Name: Avaliação da função respiratória em ratos conscientes por pletismografia dobro-câmara (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Aprenda a avaliar a função respiratória em camundongos conscientes usando pletismografia de dupla câmara. Este método fornece dados confiáveis para pesquisa respiratória e desenvolvimento de fármacos.

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SML é suportado por uma bolsa de estudo dos institutos canadenses de pesquisa em saúde, MG é apoiado por uma bolsa da rede saúde respiratória da FRQS (de Fonds recherche du Québec – Santé) e YB é um estudioso de pesquisa de FRQS.
CONTRIBUIÇÃO DOS AUTORES Todos os autores contribuíram para a concepção do manuscrito e/ou o vídeo. SML e LD coletaram os dados. SML, LD, YB, DM, DB e AR contribuiram para a análise dos dados, a geração de figuras e a escrita do manuscrito. YB, AR, KL e MG foram envolvidos na elaboração do roteiro de vídeo. A obra foi realizada por YB, KL e MG.

Os procedimentos a seguir foram aprovados pelo Quebec coração e pulmão Instituto Animal conta Comité em conformidade com as diretrizes do Conselho canadense no cuidado Animal (CCAC).
1. preparação
<ol><li>Estudo
	<ol>
<li>(Crítica) Antes de realizar qualquer experimento, obter as aprovações apropriadas (por exemplo, IACUC) e treinamentos (por exemplo, manipulação de animais).</li>
		<li>Familiarize-se com o equipamento e o software operacional. O manual do usuário e, se necessário, crie um arquivo de configuração para definir o número de sites, sinais, analisadores e parâmetros de entrada. Nota: Certifique-se de selecionar uma alta taxa de amostragem (2 KHz).</li>
		<li>Configure as definições de analisadores para os parâmetros de interesse.<ol>
<li>Selecione Tuning na barra de ferramentas e em seguida analisadores.</li>
			<li>Ajustar o limite de fluxo para um valor que separa corretamente as respirações (rato: 0,5 mL/s) e optar por Ti + Te calcular a taxa de respiração.</li>
			<li>Defina um valor para a pressão atmosférica (760 mm Hg) e especificar o desvio máximo de volume inspiratório/expiratório para respirar para serem considerados válidos (rato: 20%).</li>
			<li>Clique em configuração no campo calculado parâmetros para ajustar os limites de aceitação. Nota: As configurações a seguir foram utilizadas para os experimentos descritos rato: tempo de inspiração, 50 a 170 ms; tempo de expiração, 40 a 180 ms; frequência da respiração, 30 a 450 bpm; Resistência específica das vias aéreas, de 0 a 15 cmH2O·s; fluxo de midexpiratory com uma precisão de pelo menos 3 casas decimais.</li>
			<li>Uma vez concluída, selecione aplicar e fechar para sair da janela de diálogo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>No menu de barra de ferramenta, ir para Tuning novamente e, depois, armazenamento para definir uma taxa de armazenamento de dados desejado. Clique em aplicar e fechar para sair da janela. Nota: Em média a cada 10 s é normalmente usado.</li>
		<li>Crie um protocolo dentro do software operacional para definir uma sequência de comandos e o tempo desejado para cada um. Um exemplo é exibido na Figura 1.</li>
		<li>Se o experimento envolve a administração de uma substância por aerossol, prepare as soluções adequadas e diluições de acordo com as concentrações a ser testado.</li>
	</ol></li>
	<li>Animal
	<ol>
<li>Trabalhe em uma área tranquila remota da sala de habitação. Permitir que os animais se ajustar à mudança do ambiente.</li>
		<li>Pesar os animais e selecione o tamanho adequado de contenção.</li>
		<li>(Crítica) Adapte os animais para a retenção e procedimentos antes do início do experimento. Dependendo do design experimental, várias sessões de aclimatação de aumentar a duração (por exemplo, 5-30 min) podem ser necessários. Nota: Animais que não se aclimatar devem ser retirados do estudo.<ol>
<li>Em cada sessão de aclimatação, inserir o animal dentro da retenção, procedentes de volta à abertura; segurar o dispositivo na vertical pode ser útil.</li>
			<li>Uma vez que o animal está em posição, insira o êmbolo volta e suavemente trancá-lo sem aplicar força excessiva.</li>
			<li>(Crítica) Verifique visualmente que o animal respira normalmente. Se necessário, ajuste sua posição movendo o mecanismo de travamento. Certifique-se que narinas do animal estão projetando-se fora do cone de nariz com seu focinho encostadas às paredes interiores da retenção.</li>
			<li>Retire o painel traseiro da câmara torácica, inserir a retenção contendo o animal através da borracha abertura na câmara torácica e fechar a câmara.</li>
