Medir a função respiratória em ratos usando Unrestrained pletismografia de corpo inteiro
12 de agosto de 2014
A avaliação da fisiologia respiratória, tradicionalmente invocado técnicas, que exigem contenção ou sedação do animal. Unrestrained pletismografia de corpo inteiro, no entanto, fornece uma análise precisa, não-invasivo, quantitativo de fisiologia respiratória em modelos animais. Além disso, a técnica permite a avaliação repetida respiratório de ratos permitindo estudos longitudinais.
O objetivo geral deste procedimento é medir os parâmetros respiratórios de um roedor consciente usando pletismografia de corpo inteiro sem restrições. Isso é feito calibrando primeiro o amplificador da ponte. Uma vez calibrado, um camundongo é colocado dentro da câmara de pletismografia e pode se aclimatar antes do teste.
Em seguida, as mudanças de pressão que ocorrem dentro da câmara são registradas. Múltiplos parâmetros respiratórios são então calculados a partir das informações obtidas durante o uso do sistema de pletismografia. Os resultados mostram que a pletismografia de corpo inteiro sem restrições é uma avaliação confiável da função pulmonar em roedores.
As principais vantagens dessa técnica em relação aos métodos existentes, como a pletismografia invasiva, são que os animais não são anestesiados, o que significa que não estamos associando artefatos à anestesia. Além disso, devido à natureza não invasiva deste protocolo, você permite medidas longitudinais. Em geral, os indivíduos que são novos nessa técnica tendem a subestimar o tempo necessário para aclimatar os animais à câmara de plasma.
Para começar, configure o amplificador de ponte da máquina de aquisição de dados e o transdutor de pressão. Quando estiver pronto, vá para o computador e abra o software de análise. Abra a opção de configurações de canal encontrada na barra de ferramentas de configuração e altere o número de canais gravados para um.
Em seguida, configure o aparelho de coluna de água conforme demonstrado. Conecte duas pipetas sorológicas de cinco mililitros com tubos de plástico. Encha as colunas com água e certifique-se de que os níveis de água estejam equilibrados.
Com uma régua, conecte um pedaço de tubo de plástico ao topo de cada pipeta. Para calibrar o amplificador da ponte, primeiro conecte uma seringa de um mililitro cheia de 300 microlitros de ar no lado direito da coluna d'água. Conecte a tubulação do lado esquerdo ao conector do transdutor de pressão.
Em seguida, abra o menu de rolagem para baixo e selecione bridge amp. Insira as configurações corretas e clique em zero para definir o rastreamento em aproximadamente zero milivolts. Quando estiver pronto, pressione a seringa de um mililitro, a pressão resultante moverá a água na coluna em um centímetro e mostrará um pico repentino no software devido à mudança de pressão.
Em seguida, selecione as unidades de entrada na janela do amplificador da ponte e destaque o rastreamento de fundo antes do pico, também conhecido como região zero. Clique na seta ao lado de 0,1 para produzir o sinal de fundo dentro dos intervalos de 0,002 milivolts negativos e 0,002 milivolts positivos. Digite zero na janela adjacente à janela de sinal de fundo.
Destaque a região de aumento da pressão no gráfico de quando a seringa foi pressionada. Clique na seta ao lado de 0,2. O valor deve estar na faixa de 0,9 a 1,2 milivolts.
Em seguida, digite um na janela. Ao lado da janela de pressão aumentada, vá para definir unidades e selecione centímetros H2O e clique em OK. Retorne ao menu do amplificador da ponte.
Selecione um milivolt e defina o amplificador para zero. Isso completará a calibração e a coluna de água poderá ser removida com segurança. Para obter os melhores resultados, os animais de ensaio devem ser introduzidos na câmara de pletismografia uma semana antes do início da experimentação.
Para começar, coloque a temperatura relativa umidade, sonda em uma extremidade inteira da câmara de pletismografia e registre a temperatura, umidade e pressão barométrica. Depois de registrar o peso e a temperatura corporal do animal, coloque-o na câmara de pletismografia e feche a câmara. Em seguida, insira o transdutor e a seringa nos dois orifícios do outro lado da câmara.
