Um Ensaio Comportamental simples para Teste de Função Visual em

O objetivo geral deste procedimento é testar a função visual de girinos registrando a quantidade de tempo que o animal passa na metade do aquário de teste que é coberta com preto. Isso é realizado primeiramente criando girinos até os estágios 45 a 50. O segundo passo é montar um aquário com metade preta e metade branca, juntamente com uma câmera para o ensaio comportamental.

Em seguida, coloque um segundo tanque com um girino dentro do tanque externo. Para cada registro de girino, observe o comportamento guiado pela visão enquanto o fundo do ambiente é alterado. O passo final é realizar uma exsodemia retiniana nos girinos e, em seguida, repetir o ensaio de comportamento.

No final, os dados desse ensaio simples e de baixo custo são utilizados para demonstrar que os girinos têm preferência por nadar em um lado do tanque em vez do outro, sob testes de visão fototópica. A principal vantagem do uso deste método em comparação com outras técnicas, como a resposta cinética óptica ou o ensaio de movimento rápido da cauda, é que se trata de um método barato e simples, que utiliza equipamentos facilmente disponíveis na maioria dos laboratórios de opus. Para preparar os girinos, primeiramente, obtenha embriões fertilizados de Xenopus, coloque-os em solução de Ringer modificada de Marc ou MMR diluída por um fator de 10 em placas de Petri de 60 milímetros com 50 microgramas por mililitro.

Coloque o antibiótico gentamicina em embriões do estágio de blástula ao estágio de placa neural. Incube os estágios dois a 15 a 18 graus Celsius em placas de Petri. Assim que os embriões atingirem o estágio de taça nova, por volta dos estágios 27 a 30, transfira-os para MMR 0,1 X sem antibióticos para permitir o crescimento bacteriano no intestino.

Quando os girinos atingirem a fase de alimentação, por volta da fase 45, transfira-os para placas de Petri de 100 milímetros com 0,1 XMMR. No dia seguinte, alimente-os com o sobrenadante de pó de urtiga. Após uma semana na placa de Petri de 100 milímetros, encha um tanque de meio galão com água para rãs.

Transfira os animais para o tanque e continue com a programação de alimentação com o sobrenadante de pó de urtiga, mas troque a água somente duas a três vezes por semana. Quando os animais estiverem em tanques de meio galão, mantenha-os em um ciclo de 12 horas de luz e 12 horas de escuro, com as luzes acendendo às 6:00 da manhã. Antes dos testes, coloque o tanque de meio galão com os animais sobre uma superfície branca durante a noite, por pelo menos 12 horas antes do teste. O ensaio comportamental deve ser realizado em uma área silenciosa e com pouco tráfego, sob iluminação fluorescente padrão.

Prepare dois tanques de teste de meio galão para ninho nos cantos externos do que será o tanque interno. Use uma caneta Sharpie para marcar a linha d'água a cinco centímetros acima do fundo. Também para o tanque interno, identifique quaisquer reentrâncias em seu interior.

Preencha-os com um composto inerte para impedir que os girinos permaneçam neles. Agora, direcione a atenção para o segundo tanque externo. Para a próxima etapa, obtenha fita isolante preta e papel-toalha branco.

Use a fita para cobrir a parte externa de uma metade do tanque e o papel-toalha para cobrir a parte externa da outra, conforme mostrado aqui. Depois que os tanques estiverem preparados, monte uma mesa giratória de inoculação e coloque os tanques encaixados sobre ela. Posicione um tripé e uma webcam de modo que a câmera possa capturar a imagem do interior dos tanques de cima para baixo.

Conecte a webcam a um computador com software de captura e reprodução de vídeo. Ligue a câmera e prepare-se para fazer uma nova gravação de vídeo. Em seguida, coloque um pano leve de algodão sobre a câmera e os tanques.

Para reduzir os estímulos externos aos girinos, utilize um fotômetro e verifique se a luminosidade sob o tecido está entre 35 e 50 velas por metro quadrado. Inicie o ensaio comportamental recuperando o tanque interno de testes. Encha-o com água de rã até a marca de cinco centímetros.

