Um Ensaio Comportamental simples para Teste de Função Visual em Xenopus laevis

O objetivo geral deste procedimento é testar a função visual dos girinos, registrando a quantidade de tempo que o animal gasta na metade do tanque de teste coberto de preto. Isso é feito primeiro elevando os girinos aos estágios 45 a 50. O segundo passo é montar um tanque meio preto, meio branco junto com uma câmera para o ensaio de comportamento.

Em seguida, coloque um segundo tanque com um girino no tanque externo. Para cada registro de girino, o comportamento guiado pela visão como plano de fundo em seu ambiente é alterado. A etapa final é realizar uma ex-retiniana nos girinos e, em seguida, repetir o ensaio de comportamento.

Em última análise, os dados deste ensaio simples e barato são usados para mostrar que os girinos têm preferência por nadar de um lado do tanque em detrimento do outro, sob testes de visão phototop. A principal vantagem de usar esse método em relação a outras técnicas, como a resposta cinética óptica ou o ensaio de inversão da cauda, é que é um método simples e barato que usa equipamentos prontamente disponíveis na maioria dos laboratórios de opus. Para preparar os girinos, primeiro obtenha embriões de xenopus fertilizados, put mark's, ringers modificados ou MMR diluídos por um fator de 10 em placas de Petri de 60 milímetros com 50 microgramas por mililitro.

O antibiótico gentamicina coloca a blástula nos embriões em estágio da placa neural. Estágios dois a 15 a 18 graus Celsius nas placas de Petri. Quando os embriões atingirem um novo copo no estágio de favor de cerca de 27 a 30, mude-os para 0,1 XMMR sem antibióticos para permitir o crescimento bacteriano intestinal.

Quando os girinos atingirem o estágio de alimentação por volta do estágio 45, mova-os para placas de Petri de 100 milímetros com 0,1 XMMR. No dia seguinte, alimente-os com sobrenadante em pó de urtiga. Depois de uma semana na placa de Petri de 100 milímetros, encha um tanque de meio galão com água de sapo.

Mova os animais para o tanque e continue o cronograma de alimentação do sobrenadante em pó de urtiga, mas troque a água apenas duas a três vezes por semana. Quando os animais estiverem em tanques de meio galão, mantenha-os em um ciclo de luz de 12 horas e escuro de 12 horas com as luzes acesas às 6:00 da manhã Antes do teste, coloque o tanque de meio galão com as cobaias em uma superfície branca durante a noite por pelo menos 12 horas antes do teste. O ensaio de comportamento deve ser feito em uma área tranquila e de baixo tráfego com iluminação fluorescente padrão.

Prepare dois tanques de teste de meio galão nos cantos externos do que será o tanque interno. Use um Sharpie para marcar a linha d'água a cinco centímetros acima do fundo. Também para o tanque interno, identifique quaisquer reentrâncias em seu interior.

Encha-os com um composto inerte para evitar que os girinos permaneçam neles. Agora volte a atenção para o segundo tanque externo. Para a próxima etapa, obtenha fita isolante preta e papel de seda branco.

Use a fita para cobrir o exterior de uma metade do tanque e o lenço de papel para cobrir o exterior da outra, conforme mostrado aqui. Depois que os tanques estiverem preparados, monte uma plataforma giratória de inoculação e coloque os tanques aninhados nela. Posicione um tripé e uma webcam para que a câmera possa visualizar o interior dos tanques de cima.

Conecte a webcam a um computador com software de captura e reprodução de vídeo. Ligue a câmera e prepare-se para fazer uma nova gravação de filme. Em seguida, coloque um pano de algodão leve sobre a câmera e os tanques.

Para reduzir as pistas externas aos girinos, use o medidor de luminância e verifique se a luminância sob o pano está entre 35 a 50 velas por metro quadrado. Inicie o ensaio de comportamento recuperando o tanque de teste interno. Encha-o com água de sapo até a marca de cinco centímetros.

Use uma rede para transferir um animal de seu recipiente de meio galão para o tanque de teste interno no computador. Certifique-se de que o software de gravação esteja aberto e gravando a área de teste para manutenção de registros. Escreva o nome do animal, a data e a hora em um pedaço de papel.

Coloque-o sob a câmera para gravação. Feito isso, predefina um cronômetro para dois minutos. Em seguida, oriente o tanque externo no toca-discos, de modo que o lado preto fique à direita.

Agora coloque o tanque de teste no tanque externo. Na área de gravação, feche a cortina e use a tela do computador para garantir a orientação do tanque externo. Certifique-se de que o vídeo está sendo gravado e inicie o cronômetro.

Quando o cronômetro emitir um bipe, mantenha a cortina na posição e remova o tanque de teste interno. Em seguida, gire o tanque externo 180 graus para que o lado preto fique à esquerda. Retorne o tanque de teste para o tanque externo e inicie o temporizador de dois minutos.

Novamente, remova o tanque interno. Gire o tanque externo em 180 graus e substitua o tanque interno a cada dois minutos por um total de 10 vezes. Quando terminar, pare a gravação do vídeo.

Retorne o girino ao seu tanque de meio galão. Prepare um microscópio para realizar o retinol ex. Encha uma placa de Petri de 60 milímetros com 1%aros derretido em 0,1 XMMR e deixe solidificar.

Remova um pequeno pedaço retangular do aros do tamanho do girino. Quando estiver pronto para prosseguir, recupere o animal de teste e coloque-o em 0,02% Trica. Continue quando não responder a um beliscão de cauda com a pinça número três.

Em seguida, transfira o animal para o prato. Prossiga montando a placa de Petri no microscópio. Prepare-se para segurar o animal com uma pinça de um lado.

No lado oposto, use uma agulha de calibre 25 para perfurar a pele atrás da região dorsal do olho em um ângulo de 45 graus, alcance cuidadosamente o orifício com o número cinco, fórceps e corte o nervo óptico, evitando a veia próxima a ele. Vire o nervo para fora do caminho e retraia a pinça após a cirurgia. Recupere o animal colocando-o em uma placa de Petri de 100 milímetros com 0,7 XMMR e 50 microgramas por mililitro.

Gentamicina por 20 minutos. Depois disso, transfira o girino para um tanque de recuperação com água de sapo. Coloque o tanque em uma superfície branca em preparação para o teste.

Deixe o animal descansar durante a noite. Na manhã seguinte, use o ensaio comportamental para testar a função visual. Este filme mostra dados representativos para o experimento.

À esquerda estão os animais antes da cirurgia, à direita estão os mesmos animais após os axônios da retina de ambos os olhos terem sido cortados. Isso é indicado pelo esquema nos cantos inferiores. A água foi perturbada para mostrar que nada foi adicionado para repelir os animais do lado preto ou atraí-los para o lado branco.

Os girinos pré-operatórios respondem à cor de fundo em menos de 30 segundos, enquanto os girinos cegos nadam sem rumo ao redor do tanque. Este gráfico mostra a porcentagem de tempo gasto nas regiões branca e preta para um único animal em três condições. Primeiro, o animal foi observado antes de qualquer cirurgia usando o ensaio.

Em dois dias consecutivos após o corte do nervo óptico direito, seu comportamento foi observado ao longo de dois dias de testes. Finalmente, depois que ambos os nervos ópticos foram cortados, houve mais dois dias de observação com o ensaio. O animal passou mais dias no lado branco do tanque quando pelo menos um nervo óptico estava intacto.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como testar a visão dos girinos usando reagentes simples e equipamentos encontrados na maioria dos laboratórios de sapos. Boa sorte com seus experimentos.