Avaliação da função respiratória em ratos conscientes por pletismografia dobro-câmara
10 de julho de 2018
O objetivo do presente artigo é fornecer uma descrição detalhada dos procedimentos recomendados para avaliar a função respiratória em ratos conscientes por pletismografia dobro-câmara.
Essa técnica ajudará a abordar questões-chave em vários campos, incluindo pesquisa respiratória, farmacologia de segurança e desenvolvimento de medicamentos. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece leituras confiáveis para avaliar a função respiratória em animais conscientes, tanto no início quanto durante os desafios. A técnica é especialmente útil quando o protocolo experimental requer pouco desvio do estado fisiológico normal dos animais.
O animal é contido, mas respira normalmente, o que permite a avaliação do padrão respiratório, além da obstrução das vias aéreas. No dia do experimento, inicie uma sessão experimental e carregue o arquivo de configuração apropriado. Digite o experimento e as informações do animal.
Uma vez feito isso, clique no botão executar na parte inferior da janela. Prossiga com a calibração do sistema. Calibre cada local e sinal de entrada separadamente.
Ligue o gerador de fluxo de polarização conectado à câmara do cabeçote por meio de um pedaço de tubulação e ajuste a taxa de fluxo. Feche a abertura superior da câmara da cabeça com uma tampa. Retire o painel traseiro da câmara torácica.
Em seguida, insira firmemente a ferramenta de calibração dentro da abertura de borracha entre o cabeçote e a câmara do corpo para criar uma vedação hermética. Feche e recoloque o painel traseiro da câmara torácica. No menu da barra de ferramentas do software, vá para Tuning e depois Calibrate.
Vá para Entrada um e selecione calibrar para iniciar a caixa de diálogo de calibração para o sinal de fluxo torácico. Verifique se os parâmetros listados na janela de diálogo de calibração exibem as configurações apropriadas. O baixo valor de estresse físico aplicado deve ser zero.
O alto valor de estresse físico aplicado deve ser de menos 20 mililitros por segundo e as amostras devem ser configuradas para integrar. Uma vez feito isso, clique em baixo na janela de amostras. Verifique se o sinal gerado é constante na janela de exibição e clique em fechar.
Conecte uma seringa de 20 mililitros através da porta lateral da câmara torácica usando um conector de plástico em um pedaço de tubo. Selecione alto na janela de amostras e injete imediatamente 20 mililitros de ar na câmara durante um período de dois segundos a uma taxa de fluxo o mais constante possível. Verifique se o sinal gerado aparece completamente dentro da janela de exibição.
Use o ícone de seta para verificar se o sinal está centralizado e simétrico em torno da linha zero. Em seguida, clique em fechar. Remova qualquer deslocamento de zero clicando em Remover deslocamento CA na janela de amostras.
Calibre a câmara da cabeça de maneira semelhante à câmara torácica, selecionando a entrada número dois. Desta vez, defina o valor alto para mais 20 mililitros por segundo em vez de menos 20. Trabalhe em uma área tranquila e distante da sala de habitação.
Aclimatar os animais ao aparelho de retenção e aos procedimentos antes do início do experimento. Por não ser invasivo e não exigir anestesia, trabalhar em condições em que o animal esteja confortável, bem adaptado e calmo limitará a propensão a vazamentos de cabelo entre as câmaras e, assim, maximizará a qualidade dos dados. Pese os animais.
Selecione o contenção apropriado para o animal. Insira o animal dentro do imobilizador procedente da abertura traseira. Segurar o dispositivo verticalmente pode ser útil.
Quando o animal estiver em posição, insira o êmbolo traseiro e trave-o suavemente no lugar sem aplicar força excessiva. Verifique visualmente se o animal respira normalmente. Se necessário, ajuste sua posição movendo o mecanismo de travamento.
Certifique-se de que as narinas do animal estejam salientes para fora do cone do nariz com o focinho apoiado nas paredes internas do sistema de contenção. Retire o painel traseiro da câmara torácica. Insira o imobilizador contendo o animal através da abertura de borracha na câmara torácica e feche a câmara.