			<li>Anexar a câmara principal e fornecer um fluxo de viés. Use um fluxo de 0,5 L/min para um rato.</li>
			<li>Permitir que o animal relaxar por 5 min.</li>
			<li>Uma vez que o animal está calmo, inicie a gravação dos sinais de fluxo nasal e torácica. Verifique se na tela do computador que os traços são suaves e que eles exibem um padrão de respiração regular; consulte o exemplo na Figura 2. Nota: Se o protocolo envolve a administração de aerossóis de uma substância, um desafio salino pode ser incluído no processo de aclimatação.</li>
			<li>No final de cada sessão, retire o animal da câmara torácica e a retenção e devolvê-lo à sua habitação gaiola e quarto.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Equipamentos
	<ol>
<li>No dia do experimento, iniciar uma sessão experimental e carregar o arquivo de configuração apropriado. Nota: Verifique se que ele contém o protocolo desejado para o experimento.</li>
		<li>Vá para executar no menu da barra de ferramenta. Insira a experiência e a do animal. Uma vez feito, clique no botão executar na parte inferior da janela.</li>
		<li>Prosseguir com a calibração do sistema. Calibrar a cada site e sinal de entrada separado.<ol>
<li>Ligue o gerador de fluxo diagonal, conectá-lo à câmara de cabeça através de um pedaço de tubo e ajustar a taxa de fluxo.</li>
			<li>Feche a abertura superior da câmara de cabeça com um boné.</li>
			<li>Retirar o painel traseiro da câmara torácica, firmemente, insira a ferramenta de calibração dentro da borracha abertura entre a cabeça e a câmara de corpo para criar um selo hermético. Feche e volte a colocar o painel traseiro da câmara torácica.</li>
			<li>Verifique se que o orifício lateral da câmara torácica é limitado.</li>
			<li>O menu de barra de ferramenta de software, acesse Tuning e, em seguida, calibrar.</li>
			<li>Vá para a entrada 1 (torácica) e selecione calibrar para iniciar a caixa de diálogo de calibração para o sinal de fluxo torácica.</li>
			<li>(Crítica) Verifique se que os parâmetros listados na janela de diálogo de calibragem exibem as configurações apropriadas, ou seja, estresse físico aplicado valor baixo: 0; Estresse físico aplicado elevado valor:-20 mL/s; Amostras: integrar. Uma vez feito, clique em baixo na janela de amostras .</li>
			<li>Verifique se o sinal gerado é constante através da janela de exibição e, em seguida, clique em fechar.</li>
			<li>Conecte uma seringa 20 mL através da porta lateral da câmara torácica usando um conector de plástico e um pedaço de tubo.</li>
			<li>(Crítica) Selecionar alta na janela amostras e imediatamente injetar 20ml de ar na câmara durante um período de s 2 em uma taxa de fluxo tão constante quanto possível.</li>
			<li>Verifique se o sinal gerado aparece completamente dentro da janela de exibição. Use o ícone de seta para verificar se o sinal é centrado e simétrica em torno da linha zero. Em seguida, clique em fechar. Remover qualquer deslocamento de zero clicando em remover AC deslocamento na janela amostras Nota: A calibração de alto valor pode ser refeita, se necessário.</li>
			<li>Verifique se o resultante Scaled escala de entrada está dentro da faixa recomendada (rato: ±280 para ±420 mL/s). (Crítica) Repita as etapas de calibração, se os valores estiverem fora do intervalo aceitável.</li>
			<li>Calibre a câmara de cabeça em uma maneira similar como a câmara torácica (etapa 1.3.3.6). Desta vez, selecione a entrada 2 (nasal). Nota: (Importante) O valor para o estresse físico aplicado de alto valor deve ser definido como + 20 mL/s. Isso vai mudar a polaridade do fluxo na câmara frontal em relação a câmara traseira. Assim, quando o animal está a respirar, os fluxo de dois sinais quase será em fase, além do atraso usado para calcular sRaw.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. as medidas de função pulmonar
<ol><li>Pesar os animais e Observe seus pesos de corpo.</li>
	<li>Inserir o animal dentro da retenção e coloque-o dentro da câmara de pletismografia torácica (etapas 1.2.3.1 para 1.2.3.5).</li>
	<li>Permitir que o animal relaxar pelo menos 5 min.</li>
	<li>Iniciar o protocolo de comandos selecionando o primeiro passo e, em seguida, clique em executar.</li>
	<li>Verifique na tela do computador que a respiração do animal os sinais são regular e liso (Figura 2). O software exibe automaticamente os parâmetros calculados numa base de respiração-por-respiração. Verifique se que os parâmetros do animal são estáveis.</li>
	<li>Grave o padrão de respiração em condições de linha de base para até 10 minutos.</li>
