De gravidade reduzida Manifestações ambiente de hardware de uma tecnologia de mistura de fluxo Cytometer e Companion microfluídicos Prototype Miniaturized

O objetivo geral deste procedimento é operar um citômetro de fluxo miniaturizado a bordo de um voo parabólico em gravidade reduzida, utilizando preparação de componentes e procedimentos em voo potencialmente adaptáveis a outras configurações. Isso é alcançado primeiramente pela seleção cuidadosa de componentes comerciais e fabricados sob medida, escolhidos pela facilidade de uso e segurança em gravidade reduzida. O segundo passo consiste em montar os componentes dentro de uma estrutura de teste para voo parabólico, que contém elementos adicionais para contenção, visualização, automação e facilitação de múltiplas demonstrações.

Em seguida, a equipe se prepara para experimentações bem-sucedidas em voo por meio de um planejamento minucioso, desenvolvimento de protocolos e treinamento. O passo final consiste em demonstrações multicomponentes em voo. Em última análise, os testes em voo parabólico são utilizados para demonstrar as possíveis aplicações espaciais da tecnologia e para identificar os efeitos da microgravidade, mudanças gravitacionais e vibrações no desempenho.

Embora este método possa ser aplicado à citometria de fluxo e tecnologias relacionadas, ele também pode ser aplicado parcialmente a outros tipos de testes diagnósticos individuais em gravidade reduzida, especialmente em qualquer procedimento que envolva múltiplas demonstrações ou etapas acionadoras. Por isso, decidimos produzir este vídeo para a JO sobre testes em voo parabólico, porque, quando estávamos nos preparando para nossos voos parabólicos com a nasa, essencialmente não havia muitos vídeos, nem mesmo literatura, descrevendo como melhor se preparar para os experimentos. Na verdade, tivemos que nos esforçar muito para conversar com as pessoas certas em diversos setores da NASA a fim de obter essas informações aqui.

Neste caso, queremos ser capazes de compartilhar essas informações com o público leitor da JoVE, para que eles também possam se preparar adequadamente para esses voos. A construção de um sistema simples de citometria de fluxo para uso em condições de gravidade reduzida exige múltiplos componentes prototípicos de fluidica, óptica e eletrônica. Comece preparando um sistema de pressão com necessidades mínimas de peso e energia para acionar o sistema.

A fluidica conecta uma bomba de ar miniaturizada a um sensor de pressão diferencial. Em seguida, monte um recipiente fonte de fluido que possa ser carregado sem aprisionar bolhas de ar. Um frasco de plástico rígido com um diafragma de borracha elástica, tampa firmemente fixável e tubo de entrada de ar na base do frasco.

Selar a conexão do tubo de entrada de ar usando adesivo óptico. Coloque um prendedor de lâmina temporário sobre o tubo de saída da cápsula para evitar a expulsão de fluido durante e após a inserção da cápsula. Para carregar o frasco, expanda o diafragma com uma seringa conectada à entrada de ar.

Despeje o fluido até o topo e insira a tampa em um ângulo de modo que nenhum ar fique aprisionado por baixo. Remova brevemente a braçadeira da lâmina para escorvar o tubo de saída e liberar a pressão de colapso exercida pelo diafragma. Certifique-se de que a bomba pressurize o frasco sem vazamentos de ar ou fluido.

Comprimir o diafragma para impulsionar o fluxo de fluido para fora do tubo de saída do capilar. O terceiro componente necessário é um recipiente para descarte de fluido, que colete os resíduos sem gerar uma pressão contrária que comprometa o fluxo. Utilize um frasco colado dentro de outro frasco, projetado para contenção dupla.

Tampe os frascos com uma janela de espuma fixada que retém líquidos flutuantes, mas permite a equalização da pressão do ar com o ambiente da cabine, para criar um carregador de amostras para uso em máquinas de gravidade reduzida, e monte um projeto de grampo com mola e trilhos-guia de forma que prenda com confiabilidade o capilar com revestimento entre dois anéis O na linha de fluido. Certifique-se de que, na ausência de um capilar, as molas pressionem os anéis O juntos para completar a linha de fluido e permitir o escorvamento sem vazamentos. Projete um microagitador que não dependa de subcomponentes mecânicos com alimentação elétrica para funcionar.

Utilizando o método de protótipo rápido de polimetilmetacrilato, escolhe-se e fabrica-se um micro-misturador em espiral com dois canais de entrada para detectar partículas individuais em fluxo. Monte um bloco óptico miniatura do tamanho de uma palma, fabricado sob medida, em uma placa de montagem de microscópio utilizando componentes optomecânicos comercialmente disponíveis. O passo final na montagem do protótipo é projetar a eletrônica e o software para controle do dispositivo e aquisição de dados.

