Name: Demonstração de técnicas Whole Genome hibridização genômica comparativa de matriz (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-05T18:06:00.000+00:00
Duration: 16 min 37 s
Description: Aprenda o protocolo de hibridização para array CGH de caminho de ladrilhamento do genoma completo usando 25-100 ng de DNA. Este método permite analisar sangue, tecido congelado e material FFPE sem amplificação.

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Queremos agradecer aos membros do Laboratório de Lam Wan equipe matriz BAC especialmente Miwa Suzuki e Bryan Chi para a preparação deste artigo. Este trabalho foi financiado com recursos do Canadian Institutes for Health Research, Canadá Genoma / British Columbia Genoma, e NIH / NIDCR conceder RO1 DE15965-01.

PROBE ROTULAGEM Nota: limite de exposição de Corantes Cye à luz o tempo todo (isso pode ser conseguido através do trabalho em uma área escura ou pela proteção dos tubos com uma tampa, como folha de alumínio) <ol><li> Combine: (Setup um tubo de reação para referência e um tubo de reação para a amostra) <ul><li> DNA (25-400 ng) </li><li> 5 mL de tampão 5X primers aleatórios (concentração final: 5X Promega Klenow tampão e 7 mg / mL octâmeros aleatório) </li><li> Diluída para 17,0 mL de volume total com H 2 O destilada </li></ul></li><li> Ferva por 10 minutos a 100 ° C. Transferir imediatamente para o gelo por 1 minuto. </li><li> Adicionar 4 mL de dNTP mix 10X (2mM dATP, dGTP, dTTP, dCTP 1,2 mm). </li><li> Adicionar CyeDyes: <ul><li> Adicione 2 mL (2 nmoles) de Cy-3 dCTP marcado com o DNA da amostra </li><li> Adicione 2 mL (2 nmoles) de Cy-5 dCTP marcado para Referência DNA (por exemplo, Novagen DNA genômico humano) </li></ul></li><li> Adicionar 2,5 mL de Klenow (9 U / mL, Promega) e misturar. </li><li> Incubar a 37 ° C durante a noite * (~ 18 horas). * O tempo de hibridização durante a noite pode ser ajustada entre 14 a 24 horas sem afetar negativamente o processo de rotulagem para se adequar a um cronograma de laboratório. </li></ol> AMOSTRA CLEAN UP (Sonda combinada de limpeza e preparação para a hibridação) <ol><li> Usando um microcontrolador YM-30 coluna: <ul><li> Adicionar 100 Cot-1 mL DNA (1μg/μL) à coluna. Não toque membrana com pipeta ponta. </li><li> Piscina as reações (de referência e amostra) e adicionar a coluna. </li><li> Lugar na coluna tubo fornecido e girar à 13.000 g por 10 minutos. </li><li> Adicionar 200 mL H 2 0 destilada e repetir a membrana de giro para lavagem. </li><li> Descartar tubo e adicionar 45 mL de solução de hibridização: (Roche DIG Fácil) </li></ul> Opcional: adicione DNA do esperma 5μL sheared arenque (unidade 10μg/μL, Promega) <ul><li> Inverter microcontrolador, coloque em um novo tubo rotulado, e girar a 3000 g por 3 minutos. </li></ul></li></ol> CÁLCULO de incorporações <ol><li> Remover 1,5 mL e incorporação medida fluoróforo usando Espectrofotômetro NanoDrop. Usando o seu tampão de hibridação como um espaço em branco (DIG Easy) siga as instruções na tela. (Você pode recuperar a amostra do pedestal, se necessário, após a medição.) (Nota:. Incorporações abaixo de 3,0 pmol / mL nos dois canais têm mostrado resultados variáveis) </li><li> Desnaturar a 85 ° C por 10 minutos. </li><li> Sonda lugar a 45 ° C por 30 minutos a 1 hora (permite Cot-1 DNA annealing). </li></ol> HIBRIDIZAÇÃO ARRAY <ol><li> Coloque 44 mL de solução sonda sobre a lamínula (22 mm mm x 60) (Fisher Scientific). Se disponível, coloque a lamínula sobre uma lâmina quente ou bloco de aquecimento pré-aquecido a 45 ° C para manter a temperatura. </li><li> Alinhar deslizar sobre lamínula e solução de sonda, uma borda inferior da lâmina permitindo contato com a solução de hibridação. Continue a diminuir até a lamela está ligado ao slide com tensão superficial. Inverter slide. </li><li> Coloque o slide em cassete hibridação (Telechem), pré-aquecido a 45 ° C, e adicionar 10 mL de água na parte inferior do sulco (para controle de umidade durante a hibridação). </li><li> Cassete Seal e incubar por 36-40 horas a 45 ° C. </li></ol> LAVAGEM ARRAY Nota: Todas as soluções de lavagem são em pH 7,0 Remoção da lâmina da cassete hibridação é crítica. DIG Fácil cristaliza rapidamente a temperatura ambiente. A lâmina deve ser imediatamente imersas ea lamínula removidos na solução de lavagem. <ol><li> Adicionar aproximadamente 60 mL de 0.1XSSC, 0,1% SDS (pH 7,0, 45 ° C) lavar solução para um frasco Coplin antes de abrir a câmara de hibridação. </li><li> Câmara aberta, adicionar slides solução para lavar e remover lamela (deve escorregar). </li><li> Lave o slide 3 vezes em 0.1XSSC + 0,1% SDS a 45 ° C por 1 minuto cada, com agitação. </li><li> Lavar o slide 3 vezes em 0.1XSSC fresca *. Não deve haver bolhas residual da lavagem SDS visível. * Os slides podem permanecer na solução de lavagem final até estar pronto para centrífuga e scan (~ 15 minutos). </li><li> Centrifugar o slide em uma tubos de 50 mL Falcon em 700 g por 3 minutos. </li><li> Verificar imediatamente os slides (intensidades de sinal irá diminuir ao longo do tempo.) </li></ol>

