mostrado no gráfico. A análise das bordas de deleção flanqueadas pelas sondas de micro array mostra uma proporção média reduzida de log dois normalizado.O gráfico também mostra seis outros genes anotados, incluindo o gene filho que abrange a região excluída. O gene Son é responsável pelo controle da nodulação em Metecago truncatula. Em seguida, a amplificação por PCR feita para confirmar as bordas de deleção mostra um produto de um vírgula cinco quilobases amplificado do mutante FN6191, mas não no tipo selvagem.O sequenciamento de DNA foi feito para mostrar a junção de deleção no mutante FN6191 mostrado na seta preta. Também foi feito um sequenciamento que confirmou a localização das bordas de exclusão. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em 72 horas se for executada corretamente.Para obter dados de alta qualidade, lembre-se de manter a concentração de ozônio baixa na sala onde realiza o procedimento. Após este procedimento, outras medidas, como reações em cadeia da polimerase de todo o sequenciamento do genoma, podem ser realizadas para responder a perguntas adicionais, como o tamanho e as variações do número de cópias no genoma. O evento e a validação desta técnica abriram caminho para os pesquisadores explorarem a variação do número de cópias que induzem aos mutantes e as variantes naturais em espécies de plantas que não são passíveis de mutagênese insercional, como Garden P. Não se esqueça de que trabalhar com acetonitrila, estabilização e solução de secagem pode ser extremamente perigoso.Precauções, como usar proteção ocular, evitar o contato direto com os agentes e trabalhar com cuidado são absolutamente essenciais.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

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Uma plataforma array de hibridização genômica comparativa para detecção eficiente de variações no número de cópias em Medicago truncatula mutantes induzidos por nêutrons rápidos (Vídeo) | JoVE Journal

Uma plataforma array de hibridização genômica comparativa para detecção eficiente de variações no número de cópias em Medicago truncatula mutantes induzidos por nêutrons rápidos

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