Conecte a câmara da cabeça, forneça um fluxo de polarização e deixe o animal relaxar por pelo menos cinco minutos. Assim que o animal estiver calmo, inicie o protocolo de comandos selecionando o primeiro passo e clique em Executar. Verifique na tela do computador se os sinais respiratórios do animal são regulares e suaves.
O software exibe automaticamente os parâmetros calculados respiração por respiração. Verifique se os parâmetros do animal estão estáveis. Registre o padrão respiratório em condições basais por até 10 minutos.
Para protocolos que envolvem a administração de uma substância de teste por aerossol, primeiro, ajuste o nebulizador no tempo e no ciclo de trabalho conforme necessário. Execute um desafio de veículo e registre a resposta. Se necessário, exponha o animal a concentrações crescentes da substância em estudo, alterando a concentração no nebulizador e aumentando as etapas.
Registre a resposta após cada administração. Neste exemplo, 15 miligramas por mililitro de metacolina são testados. O aumento máximo na resistência específica das vias aéreas é registrado um momento depois e é visto retornando lentamente ao valor basal.
No final da sessão experimental, devolva o animal ao seu quarto e gaiola de alojamento. Entre as sessões, limpe as câmaras do pletismógrafo e enxágue o nebulizador com água. Prossiga para a análise dos dados conforme descrito no protocolo de texto.
Aqui é mostrado o resultado de uma avaliação repetida da função respiratória no início do estudo durante três dias consecutivos em dois grupos de camundongos BALB/c. Um controle um e um com inflamação alérgica pulmonar. Valores estáveis e comparáveis foram obtidos para uma seleção de parâmetros fornecidos pela pletismografia de dupla câmara.
Esses valores foram plotados para frequência respiratória, volume do título, ventilação minuto, pausa inspiratória final, fluxo no volume expiratório médio do título e resistência específica das vias aéreas. Alterações na função respiratória e na resposta ao aumento das doses de metacolina inalada também foram realizadas em dias sucessivos para avaliar o grau de resposta em camundongos C57BL/6 controles e alérgicos. Os resultados mostram o aumento progressivo esperado na resistência específica das vias aéreas com doses crescentes de metacolina com um grau exagerado de capacidade de resposta nos camundongos alérgicos no segundo e no terceiro dia.
No dia seguinte, a resistência newtoniana foi medida com a técnica de oscilação forçada. Alterações nesse parâmetro refletem principalmente variações na resistência das grandes vias aéreas condutoras. A resistência newtoniana medida no início e em resposta à metacolina correlacionou-se bem com a resistência específica medida das vias aéreas obtida no dia anterior nos mesmos animais.
Essa técnica é conveniente para avaliar vários animais ao mesmo tempo, para capturar a cinética de uma resposta aguda, bem como para medir a função respiratória de maneira repetida durante um experimento que durou vários dias. Após o procedimento, outros métodos, como a técnica de associação forçada, podem ser realizados para complementar a avaliação com medidas diretas da mecânica respiratória, como a resistência das vias aéreas. A pletismografia de câmara dupla realmente fornece uma abordagem interessante para avaliar o padrão respiratório e a geografia da obstrução das vias aéreas, especialmente quando o protocolo experimental exigia que os animais estivessem conscientes.
Visão geral
Este artigo detalha procedimentos para avaliar a função respiratória em camundongos conscientes usando pletismografia de câmara dupla. Esta técnica é crucial para pesquisas respiratórias e desenvolvimento de medicamentos.
Componentes principais do estudo
Área da ciência
- Pesquisa respiratória
- Farmacologia de segurança
- Desenvolvimento de medicamentos
Fundo
- A pletismografia de câmara dupla permite a avaliação da função respiratória sem anestesia.
- A técnica mantém o estado fisiológico normal do animal.
- Fornece dados confiáveis sobre padrões de respiração e obstrução das vias aéreas.
- A aclimatação dos animais é essencial para a qualidade dos dados.