	<li>Para protocolos que envolvem a administração de uma substância por aerossol, faça o seguinte:<ol>
<li>Ajuste o nebulizador do tempo e dever ciclo, conforme necessário. Nota: Nos exemplos demonstrados neste artigo, o nebulizador foi operado em um ciclo de serviço de 5% para 10 s.</li>
		<li>Realizar um desafio do veículo (por exemplo, solução salina) e gravar a resposta.</li>
		<li>Se necessário, expor o animal a aumentar as concentrações da substância, alterando a concentração no nebulizador em escalada etapas (por exemplo, dobrando as concentrações). Grave a resposta depois de cada administração.</li>
		<li>No final da sessão experimental, se não for feito automaticamente, parar a gravação e devolver o animal para sua gaiola de habitação e o quarto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se necessário, selecione executar no menu de barra de ferramenta para executar outra sessão experimental.<ol>
<li>Entre as sessões, limpe as câmaras pletismografia e passe o nebulizador com água. Nota: O uso de álcool pode causar danos irreversíveis a pletismografia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se o estudo envolve avaliações repetidas ao longo do tempo, repita a sequência inteira de medição em cada commit escolhido. Nota: Recomenda-se sabiamente para complementar o estudo com algumas medidas precisas de mecânica respiratória e/ou volumes de pulmão1,15.</li>
</ol>3. análise de dados
Nota: O software automaticamente salva o arquivo experimental e exporta os parâmetros gravados quando a sessão experimental é fechada.
<ol><li>Calcule uma média de linha de base para os parâmetros de interesse para cada grupo de animal e experimental. Nota: tabela 1 enumera uma série de parâmetros típicos, categorizados com base no tipo de informação que eles fornecem.</li>
	<li>Quando relevante, avaliar o efeito da substância aerossol estudada sobre os parâmetros de interesse a cada concentração usando um ponto específico (por exemplo, valor máximo ou mínimo), uma média ou o curso a tempo inteiro; também pode ser considerada uma normalização para linha de fundo.</li>
	<li>Relate os resultados usando os meios de grupo e erros em uma tabela ou um formato gráfico. Analise os resultados estatisticamente. Nota: No presente estudo, ANOVA de duas vias com repetidas medidas foram utilizadas para avaliar o efeito de metacolina, o alérgeno – casa-ácaro (HDM) – e sua interação em diferentes leituras do DCP (sRaw e EF50), bem como em diferentes leituras FOT (R,N, G e H), em ambas as cepas de ratos. Testes de comparação múltipla do Sidak foram então usados para determinar as concentrações de metacolina na qual os ratos alérgicos diferem os ratos controle. Os mesmos testes foram utilizados para avaliar o efeito de dias, HDM e sua interação na linha de base (ou seja, antes de metacolina) em leituras de obstrução das vias aéreas (sRaw e EF50) e do padrão de ventilação (BF, TV, MV e EIP). Correlações de Pearson foram usadas para avaliar as correlações entre sRaw obtidos com o DCP e RN obtidos com o FOT. Todas as análises estatísticas e gráficos foram realizados usando o software estatístico padrão alternativo (por exemplo, GraphPad Prism). p ≤ 0,05 foram considerado suficiente para rejeitar a hipótese nula.</li>
</ol>

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A capacidade de medir a função pulmonar em animais conscientes é claramente justificada na investigação respiratória. Em geral, o DCP é uma abordagem interessante para avaliar a função de ventilação do aparelho respiratório no consciente e respirando espontaneamente animais26. Mais especificamente, o DCP, ou sua variante de cabeça-para fora, muitas vezes atinge um certo equilíbrio entre a qualidade das informações prestadas e o nível desejado de invasividade3 (tabela 2). A técnica pode ser adaptada para várias espécies (por exemplo, rato, rato, cobaia) ou animais de tamanhos e pode ser usada em muitas aplicações de pesquisa. É particularmente útil para avaliar a numerosos animais ao mesmo tempo em um projeto de estudo paralelo, para monitorar a função respiratória de forma repetida e capturar a cinética da resposta ao longo do tempo. Além disso, a técnica é simples e pode ser aprendida de forma relativamente oportuna. No presente trabalho, um protocolo empregando medidas do DCP em ratos foi usado como um exemplo para descrever os aspectos práticos do presente contido técnica pletismografia, bem como para discutir os passos críticos e relacionadas com os resultados.
