Demonstração de técnicas Whole Genome hibridização genômica comparativa de matriz

A breve apresentação a seguir é um vídeo mostrando o protocolo de hibridização para a matriz de sub-megabase de 27 K. Esta matriz ou matriz inteligente é composta por 26.946 clones sequenciados individualmente impressos em um único slide. Eles são vistos em duplicata para um total de 54.000 elementos por slide impressos em uma área de 18 por 54 milímetros.

Os dados resultantes são comparáveis a matrizes de oligo de alta densidade sem exigir interpretação de dados por bioinformática. Uma grande vantagem de usar uma grande matriz de inserção, como clones traseiros, é que ela permite o uso de apenas 100 nanogramas de DNA de amostra sem amplificação. Isso permite a análise de uma variedade de amostras, como DNA de sangue, tecido congelado, células classificadas e material FFPE.

A matriz inteligente provou ser útil no ambiente clínico. Na BC Cancer Agency, a análise de amostras de vários pacientes é facilmente acomodada na semana de trabalho média. Para citogenética.

A maioria das etapas usadas no CGH de matriz são semelhantes ao CGH convencional ou peixe. Permitindo a introdução rápida do protocolo em laboratórios estabelecidos. A qualidade do DNA é a maior influência nos resultados das matrizes.

A hibridização de CGH, a má qualidade ou o DNA contaminado afetarão adversamente a incorporação de PSI no produto, resultando em imagens escuras ou ruído nos dados. O espectrofotômetro NanoDrop é uma excelente ferramenta para avaliar a qualidade do DNA antes da hibridização. Para quantificar o conjunto de DNA, o NanoDrop para medir o ácido nucléico e o modo para medir o DNA 50 em branco, o NanoDrop com 1,5 microlitros da mesma solução que sua amostra ressuspensa.

Neste caso, é a água Tris. O EDTA demonstrou ter potenciais efeitos negativos na incorporação da PS D. Remova o lenço em branco com um lenço Kim e adicione 1,5 microlitros de sua medida de amostra e registre a concentração de sua amostra.

A leitura de dois 60 sobre dois 80 no NanoDrop é um bom indicador da qualidade do DNA, onde uma proporção de 1,8 é ótima. O método de proporção dupla dois 60 sobre dois 80 e dois 60 sobre dois 30 fornece uma maneira ainda melhor de determinar a pureza de suas amostras. O NanoDrop exibe uma curva que representa a absorbância em relação ao comprimento de onda.

Uma curva suave sem picos é indicativa de boa qualidade de DNA limpe e limpe o NanoDrop com água e um lenço Kim ou, se a amostra for limitante, pipete a amostra do pedestal. Este protocolo é otimizado para entre 100 a 400 nanogramas de amostra. 200 nanogramas é a quantidade alvo para DNA de boa qualidade Para rotular a amostra, são necessários os seguintes reagentes e equipamentos.

Tampão SCI três SCI cinco ERs aleatórios 10 vezes DNTP mistura referência DNA água estéril 0,2 microlitros tubos de PCR estéreis bloco de calor de gelo a 100 graus Celsius incubadora a 45 graus Celsius. Configure um tubo de reação para DNA de referência e um tubo de reação. Para amostras de DNA, elas serão marcadas com sci-fi e SCI três, respectivamente.

Em um ambiente de pesquisa, preferimos usar CY três para nossa amostra de DNA, pois é mais resistente à degradação do ozônio. Combine sua água de DNA e tampão de canal com a amostra e repita para o DNA de referência. Em nosso laboratório, combinamos o buffer de 10 vezes com o Optimus aleatório.

Para criar uma solução de cinco tempos, adicione água estéril a um volume total de 17 microlitros. Transfira os tubos para um bloco de calor, desnature por cinco minutos a 100 graus Celsius. Transfira imediatamente para o gelo.

Adicione quatro microlitros de mistura DNTP de 10 vezes. Adicione os olhos laterais. Adicione dois microlitros de SCI três DCTP marcados para coletar amostras de DNA.

Adicione dois microlitros de DCTP rotulado como ficção científica para referenciar o DNA. Adicione 2,5 microlitros de canal e misture. A solução pode ser misturada à mão ou em vórtice.

Gire brevemente a solução até o fundo do tubo com um pulso rápido em uma centrífuga de bancada. Transfira para um forno e incube a 37 graus durante a noite. O tempo de hibridização durante a noite pode ser ajustado entre 14 a 24 horas sem afetar adversamente o processo de rotulagem.

Para ajustar um cronograma de laboratório usando uma coluna MicroCon YM 30, adicione 100 microlitros capturados 1D NA à coluna. Tenha cuidado para não tocar na membrana com uma ponta de pipeta presa. Sabe-se que a variação de lote para lote de DNA ocorre mesmo quando comprada de grandes distribuidores.

Recomenda-se que grandes lotes sejam adquiridos e testados antes do uso. Agora haverá dois tubos para cada hibridização de amostra, um de cor azul e outro de cor vermelha. Combine os tubos para cada amostra e misture por pipetagem.

Em seguida, transfira toda a solução para a membrana MicroCon. Coloque a coluna no tubo MicroCon fornecido e gire a 13.000 G por 10 minutos. A coluna MicroCon é uma coluna de exclusão de tamanho e prende o DNA com os corantes laterais incorporados e permite que os corantes não incorporados passem pela membrana.