Pressione start no programa de software e grave por até 45 segundos. Certifique-se de registrar cinco segundos de dados quando o animal não estiver se movendo. Pare a gravação após 45 segundos e remova o mouse da câmara de pletismografia.
Registre imediatamente a temperatura e a umidade da câmara. Retorne o mouse ao spray de gaiola e limpe a câmara com 80% de volume por volume. O etanol permite que a câmara seque e retorne à temperatura e umidade basais antes de prosseguir para o próximo mouse.
Para começar, abra o programa em tela cheia e selecione os dados. Abra a janela do mini bloco de dados e selecione as medições do ciclo na coluna da esquerda e a altura cíclica média. Na coluna da direita da coluna um, selecione a opção e defina a escala para detecção de pico mínimo como um.
Isso apresentará a deflação de pressão devido à medição do volume corrente PT no mini bloco de dados. Selecione as medições de ciclo seguidas pela contagem de eventos para apresentar a medição da frequência F. Em seguida, selecione as medições do ciclo seguidas pelo período cíclico médio para apresentar a medição total do tempo do ciclo respiratório T tote seconds para gerar valores de pico de inspiração e tempo de expiração, certifique-se de que o cursor esteja diretamente sobre o máximo do pico do vale e adicione um comentário sobre nove picos e vales sequenciais.
Abra uma nova janela e clique em informações de seleção na coluna da esquerda e duração na coluna da direita antes de selecionar. Ok, selecione a macro encontrada na parte superior do programa para iniciar a gravação. Em seguida, localize a primeira caixa de comentários usando a ferramenta fina.
Vá para o início do arquivo, seguido do primeiro comentário e selecione o comando adicionar ao bloco de dados. Por fim, selecione begin Repeat nos comandos de macro e confirme se a janela de contagem de repetições está definida como nove. Use a opção localizar próximo e selecione o comando adicionar ao bloco de dados.
Quando terminar, selecione e repita. Pare a gravação e salve a macro com base no número do animal. A macro agora pode ser executada para obter o tempo de inspiração ti e expiração entre cada comentário.
Como a expiração e a inspiração ocorrem consecutivamente, os dados aparecem nessa ordem e precisam ser divididos manualmente. Este traço respiratório ilustra dados consistentes apropriados de um animal de controle. Nove comentários consecutivos são adicionados nos picos e vales das oscilações respiratórias para obter parâmetros respiratórios.
Esses exemplos mostram os traços abaixo do ideal mais comuns que nunca devem ser usados para análise. Este traço foi registrado enquanto o animal estava farejando e movendo um traço com oscilações que aumentam gradualmente ao longo do tempo geralmente é causado por condensação e acúmulo de umidade. O ruído neste traço é o resultado do envolvimento do animal ou pesquisador com o equipamento.
Esta figura demonstra a função pulmonar de um camundongo com fibrose pulmonar induzida por bleomicina. Observe o padrão irregular no traço respiratório. Uma vez dominada a técnica e calibrado o equipamento, os dados podem ser coletados de cada animal em cinco minutos.
Os dados coletados podem então ser analisados e exportados para uma planilha do Excel. Embora a tentativa deste procedimento seja importante para aclimatar o camundongo à câmara de pletismografia antes de coletar dados, isso pode variar entre as linhagens de camundongos. Em média, usamos camundongos C 57 pretos de seis adolescentes, e isso levará de quatro a cinco dias antes da coleta de dados.
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Visão Geral
Este artigo discute o uso da pletismografia de corpo inteiro sem restrição para medir parâmetros respiratórios em roedores conscientes. Essa técnica não invasiva permite avaliações precisas e repetidas da fisiologia respiratória, facilitando estudos longitudinais.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Fisiologia respiratória
- Modelos animais
- Técnicas não invasivas
Contexto
- Métodos tradicionais para avaliar a fisiologia respiratória frequentemente exigem sedação ou contenção.
- A pletismografia de corpo inteiro sem contenção oferece uma alternativa não invasiva.
- Essa técnica permite medições repetidas ao longo do tempo.
- É particularmente útil para estudar a função pulmonar em roedores.
Objetivo do Estudo
- Medir parâmetros respiratórios de roedores conscientes.