Quando se trabalha com animais conscientes, é essencial para controlar as condições do ambiente circundante (por exemplo, quarto silencioso com um número limitado de pessoas ou atividade) a fim de gerar resultados reprodutíveis. Desde que os aparelhos vêm em várias dimensões, é importante começar com o tamanho adequado para que os movimentos de respiração são imperturbável. Também é útil e muitas vezes necessário para se aclimatar os animais para a montagem experimental e procedimentos, como é bem conhecido em camundongos que restrição afeta a frequência de respiração12. Dependendo do delineamento experimental ou condições, podem ser necessárias várias sessões de durações incrementais. Finalmente, permitindo tempo no início de uma experiência para os animais ajustar para a mudança de sala e manipulação necessária é uma consideração simples que se mostrou eficaz para garantir que o padrão de respiração é consistentemente regular e descontraída na linha de base. Trabalhando sob condições onde os animais são confortáveis, bem adaptados e calmo também será benéfico em termos de qualidade e variabilidade do resultado. Ela também limita qualquer liberação induzida por estresse de catecolamina, que pode aumentar o calibre das vias aéreas e atenuar uma broncoconstrição induzida.
É importante compreender que há uma necessidade de separar tão hermeticamente quanto possível os fluxos nasais e torácicos. Dependendo do sistema ou espécies estudadas, o mecanismo de vedação pode variar em forma, bem como em eficácia. O DCP nós aqui descritos, o selo é criado entre o focinho do animal e o dispositivo de restrição. Ao avaliar a função respiratória por DCP, também é essencial para fornecer um fluxo contínuo e suficiente de viés, como uma diminuição do nível de oxigênio disponível para o animal irá resultar em efeitos significativos. Tendo em conta o bem-estar do animal a retenção limita a propensão para vazamentos de ar criado por agitação e assim maximiza a qualidade dos dados. Por outro lado, estima, uma quebra no selo da resultará em conjuntos de dados rejeitados ou subestimação de alguns parâmetros.
Além para habilitar a gravação separada do sinal do fluxo nasal, câmara de cabeça normalmente é usada para expor o animal a substâncias aerossol. Conforme ilustrado neste artigo, este pode ser utilizado para executar um teste de bronchoprovocation para demonstrar diferentes graus de capacidade de resposta. Em tais experiências, ajustar o intervalo de concentrações testadas pode ser necessários dependendo da espécie, estirpe ou sexo dos animais estudados. Como demonstrado anteriormente8,9,10,27, os presentes resultados mostram que as alterações induzidas pelo metacolina na sRaw correlacionaram com medições de FOT invasivas da resistência das vias aéreas. Os resultados também demonstram que a técnica DCP não é tão sensível como o FOT por sua capacidade para detectar disfunção respiratória e identificar uma resposta alterada, localizada dentro dos compartimentos inferiores do pulmão (tecido pulmonar e/ou pequenas vias aéreas periféricas) . Desde que vias aéreas do animal estão intactas, a presença de vias aéreas superiores, que esclarece a maior parte da resistência ao fluxo de ar28respiratória total, pode afetar a distribuição de aerossóis e deposição em adição para amortecer a contribuição do as vias respiratórias inferiores para uma medição. Tabela 3 resume outras diferenças entre a técnica DCP e o FOT. Finalmente, embora seja teoricamente possível estimar a resistência de vias aéreas total do animal (incluindo vias aéreas superiores) de uma medida de sRaw, geralmente é recomendado para complementar a avaliação de DCP com uma técnica de medição invasiva, tais como o FOT29 para obter medições directas da mecânica respiratória detalhadas. Dependendo dos objectivos do estudo, as medições da resistência das vias aéreas superiores também podem ser consideradas30,31,32.
Conclusão  Devido ao seu limitado grau de invasividade, o DCP é uma técnica que pode satisfazer uma necessidade importante na investigação respiratória. É capaz de fornecer leituras precisas de padrão de ventilação em animais conscientes simultaneamente com alguns índices indiscutível de obstrução do fluxo de ar. As informações obtidas também verdadeiramente que complementa de abordagens mais invasivas.