<ol><li>Lockwood, W. W., Chari, R., Chi, B., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+array+comparative+genomic+hybridization+technologies+and+their+applications+in+human+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Recent advances in array comparative genomic hybridization technologies and their applications in human genetics.</a> European Journal of Human Genetics. 14, 139-1x`48 (2006).</li>
<li>Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Watson, S. K., deLeeuw, R. J., Chi, B., Coe, B. P., Snijders, A., Albertson, D. G., Pinkel, D., Marra, M. A., Ling, V., MacAulay, C., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tiling+resolution+DNA+microarray+with+complete+coverage+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A tiling resolution DNA microarray with complete coverage of the human genome.</a> Nature Genetics. 36, 299-303 (2004).</li>
<li>Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+high+throughput+validation+of+amplified+fragment+pools+of+BAC+DNA+for+constructing+high+resolution+CGH+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Methods for high throughput validation of amplified fragment pools of BAC DNA for constructing high resolution CGH arrays.</a> BMC Genomics. 5, 6(2004).</li>
<li>Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Horsman, D. E., Squire, J. A., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetically+balanced+translocations+are+associated+with+focal+copy+number+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cytogenetically balanced translocations are associated with focal copy number alterations.</a> Human Genetics. 120, 795-805 (2007).</li>
<li>Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., MacAulay, C., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeGH+--+a+software+tool+for+visualization+of+whole+genome+array+comparative+genomic+hybridization+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">SeeGH -- a software tool for visualization of whole genome array comparative genomic hybridization data.</a> BMC Bioinformatics. 5, 13(2004).</li>
<li>Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., Ng, R. T., MacAulay, C., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MD-SeeGH%3A+a+platform+for+integrative+analysis+of+multi-dimensional+genomic+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MD-SeeGH: a platform for integrative analysis of multi-dimensional genomic data.</a> BMC Bioinformatics. 9, 243(2008).</li>
<li>Coe, B. P., Ylstra, B., Carvalho, B., Meijer, G. A., Macaulay, C., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+resolution+of+array+CGH%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Resolving the resolution of array CGH.</a> Genomics. 89, 647-653 (2007).</li>
<li>Garnis, C., Coe, B. P., Lam, S. L., MacAulay, C., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+array+CGH+increases+heterogeneity+tolerance+in+the+analysis+of+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">High-resolution array CGH increases heterogeneity tolerance in the analysis of clinical samples.</a> Genomics. 85, 790-793 (2005).</li>
</ol>

Pobres DNA de qualidade não vai fornecer um perfil de hibridização bom. É essencial para garantir que a amostra de ADN de referência e estão livres de contaminantes tais como fenol, RNA, sal, etc que possam interferir com a etapa de rotulagem aleatória principal antes de iniciar um experimento de hibridização. Por exemplo, a ressuspensão de DNA em Tris - EDTA (TE) em vez de água não é recomendada como alta concentração de sal pode inibir a reação rotulagem. Recomendamos assaying qualidade do DNA usando o espectrofotômetro Nanodrop para medi...