Use uma rede para transferir um animal do seu recipiente de meio galão para o tanque interno de teste no computador. Certifique-se de que o software de gravação esteja aberto e gravando a área de teste para fins de registro. Escreva o nome do animal, a data e a hora em uma folha de papel.

Coloque isso sob a câmera para a gravação. Após isso, configure um temporizador para dois minutos. Em seguida, posicione o tanque externo sobre o prato giratório, de modo que o lado preto fique à direita.

Agora coloque o tanque de teste dentro do tanque externo. Na área de gravação, feche a cortina e use a tela do computador para verificar a orientação do tanque externo. Certifique-se de que a gravação de vídeo esteja em andamento e inicie o cronômetro.

Quando o temporizador apitar, mantenha o campo cirúrgico na posição e remova o tanque de teste interno. Em seguida, gire o tanque externo 180 graus para que o lado preto fique agora à esquerda. Recoloque o tanque de teste dentro do tanque externo e inicie o temporizador de dois minutos.

Novamente, remova o tanque interno. Gire o tanque externo em 180 graus e substitua o tanque interno a cada dois minutos, por um total de 10 vezes. Ao finalizar, pare a gravação de vídeo.

Retorne o girino para seu aquário de meio galão. Prepare um microscópio para realizar a retirada de retinol por exsodômio. Encha uma placa de Petri de 60 milímetros com 1% de ágar derretido em 0,1 XMMR e deixe solidificar.

Remova um pequeno pedaço retangular dos aros com o tamanho do girino. Quando estiver pronto para prosseguir, recupere o animal de teste e coloque-o em Trica 0,02%. Prossiga quando não houver resposta ao aperto na cauda com pinça número três.

Em seguida, transfira o animal para a placa. Prossiga montando a placa de Petri no microscópio. Prepare-se para imobilizar o animal com uma pinça de um dos lados.

No lado oposto, use uma agulha de 25 graus para perfurar a pele atrás da região dorsal do olho em um ângulo de 45 graus, alcance cuidadosamente o orifício com a pinça número cinco e corte o nervo óptico evitando a veia ao lado. Vire o nervo para fora do caminho e retire a pinça após a cirurgia. Recupere o animal colocando-o em uma placa de Petri de 100 milímetros com 0,7 XMMR e 50 microgramas por mililitro.

Gentamicina por 20 minutos. Em seguida, transfira a rã-touro para um tanque de recuperação com água para rãs. Coloque o tanque sobre uma superfície branca em preparação para o teste.

Deixe o animal descansar durante a noite. Na manhã seguinte, utilize o ensaio comportamental para testar a função visual. Este vídeo mostra dados representativos do experimento.

À esquerda estão os animais antes da cirurgia; à direita estão os mesmos animais após os axônios retinianos de ambos os olhos terem sido seccionados. Isso é indicado pelo esquema nos cantos inferiores. A água foi agitada para mostrar que nada foi adicionado para repelir os animais do lado preto ou atraí-los para o lado branco.

Os girinos pré-cirurgia respondem à cor de fundo em menos de 30 segundos, enquanto os girinos cegos nadam sem rumo pelo tanque. Este gráfico mostra a porcentagem do tempo gasto nas regiões branca e preta para um único animal sob três condições. Primeiro, o animal foi observado antes de qualquer cirurgia utilizando o ensaio.

Em dois dias consecutivos após o nervo óptico direito ter sido seccionado, seu comportamento foi observado durante dois dias de testes. Finalmente, após ambos os nervos ópticos terem sido seccionados, houve mais dois dias de observação com o ensaio. O animal passou mais dias no lado branco do aquário quando pelo menos um nervo óptico estava intacto.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como testar a visão de girinos utilizando reagentes e equipamentos simples encontrados na maioria dos laboratórios de rãs. Boa sorte com seus experimentos.