A crescente utilização de pequenos animais para doenças respiratórias humanas modelo instou o desenvolvimento de técnicas para avaliar quantitativamente as funções do sistema respiratório em animais. Atualmente, a técnica de oscilações forçadas (FOT) é reconhecida como a abordagem mais precisa para avaliar a mecânica respiratória em animais de pequeno porte1,2. No entanto, como afirma o princípio de incerteza de fenotipagem, o que se ganha em precisão de medição com o FOT é negociada fora contra uma perda em noninvasiveness3. Com efeito, as medições FOT são adquiridas nas condições experimentais altamente controladas que exigem anestesia, traqueostomia ou intubação oral, bem como a ventilação mecânica; um cenário muito longe da vida real.
Em situações onde as exigências experimentais proscrever o uso de agentes anestésicos ou ligue para pouco ou nenhum desvio do estado fisiológico natural do animal, pode considerar-se dobro-câmara pletismografia (DCP). Como seu nome indica, uma instalação DCP consiste de duas câmaras rígidas conectadas, construídas para isolar tão hermeticamente quanto possível, a cabeça do animal (ou nariz), na câmara da frente, do seu tórax, na câmara traseira. Dentro da instalação, o animal está consciente e respira espontaneamente enquanto sendo contido. Porque as paredes das câmaras não podem expandir ou retrair, o movimento do ar entrar e sair do animal gera um correspondente mas oposta da forma de onda no interior da câmara traseira, como resultado da compressão/descompressão do ar ao seu redor. A forma de onda devido ao fluxo nasal na câmara frontal e aquela relacionada com o movimento torácico na câmara posterior, portanto, pode ser separada e capturada simultaneamente. Dependendo do projeto da instalação do DCP, estas formas de onda podem ser adquiridas usando um conjunto de transdutores de pressão ou pneumotachographs respectivamente, gravar as alterações na pressão da câmara ou do fluxo de ar entrar e sair das câmaras em função do tempo. A última abordagem é mais comum nos dias de hoje.
Enquanto a frequência de respiração do animal pode ser determinada com precisão por qualquer tipo de técnicas Pletismográfica, a situação não é a mesma para a determinação do volume corrente e seus parâmetros de ventilação relacionados (por exemplo, ventilação por minuto, volume expiratório, etc.). Ao contrário da técnica de pletismografia de corpo inteiro (WBP), onde o volume corrente do animal é estimado a partir do sinal de caixa4,5, a técnica DCP fornece avaliações precisas do volume corrente. Isto está relacionado com a aquisição direta de movimento de torácica do animal na câmara traseira, que são proporcionais às mudanças no volume pulmonar durante a respiração.
Além desses parâmetros precisos ventilatórios (por exemplo, volume corrente, frequência de respiração e ventilação por minuto), alguns distúrbios na forma do ciclo respiratório também podem ser usados para investigar aspectos neuronais que governam o unidade respiratória ou reflexos respiratórios. Um exemplo específico de tal pedido seria a avaliação do potencial de irritação de substâncias inaladas nos neurônios sensoriais das vias aéreas superiores6. Aqui, a duração de uma pausa no início da expiração é determinada usando um parâmetro chamado pausa inspiratória-final (EIP), também conhecida como duração de travagem6. O prolongamento dessa pausa por uma substância irritante é associado com o fechamento da glote do animal, causando um período mensurável de travagem na primeira parte da expiração6,7.