- Demonstrar a confiabilidade da pletismografia de corpo inteiro sem restrição.
- Facilitar estudos longitudinais da fisiologia respiratória.
Métodos Utilizados
- Calibração do amplificador de ponte.
- Adaptação do camundongo à câmara de pletismografia.
- Gravação das alterações de pressão dentro da câmara.
- Cálculo de múltiplos parâmetros respiratórios a partir dos dados gravados.
Resultados Principais
- A pletismografia de corpo inteiro sem restrição fornece avaliações confiáveis da função pulmonar.
- Múltiplos parâmetros respiratórios podem ser medidos com precisão.
- A técnica permite avaliações repetidas nos mesmos indivíduos.
- Os resultados apoiam o uso deste método em estudos longitudinais.
Conclusões
- A pletismografia de corpo inteiro sem restrição é eficaz para o estudo da fisiologia respiratória em roedores.
- Este método melhora a capacidade de realizar pesquisas longitudinais.
- Representa um avanço significativo em relação às técnicas tradicionais baseadas em restrição.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A plestimografia de corpo inteiro sem restrição permite a medição não invasiva e repetida de parâmetros respiratórios em roedores conscientes, possibilitando a avaliação longitudinal da função pulmonar em modelos pré-clínicos. Essa abordagem reduz os efeitos interferentes da anestesia e da contenção, melhorando a confiabilidade dos dados para validação de alvos e estudos mecanicistas na pesquisa de doenças respiratórias. A técnica fornece saídas respiratórias quantitativas que podem ser utilizadas para avaliar candidatos terapêuticos e reduzir os riscos nas vias de translação.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investigar hipóteses terapêuticas mediante a quantificação de fenótipos respiratórios em modelos de doenças.
- Valor Operacional: Permitir medidas repetidas no mesmo animal para reduzir a variabilidade e aumentar o poder estatístico.
- Valor Preditivo: Apoiar a confirmação de alvos por meio de leituras reprodutíveis da função pulmonar ao longo de diferentes pontos temporais.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Prontidão do Ensaio: Prepare sistemas biológicos validados para triagem de compostos com pontos finais respiratórios padronizados.
- Saídas Quantitativas: Gere volume corrente, volume minuto e taxa de fluxo inspiratório para análise de resposta à dose.
- Reprodutibilidade: Minimize artefatos provenientes de anestesia e manipulação para melhorar a consistência do ensaio.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Aplicar em modelos de fibrose pulmonar, asma e DPOC para avaliar o impacto terapêutico sobre a mecânica pulmonar.
- Continuidade Translacional: Conectar a descoberta à validação pré-clínica utilizando monitoramento respiratório não invasivo e consistente.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Orientar critérios de avançar/não avançar com base em tendências longitudinais da função respiratória.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a otimização do composto líder e os testes de eficácia pré-clínica, especialmente para programas voltados à área respiratória.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante a medição de respostas respiratórias funcionais em animais conscientes.
- Triagem: Permite a padronização e reprodutibilidade de ensaios para avaliação dos efeitos de compostos na função pulmonar.
- Análises: Fornece parâmetros mensuráveis, como volume corrente e fração inspiratória, para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas iniciais à continuidade pré-clínica por meio de monitoramento respiratório repetido e não invasivo.
- Reutilização em Ambiente Corporativo: Funciona como uma plataforma reutilizável em diversos modelos de doenças respiratórias e séries de compostos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista em fenótipos respiratórios.
- Valor Operacional: Oferece padronização, reprodutibilidade e escalabilidade para estudos com múltiplos grupos.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir/não prosseguir e reduz riscos biológicos em estágios avançados em programas respiratórios.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco com base em dados longitudinais de função respiratória.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em fisiologia respiratória e sistemas de aquisição de dados.
- Depende de transdutores de pressão calibrados e monitoramento ambiental estável.
- Necessita de PEPs padronizados entre equipes para aclimatação na câmara e identificação de artefatos.
- Envolve considerações de adaptação entre diferentes linhagens de camundongos e modelos de doenças.
- Limitado pela suscetibilidade a artefatos de movimento e condensação ambiental, exigindo cuidadosa exclusão de valores aberrantes.