<table><tbody><tr><td>Tampão Klenow 5X</td><td>Reagente</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oligômeros Aleatórios de Oito Nucleotídeos</td><td>Reagente</td><td>Alpha DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mistura 10X de dNTPs</td><td>Reagente</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td>2 mM dATP, dGTP, dTTP, 1,2 mM dCTP</td></tr><tr><td>dCTP marcado com Cy-3</td><td>Reagente</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dCTP marcado com Cy-5</td><td>Reagente</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ADN Genômico Humano de Referência</td><td>Reagente</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td></td><td>Exemplo de uma possível referência</td></tr><tr><td>Klenow</td><td>Reagente</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coluna YM-30</td><td>Reagente</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ADN Cot-1</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DIG Easy</td><td>Reagente</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ADN de Esperma de Arenque Fragmentado</td><td>Reagente</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de Cobertura</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>22 mm x 60 mm</td></tr><tr><td>Cassete de Hibridização</td><td>Ferramenta</td><td>Telechem</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

demonstração de técnicas whole genome hibridização genômica comparativa de matriz

Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Matriz hibridização genômica comparativa (array CGH) é um método para a detecção de ganhos e perdas de segmentos de DNA ou dosagem do gene no genoma 1. Os recentes avanços nesta tecnologia permitiram a comparação de alta resolução de genomas inteiros para a identificação de alterações genéticas no cancro e outras doenças genéticas 2. O Sub-Megabase Resolução série Tiling set-(ou SMRT) matriz é composta por um conjunto de cerca de 30 mil sobreposição cromossomo artificial bacteriano (BAC) clones que abrangem o genoma humano em ~ par kilobase 100 (kb) segmentos 2. Essas metas são BAC individualmente sintetizados e manchado em duplicado por uma lâmina de vidro única 2-4. Matriz CGH é baseado no princípio de hibridização competitiva. Amostra de DNA e de referência são diferencialmente marcada com Cyanine-3 e corantes fluorescentes Cyanine-5, e co-hibridizados para a matriz. Após um período de incubação, as amostras não ligadas são lavadas a partir do slide ea matriz é impressa. Um pacote de software disponível gratuitamente personalizado chamado SeeGH (www.flintbox.ca) é usado para processar o grande volume de dados coletados - um único experimento gera 53.892 pontos de dados. SeeGH visualiza o log2 relação intensidade de sinal entre as duas amostras em cada alvo BAC, que está verticalmente alinhado com a posição cromossômica 5,6. A matriz SMRT pode detectar alterações tão pequenas quanto 50 kb de tamanho 7. A matriz SMRT pode detectar uma variedade de eventos de rearranjo do DNA DNA incluindo os ganhos, perdas, amplificações e deleções homozigótica. A única vantagem da matriz SMRT é que se pode usar DNA isolado de amostras de parafina fixado em formalina incorporado. Quando combinado com os requisitos de entrada baixa de DNA sem amplificação (25-100ng), que permite perfis de amostras preciosos como os produzidos por microdissecção 7,8. Isto é atribuído ao grande tamanho de cada alvo de hibridização BAC que permite a ligação de amostras suficientes rotulados para produzir sinais para detecção. Outra vantagem desta plataforma é a tolerância da heterogeneidade do tecido, diminuindo a necessidade de microdissecção tecido tedioso 8. Este protocolo de vídeo é um tutorial passo-a-passo da rotulagem o DNA de entrada até a aquisição de sinal para o genoma série azulejos toda SMRT caminho.

Este vídeo é uma demonstração técnica do protocolo de hibridização para todo o genoma azulejos caminho disposição CGH, que escaneia todo o genoma humano usando apenas 25-100 ng de DNA que podem ser isoladas a partir de uma variedade de fontes, incluindo o material de arquivo formol fixa.

Demonstração de técnicas Whole Genome hibridização genômica comparativa de matriz

A hibridização genômica comparativa em array (array CGH) é um método para detectar ganhos e perdas de segmentos de DNA ou a dosagem gênica no genoma 1. Recentes...

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