Para maior conveniência e prototipagem inicial, utilize peças montadas manualmente conectadas a placas comerciais de aquisição de dados, código e programa, bem como um software personalizado para operar os dispositivos do equipamento e sincronizar todos os dados. Remova a bateria do laptop e configure o laptop para funcionar exclusivamente através do cabo de energia. Por razões de segurança em voos de gravidade reduzida, o esquema elétrico para alimentação de todos os dispositivos deve incluir um mecanismo para desligamento eletrônico rápido e completo.

Em voo. Uma única régua de tomadas com um único botão liga-desliga está conectada ao painel de distribuição de energia da aeronave para garantir um desempenho bem-sucedido em voo; nesse caso, é necessário considerar o espaço total disponível e como ele será dividido entre o espaço do equipamento experimental e o espaço ao redor do equipamento destinado ao usuário. O espaço total disponível é limitado a uma área menor do que a fornecida para uma demonstração similar em solo.

Determine quais componentes são mais adequadamente acessados em altura de joelhos no chão ou em pé. Também é importante considerar quais componentes se beneficiarão mais da proteção obtida dentro de uma estrutura de suporte. A estrutura de suporte do equipamento aqui é um rack vertical de equipamentos que pode resistir às acelerações do voo e ser firmemente fixado à aeronave pretendida.

Os componentes atribuídos ao piso da cabine foram organizados em níveis dentro do rack: um nível superior para acomodar o laptop, um nível intermediário para conter subcomponentes do protótipo e um nível inferior para armazenar lenços extras, luvas e um recipiente para resíduos diversos. Para fixar e conter o protótipo e permitir a visualização das amostras, é necessário fabricar ou adaptar diversos componentes que não fazem parte do protótipo. Esses componentes incluem uma caixa personalizada de acrílico para acomodar a eletrônica e uma caixa de luvas personalizada de acrílico com orifícios de acesso para os braços, que fornece um espaço cúbico no qual se pode realizar uma demonstração do carregador sem risco de contaminar a cabine de voo.

Para gravar uma demonstração do parafuso do microagente, utilize um microscópio estéreo montado na placa de montagem, equipada com um suporte personalizado em acrílico para o chip e uma câmera CCD. Para permitir uma demonstração segura do bloqueio óptico, use uma caixa opaca personalizada em acrílico para bloquear a luz ambiente e controlar os riscos associados ao laser. Algumas estratégias simples de design podem eliminar a necessidade de tubos manuais, ajustes em tempo real ou outras ações que exijam grande destreza.

Por exemplo, para pressurizar vários arquivos de origem simultaneamente, utilize uma máquina personalizada para pressurizar um coletor composto por um cilindro vazado, adaptado a uma agulha de entrada e múltiplas tubulações de saída para controlar a direção do fluxo de fluido. Usando o computador, monte um painel de válvulas solenoides de três vias. Controlado por interruptores MOSFET em tandem ligados a uma placa DAQ.

As válvulas solenoides de três vias possuem uma porta comum que está sempre conectada à porta padrão desligada ou à porta ligada. A comutação para o estado ligado é acionada por um sinal de cinco volts. Programou-se o software para avançar nas demonstrações por meio de intervenções únicas com um botão, como um único clique no laptop para alternar os estados da válvula ou alterar a pressão de acionamento da bomba.

Isso evita a necessidade de ajustes manuais de tubulação que podem causar vazamentos no ambiente e perda de tempo experimental em um ambiente caótico. A demonstração do carregador de amostras inclui o carregamento de uma amostra e o transporte da amostra até o bloco óptico ou OB para detecção. A configuração utiliza duas válvulas, uma antes e outra após o carregador.

Durante o carregamento, ambas as válvulas são configuradas para desligadas, impedindo o movimento do fluido enquanto o carregador é utilizado; ao ligar as válvulas, abre-se o trajeto do fluido em X, que se estende do frasco de solução salina até o frasco de descarte, permitindo que a bomba impulsione a amostra para análise. A demonstração do bloco óptico inclui a detecção sequencial de três tipos diferentes de amostras, sem necessidade de alterar manualmente as conexões dos tubos; a solução salina é capaz de lavar o sistema entre as amostras. A demonstração do micro-misturador inclui segmentos de mistura de sangue com solução salina e de corantes azul e amarelo.

O sistema utiliza duas válvulas para direcionar a pressão para os frascos de sangue e soro fisiológico ou para os frascos de corante, de modo que apenas uma demonstração de mistura esteja ativa por vez. Uma válvula adicional permite a injeção de bolhas de ar no chip de mistura de sangue e soro fisiológico. O sistema deve ser preparado para forças repentinas, vibrações ou colisões de passageiros durante o voo.