Outra vantagem importante do DCP é que fornece dois parâmetros validados e indiscutível que são sensíveis à obstrução do fluxo de ar. Um é chamado o fluxo em meados-tidal volume expiratório e é abreviado EF508,9,10. É o fluxo de ar no volume na metade de cada respiração tidal durante a expiração. EF50 é extraído o rastreamento de fluxo torácica e pode assim ser medido sem a câmara frontal (ou seja, em uma configuração de cabeça-para fora). O outro chama-se resistência específica das vias aéreas e é abreviado sRaw11,12,13. A determinação da sRaw requer a gravação simultânea dos fluxos de nasal e torácica do animal, como ele é calculado a partir do atraso de tempo entre estes traços respiratórios separados no ponto zero fluxo no final da inspiração. A lógica que descreve a base pela qual este atraso refere-se ao sRaw foi expatiated anteriormente11. Simplificando, as mudanças no volume pulmonar precedem a circulação de ar, desde que um gradiente de pressão precisa de desenvolver-se em ordem de fluxo de ar de carro. Em um animal saudável respirar calmamente, esse atraso é normalmente muito pequeno. No entanto, o gradiente de pressão que é necessário para acomodar um determinado fluxo (por exemplo, um fluxo suficiente para fornecer a ventilação adequada) é influenciado pelo grau de resistência das vias aéreas. Durante a broncoconstrição, por exemplo, o gradiente de pressão necessária para acomodar um determinado fluxo é maior, o que implica que o animal tem que trabalhar mais para respirar. Um maior gradiente de pressão no tórax do animal também implica que uma parcela maior do fluxo de entrar e sair da câmara traseira é devido à descompressão/compressão de ar dentro do tórax, que é a parte da expansão/retração torácica total que é fora de fase com o fluxo nasal. O aumento da resistência devido a broncoconstrição assim aumentará o atraso entre a traseira e a câmara frontal e aumenta desse modo sRaw. O gradiente de pressão que impulsiona o fluxo de ar entrar e sair do pulmão também é influenciado pelo volume inicial gás torácica (TGV). A um TGV maior por exemplo, a expansão/retração do tórax necessário para gerar um determinado gradiente de pressão é maior (simplesmente porque o deslocamento do volume que é necessário para gerar um determinado gradiente de pressão é maior), o que também implica que o animal tem que trabalhar mais para respirar. Novamente, estes deslocamentos extra torácicos são aqueles necessários para descompactar/comprimir ar no tórax e são, portanto, fora de fase com o fluxo nasal. Então, um aumento de TGV também aumentará o atraso entre as câmaras e aumenta desse modo sRaw. Como pode ser visto, tanto a broncoconstrição e aumento TGV resultam em um esforço mais importante para extrair o ar entrar e sair do pulmão. Isto é, em essência, o significado fisiológico da sRaw. Ele representa o trabalho necessário para5,14de respiração.
Assim, é importante compreender que a influência de dois fatores distintos sRaw: TGV e resistência das vias aéreas. Na verdade, o sRaw pode ser expressa como o produto da resistência das vias aéreas e TGV11. Animais conscientes podem modificar seu TGV à vontade, como para se adaptar a sua ventilação para um determinado ambiente. Sob tais condições, onde o estado fisiológico natural do animal é inalterado, assim é impossível discernir se uma mudança na sRaw decorre de uma alteração na resistência das vias aéreas, de uma mudança no TGV ou de uma mistura dos dois. Portanto, é recomendável para complementar a avaliação de DCP com mais medições invasivas da mecânica respiratória e/ou volumes de pulmão, como os fornecidos pelo FOT1,15.
Até à data, o DCP tem sido usado em várias aplicações de pesquisa. A técnica pode ser usada com ou sem câmara de cabeça para quantitativamente e avaliar com precisão o efeito de várias substâncias, tais como farmacêuticos, alérgenos, irritantes ou outros mediadores, na função respiratória em animais de pequenos porte conscientes 16,17,18. A câmara frontal também pode ser usada como uma câmara expondo a substâncias aerossol ou variados gás concentrações (hipóxia, hipercapnia, etc)19. Convenientemente, permite medir concomitantemente dos efeitos agudos dessas exposições. Na verdade, um dos usos comuns do DCP é avaliar o grau de capacidade de resposta à Metacolina aerossol em diferentes modelos de doenças respiratórias20,21,22,23, 24 , 25.
Embora a técnica DCP é aparentemente simples, alguns desafios práticos potencialmente poderiam desencorajar os usuários inexperientes ou prejudicar a precisão e a reprodutibilidade dos resultados. O presente trabalho fornece uma descrição detalhada dos procedimentos recomendados para a função respiratória com sucesso recorde pelo DCP em camundongos conscientes, comedidos, respirando espontaneamente. A descrição é específica para o equipamento indicado (consulte a Tabela de materiais). O utilitário e o valor do DCP também é demonstrada em um modelo comum de inflamação alérgica pulmonar em duas linhagens de camundongos testados na linha de base e em resposta à Metacolina aerossol.