Para lavar qualquer nucleotídeo ou lado residual não incorporado, adicione 200 microlitros de água destilada estéril à membrana. Gire novamente a 13.000 G por 10 minutos. Descarte o tubo e adicione 45 microlitros de solução de hibridização ao topo da coluna do concentrador MicroCon.

A solução de hibridização que usamos é o Dig Easy da Roche Scientific, cinco microlitros de esperma de arenque compartilhado também podem ser adicionados à solução. Tradicionalmente, isso era usado para bloquear a ligação não competitiva à superfície da corrediça. O advento de novas substâncias aglutinantes permitiu a eliminação dessa etapa.

No entanto, às vezes é adicionado para aumentar a viscosidade da solução de hibridização. Inverta a coluna MicroCon e coloque em um novo tubo rotulado. Girar o tubo a 3000 G durante três minutos.

A solução se acumulará no fundo do novo tubo. 1,5 microlitros da solução serão usados para quantificação da incorporação de SD. Defina o NanoDrop para análise de microarray, em branco.

O NanoDrop com 1,5 microlitros de escavação. Buffer de hibridização fácil. Meça o espaço em branco com o NanoDrop.

A leitura deve ser zero. Remova o lenço em branco com um lenço kim e adicione 1,5 microlitros de sua medida de amostra E registre sua incorporação de amostra. O NanoDrop fornecerá uma molécula PICA por concentração de microlitro das amostras de incorporações de corantes S3 e sci-fi com incorporações abaixo.

Três ole por microlitro devem ser considerados como tendo muito poucos Fluor fours Para continuar, o NanoDrop exibirá um gráfico da absorbância versus o comprimento de onda. Dois picos devem ser visíveis, um para cada um dos olhos laterais limpe e limpe o NanoDrop com água e um lenço umedecido. Coloque a tampa Deslize em um aquecedor de slides ou bloco de calor pré-aqueça a 45 graus Celsius para manter a temperatura de hibridização.

Coloque 42 microlitros de solução de sonda na lamínula de 22 milímetros por 60 milímetros. Certifique-se de que não haja bolhas de ar na solução. Um truque rápido para remover uma bolha teimosa é pegar uma nova lamínula e estourar a bolha com um canto afiado.

Alinhe a corrediça sobre a lamínula e a solução da sonda. Abaixe uma borda da lâmina, permitindo o contato com a solução de hibridização. Continue a abaixar uma borda até que a lamínula se prenda à corrediça com tensão superficial.

Inverta o slide. Coloque a lâmina em um de hibridização, pré-aqueça a 45 graus Celsius e adicione 10 microlitros de água na ranhura inferior para controlar a umidade. Esta etapa deve ser praticada, pois a escavação fácil cristaliza em temperaturas mais baixas e deixará o fundo na lâmina.

Isso é especialmente importante quando a solução está na lâmina, pois é uma camada muito fina de líquido. Neste ponto, feche o e incube por 36 a 40 horas A 45 graus Celsius. A remoção do slide do de hibridização é crítica.

Cave, cristaliza facilmente à temperatura ambiente. A lâmina deve ser imediatamente imersa e a lamínula removida na solução de lavagem. Todas as soluções de lavagem devem ser pré-fabricadas e ter um pH de sete, o pH não neutro pode degradar os olhos laterais.

Pré-aqueça a solução de lavagem a 45 graus Celsius. Adicione aproximadamente 60 mililitros da solução de lavagem a um frasco Copeland antes de abrir a câmara de hibridização. Abra a câmara.

Remova a lâmina com uma pinça e adicione a lâmina à solução de lavagem. Com a lamínula ainda presa, aguarde de 10 a 20 segundos e recupere a lamínula com uma pinça. Deveria ter caído do escorregador.

Este é um passo importante, pois proíbe a cristalização do buffer de escavação fácil, bem como reduz qualquer possível arranhão da lâmina pela remoção mecânica da lamínula. Lave a lâmina três vezes em solução de lavagem. Um minuto cada com agitação.

Enxágue a lâmina três vezes. Não deve haver bolhas residuais do SDS na solução de lavagem visíveis após a última lavagem. Deixe a lâmina na solução de lavagem até que esteja pronta para centrifugar.

Centrífuga em tubo Falcon de 50 mililitros a 700 G por um minuto. Certifique-se de que o tubo Falcon esteja seco antes de usar. Digitalize imediatamente o slide, pois as intensidades do sinal diminuirão com o tempo.

Dependendo dos níveis de ozônio ambiente, cada scanner é diferente, mas existem algumas diretrizes comuns a serem seguidas. Para imagens de slides. Os níveis de ozônio ambiente são críticos durante o processo de digitalização.

A matriz de ficção científica é sensível ao ozônio e se degrada rapidamente durante um longo tempo de varredura. Foi demonstrado que cinco partes por bilhão de ozônio afetam S cinco. Isso é equivalente à poluição leve do tráfego em um dia claro.

Os medidores de ozônio são recomendados para registrar os níveis de ozônio ambiente. Uma imagem separada é criada para cada canal S3 e SCI cinco. Os canais podem ser equilibrados alterando a exposição, o tempo, a excitação, a entrada ou a sensibilidade de captura do scanner.

Essas imagens agora estão prontas para análise.