Para estabilização do alinhamento, aplique epóxi de secagem rápida aos componentes alinhados que são facilmente desajustados, particularmente os componentes ópticos. Aplique também epóxi de grau industrial sobre o epóxi de secagem rápida para fixar outros componentes conforme necessário, incluindo o acoplamento da câmera CCD à peça I do microscópio para testes de perturbação física. Agite a estrutura de suporte com todos os componentes posicionados.

Verifique a funcionalidade individual de cada componente após submeter o equipamento à perturbação, especialmente os componentes ópticos alinhados treinados para ocorrências inesperadas durante o voo, incluindo a aeronave nivelando subitamente no meio de um experimento ou forças súbitas atingindo o equipamento. Proteja os passageiros flutuantes adicionando almofadas ao rack. Treine múltiplos indivíduos como operadores principais para operar com perícia o dispositivo em voo.

É imprevisível quem ficará doente durante os voos parabólicos e um determinado usuário pode não ser afetado em um voo e adoecer em outro. Verifique o equipamento após o transporte até o local do voo, faça os reparos necessários e configure as conexões de tubos antes de carregar na aeronave. Em cada dia de voo, prepare e conecte os frascos de amostra correspondentes às demonstrações do dia.

Prepare-se para possíveis longos intervalos entre a preparação e o experimento, bem como para altas temperaturas ambientes, dependendo do local do voo. Evite enjoo durante o voo tomando medicamentos fornecidos, como escopolamina com anfetamina, e utilize várias parábolas iniciais para se adaptar às transições de gravidade, levantando-se lentamente paralelamente ao chão e deitando-se completamente durante os períodos de alta gravidade. Uma vez na posição de voo, os operadores do equipamento, ao se aproximarem do espaço aéreo designado para as parábolas, devem garantir espaço suficiente para se deitarem durante os intervalos de alta gravitação e permitir o acesso às cintas de pernas assim que as parábolas começarem.

Não aplique forças intensas ao corpo durante a gravidade reduzida, pois isso pode lançar o corpo para cima muito rapidamente e de forma potencialmente perigosa para a demonstração do carregador de amostras. Quando o avião entrar na fase de gravidade reduzida, use a seringa de amostra para colocar uma gota da mistura de corante com microesferas de contagem na ponta do dedo. Para simular uma amostra de furo no dedo, use um consumível capilar para coletar a amostra do dedo e carregue a amostra no carregador capilar.

Direcione a amostra para o sistema óptico para detecção. Realize a demonstração do misturador microfluídico montado sob o microscópio. Misture sangue e soro fisiológico em uma proporção de um para um a 1,52345 e seis PSI por pelo menos duas parábolas cada.

Gravar dados de vídeo sincronizados com outras leituras. Aqui é mostrada a filmagem real em voo de uma demonstração de um misturador. Injete ar na entrada de solução salina para testar se a arquitetura do canal irá aprisionar uma bolha que possa impedir a mistura ideal. Misture.

Corantes alimentares azul e amarelo a 1,52345 e seis PSI por pelo menos duas parábolas cada. Novamente, os dados sincronizados registrados aqui são resultados representativos de duas demonstrações de micromisturadores conforme visualizados por uma câmera CCD acoplada ao painel do microscópio estéreo. O painel A mostra a mistura dos corantes azul e amarelo sob condições de microgravidade, e o painel B mostra a mistura de sangue e solução salina sob condições de gravidade lunar.

A mistura pode ser avaliada visualmente em qualquer ponto da espiral, bem como no canal de saída, em uma demonstração de detecção óptica por bloqueio de células brancas do sangue marcadas com fluorescência durante voo em microgravidade. As métricas críticas de desempenho para os dados de citometria de fluxo incluem o coeficiente de variação das intensidades de pico, as relações sinal-ruído, as taxas de contagem de picos e a eficiência de detecção, conforme mostrado aqui. A detecção óptica por bloqueio parece relativamente inalterada pela transição de aproximadamente 1,5 G para quase zero G e continua durante a transição de volta para 1,5 g.

A detecção de microesferas fluorescentes de contagem adicionadas a uma amostra carregada, após a demonstração do carregador em gravidade lunar, indica que a amostra foi carregada com sucesso e alcançou o bloco óptico para detecção. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma compreensão melhor de como realizar testes do dispositivo e reduzir a gravidade a bordo de um voo parabólico, e particularmente quais tipos de procedimentos são viáveis; um planejamento cuidadoso, seleção de peças e implementação de testes ajudam a garantir um alto rendimento da sua experiência.