<table><tbody><tr><td>Cloreto de acetil-&beta;-metilcolina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-2251</td><td>Fosfato de Metacolina</td></tr><tr><td>tampolado salino</td><td>Multicell</td><td>311-506-CL</td><td>PBS 10X</td></tr><tr><td>Extrato de ácaro da poeira doméstica</td><td>GREER</td><td>290902</td><td>HDM&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema completo DCP</td><td>&nbsp; SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iox software</td><td>&nbsp; SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nebulizador Aerogen Aeroneb</td><td>&nbsp; SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sistema completo flexiVent FX</td><td> SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação da função respiratória em ratos conscientes por pletismografia dobro-câmara

Assessment of Respiratory Function in Conscious Mice by Double-chamber Plethysmography

Variações de volume de ar criadas por um sujeito consciente, respirando espontaneamente dentro de uma caixa de corpo são a base da pletismografia, uma técnica utilizada de forma não-invasiva de avaliar algumas características da função respiratória em humanos como em animais de laboratório. O presente artigo centra-se sobre a aplicação da pletismografia da dobro-câmara (DCP) em pequenos animais. Fornece informações básicas sobre a metodologia, bem como um procedimento passo a passo detalhado para avaliar a função respiratória em consciente, respirando espontaneamente os animais de uma forma não-invasiva com êxito. O DCP pode ser usado para monitorar a função respiratória de vários animais, em paralelo, bem como identificar alterações induzidas por substâncias aerossol durante um período de tempo escolhido e de forma repetida. Experiências em controle e ratos alérgicos são usadas neste documento para demonstrar a utilidade da técnica, explicar os parâmetros de resultado associado, bem como a discutir as vantagens relacionadas e deficiências. No geral, o DCP fornece leituras válidas e teoricamente som que podem ser confiáveis para avaliar a função respiratória dos animais pequenos conscientes na linha de base e depois desafios com substâncias aerossol.

O objetivo do presente artigo é fornecer uma descrição detalhada dos procedimentos recomendados para avaliar a função respiratória em ratos conscientes por pletismografia dobro-câmara.

Avaliação da função respiratória em ratos conscientes por pletismografia dobro-câmara

Air volume changes created by a conscious subject breathing spontaneously within a body box are at the basis of plethysmography, a technique used to ...

Essa técnica ajudará a abordar questões-chave em vários campos, incluindo pesquisa respiratória, farmacologia de segurança e desenvolvimento de medicamentos. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece leituras confiáveis para avaliar a função respiratória em animais conscientes, tanto no início quanto durante os desafios. A técnica é especialmente útil quando o protocolo experimental requer pouco desvio do estado fisiológico normal dos animais.O animal é contido, mas respira normalmente, o que permite a avaliação do padrão respiratório, além da obstrução das vias aéreas. No dia do experimento, inicie uma sessão experimental e carregue o arquivo de configuração apropriado. Digite o experimento e as informações do animal.Uma vez feito isso, clique no botão executar na parte inferior da janela. Prossiga com a calibração do sistema. Calibre cada local e sinal de entrada separadamente.Ligue o gerador de fluxo de polarização conectado à câmara do cabeçote por meio de um pedaço de tubulação e ajuste a taxa de fluxo. Feche a abertura superior da câmara da cabeça com uma tampa. Retire o painel traseiro da câmara torácica.Em seguida, insira firmemente a ferramenta de calibração dentro da abertura de borracha entre o cabeçote e a câmara do corpo para criar uma vedação hermética. Feche e recoloque o painel traseiro da câmara torácica. No menu da barra de ferramentas do software, vá para Tuning e depois Calibrate.Vá para Entrada um e selecione calibrar para iniciar a caixa de diálogo de calibração para o sinal de fluxo torácico. Verifique se os parâmetros listados na janela de diálogo de calibração exibem as configurações apropriadas. O baixo valor de estresse físico aplicado deve ser zero.O alto valor de estresse físico aplicado deve ser de menos 20 mililitros por segundo e as amostras devem ser configuradas para integrar. Uma vez feito isso, clique em baixo na janela de amostras. Verifique se o sinal gerado é constante na janela de exibição e clique em fechar.Conecte uma seringa de 20 mililitros através da porta lateral da câmara torácica usando um conector de plástico em um pedaço de tubo. Selecione alto na janela de amostras e injete imediatamente 20 mililitros de ar na câmara durante um período de dois segundos a uma taxa de fluxo o mais constante possível. Verifique se o sinal gerado aparece completamente dentro da janela de exibição.Use o ícone de seta para verificar se o sinal está centralizado e simétrico em torno da linha zero. Em seguida, clique em fechar. Remova qualquer deslocamento de zero clicando em Remover deslocamento CA na janela de amostras.Calibre a câmara da cabeça de maneira semelhante à câmara