Objetivo do estudo
- Fornecer um protocolo detalhado para avaliação da função respiratória em camundongos.
- Aumentar a compreensão das respostas respiratórias em várias condições.
- Facilitar testes de medicamentos e avaliações de segurança.
Métodos utilizados
- Calibração do sistema de pletismografia.
- Restrição dos animais de forma confortável.
- Registro de padrões de respiração de linha de base.
- Administração de substâncias de teste por aerossol.
Principais resultados
- Parâmetros respiratórios estáveis foram registrados por dias consecutivos.
- Respostas à metacolina foram avaliadas em camundongos controle e alérgicos.
- Resistência das vias aéreas aumentada foi observada com doses crescentes de metacolina.
- Os dados mostraram diferenças significativas na responsividade entre os grupos.
Conclusões
- A pletismografia de câmara dupla é eficaz para avaliação da função respiratória.
- O método fornece dados confiáveis tanto para estados de linha de base quanto desafiadores.
- É adequado para avaliar os efeitos dos medicamentos na pesquisa respiratória.
Perguntas frequentes
Executive Industry Relevance
Assessing respiratory function in conscious animals is critical for preclinical safety pharmacology and respiratory drug development, where maintaining physiological relevance improves translational confidence. Double-chamber plethysmography enables non-invasive, repeated measurements of breathing patterns and airway resistance in unrestrained, spontaneously breathing mice, supporting mechanistic de-risking of inhaled therapeutics. The technique provides quantitative, reproducible readouts that align with early discovery to lead optimization workflows by delivering reliable baseline and challenge-response data without anesthetic confounders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to airway reactivity and bronchoconstriction pathways in disease models.
- Operational Value: Supports functional target validation by measuring physiological outputs in conscious animals under baseline and challenged conditions.
- Predictive Value: Provides respiratory function readouts that help de-risk target engagement and mechanism of action in early-stage programs.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Delivers standardized, quantitative parameters such as specific airway resistance, tidal volume, and minute ventilation for compound screening.
- Reproducibility: Enables parallel monitoring of multiple animals and repeated assessments over days, improving assay robustness.
- Scalability: Compatible with aerosolized substance administration, supporting dose-response profiling in safety pharmacology.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Demonstrated utility in allergic inflammation models, enabling evaluation of genotype-phenotype correlations in respiratory disease.
- Translational Continuity: Connects discovery-phase respiratory phenotypes to preclinical validation through consistent, anesthesia-free measurements.
- Risk-Adjusted Decisions: Facilitates go/no-go assessments by quantifying responsiveness to bronchoconstrictive agents like methacholine across experimental groups.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for respiratory and inhaled therapeutic programs requiring functional respiratory endpoints.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of airway obstruction mechanisms and pathway modulation in genetic or disease models.
- Screening: Enables assay standardization and reproducible quantification of respiratory parameters for compound effect assessment.
- Analytics: Provides breathe-by-breathe calculated parameters including specific airway resistance and flow metrics for comparative condition analysis.
- Translational Research: Maintains physiological continuity from in vivo discovery to preclinical studies by avoiding anesthetic artifacts.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for longitudinal respiratory monitoring across multiple studies and compound series.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by delivering physiologically relevant respiratory data in conscious, unrestrained animals.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and minimal procedural bias through acclimatization and bias flow control.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by reducing false positives from anesthetic or stress-induced respiratory artifacts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of respiratory compounds based on validated, repeatable airway resistance measurements.
Implementation Considerations
- Requires expertise in animal handling, restrainer use, and plethysmograph system operation.
- Depends on calibrated instrumentation, bias flow generators, and nebulizer systems for aerosol delivery.
- Necessitates cross-team standardization of acclimatization protocols and environmental controls to minimize data variability.
- Involves adaptation considerations across mouse strains and disease models, as demonstrated in BALB/c and C57BL/6 backgrounds.
- Limited by potential hair leaks and chamber seal integrity, which can be mitigated through proper animal acclimatization and quiet experimental conditions.