torácica, selecionando a entrada número dois. Desta vez, defina o valor alto para mais 20 mililitros por segundo em vez de menos 20. Trabalhe em uma área tranquila e distante da sala de habitação.Aclimatar os animais ao aparelho de retenção e aos procedimentos antes do início do experimento. Por não ser invasivo e não exigir anestesia, trabalhar em condições em que o animal esteja confortável, bem adaptado e calmo limitará a propensão a vazamentos de cabelo entre as câmaras e, assim, maximizará a qualidade dos dados. Pese os animais.Selecione o contenção apropriado para o animal. Insira o animal dentro do imobilizador procedente da abertura traseira. Segurar o dispositivo verticalmente pode ser útil.Quando o animal estiver em posição, insira o êmbolo traseiro e trave-o suavemente no lugar sem aplicar força excessiva. Verifique visualmente se o animal respira normalmente. Se necessário, ajuste sua posição movendo o mecanismo de travamento.Certifique-se de que as narinas do animal estejam salientes para fora do cone do nariz com o focinho apoiado nas paredes internas do sistema de contenção. Retire o painel traseiro da câmara torácica. Insira o imobilizador contendo o animal através da abertura de borracha na câmara torácica e feche a câmara.Conecte a câmara da cabeça, forneça um fluxo de polarização e deixe o animal relaxar por pelo menos cinco minutos. Assim que o animal estiver calmo, inicie o protocolo de comandos selecionando o primeiro passo e clique em Executar. Verifique na tela do computador se os sinais respiratórios do animal são regulares e suaves.O software exibe automaticamente os parâmetros calculados respiração por respiração. Verifique se os parâmetros do animal estão estáveis. Registre o padrão respiratório em condições basais por até 10 minutos.Para protocolos que envolvem a administração de uma substância de teste por aerossol, primeiro, ajuste o nebulizador no tempo e no ciclo de trabalho conforme necessário. Execute um desafio de veículo e registre a resposta. Se necessário, exponha o animal a concentrações crescentes da substância em estudo, alterando a concentração no nebulizador e aumentando as etapas.Registre a resposta após cada administração. Neste exemplo, 15 miligramas por mililitro de metacolina são testados. O aumento máximo na resistência específica das vias aéreas é registrado um momento depois e é visto retornando lentamente ao valor basal.No final da sessão experimental, devolva o animal ao seu quarto e gaiola de alojamento. Entre as sessões, limpe as câmaras do pletismógrafo e enxágue o nebulizador com água. Prossiga para a análise dos dados conforme descrito no protocolo de texto.Aqui é mostrado o resultado de uma avaliação repetida da função respiratória no início do estudo durante três dias consecutivos em dois grupos de camundongos BALB/c. Um controle um e um com inflamação alérgica pulmonar. Valores estáveis e comparáveis foram obtidos para uma seleção de parâmetros fornecidos pela pletismografia de dupla câmara.Esses valores foram plotados para frequência respiratória, volume do título, ventilação minuto, pausa inspiratória final, fluxo no volume expiratório médio do título e resistência específica das vias aéreas. Alterações na função respiratória e na resposta ao aumento das doses de metacolina inalada também foram realizadas em dias sucessivos para avaliar o grau de resposta em camundongos C57BL/6 controles e alérgicos. Os resultados mostram o aumento progressivo esperado na resistência específica das vias aéreas com doses crescentes de metacolina com um grau exagerado de capacidade de resposta nos camundongos alérgicos no segundo e no terceiro dia.No dia seguinte, a resistência newtoniana foi medida com a técnica de oscilação forçada. Alterações nesse parâmetro refletem principalmente variações na resistência das grandes vias aéreas condutoras. A resistência newtoniana medida no início e em resposta à metacolina correlacionou-se bem com a resistência específica medida das vias aéreas obtida no dia anterior nos mesmos animais.Essa técnica é conveniente para avaliar vários animais ao mesmo tempo, para capturar a cinética de uma resposta aguda, bem como para medir a função respiratória de maneira repetida durante um experimento que durou vários dias. Após o procedimento, outros métodos, como a técnica de associação forçada, podem ser realizados para complementar a avaliação com medidas diretas da mecânica respiratória, como a resistência das vias aéreas. A pletismografia de câmara dupla realmente fornece uma abordagem interessante para avaliar o padrão respiratório e a geografia da obstrução das vias aéreas, especialmente quando o protocolo experimental exigia que os animais estivessem conscientes.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

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Modelo murino de asma induzida alergénio

O presente protocolo fornece uma descrição passo-a-passo detalhado dos procedimentos necessários para a execução de medidas de mecânica do sistema respiratório, bem como a avaliação da capacidade de resposta das vias aéreas à metacolina inalada em ratos utilizando a técnica de oscilações forçadas (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc , Canadá).

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