Name: Ordenando células individuais e único embriões em 3D Confinamento: Um novo dispositivo de alta Screening conteúdo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 22 s
Description: Aprenda a ordenar células individuais em microcavidades PDMS para estudar morfologia e dinâmica de organelas em ambiente 3D fisiológico. Este método reduz variabilidade e revela estruturas dinâmicas não observadas em ensaios 2D tradicionais.

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Nós reconhecemos L. Brino (facilidade de Triagem conteúdo IGBMC alta, Illkirch, França) para fornecer-nos com o anticorpo anti-Giantin, M. Labouesse Lab. para C. elegans (IGBMC) e B. Séraphin Lab. para quem gosta de levedura (IGBMC), E. Paluch e A. Hyman para as células HeLa fluorescentes (MPI-CBG, Dresden), J. Moseley (Dartmouth Medical School) e JQ Wu (Ohio State University) para células de levedura de fissão; A. Hoel e F. Evenou para ajudar experimental, C. Rick (IBMC, Estrasburgo, França) para obter ajuda técnica e JC Jeannot (Femto-st, França) para ajudar na microfabricação. Este trabalho foi apoiado por fundos do CNRS, da Universidade de Estrasburgo, Conectus, La Fondation pour la Recherche Médicale ea ci-FRC de Estrasburgo.

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Não temos nada a divulgar.

moldagem réplica foi utilizado a fim de fabricar os Eggcups &#39;&#39;. O processo de fabricação não precisa de uma sala limpa; é fácil e simples, embora alguns prática pode não ser necessária. Em particular, libertando o selo PDMS é a etapa mais importante, a fim de produzir uma grande área de &#39;&#39; Eggcups alta qualidade. Por esta razão, um cuidado especial tem de ser tomada neste passo. Se essa etapa for repetidamente falhando, considere para otimizar os parâmetros do plasma mais limpos antes da silanização e pl...

Actual em ensaios baseados em células in vitro são bidimensional (2D). Esta configuração não é natural para células de mamíferos e, por conseguinte, não é fisiologicamente relevante 1; células mostram uma diversidade de formas, tamanhos e fenótipos heterogêneos. Eles apresentam sérias limitações adicionais quando aplicado para aplicações de rastreio, tais como uma distribuição desordenada dentro do plano e fenótipos extremos de organelos celulares (fibras de stress, em particular). Isto é particularmente importante em ensaios clínicos para o teste de drogas, onde os altos orçamentos são gastos a cada ano. A maioria destas drogas que falham quando aplicados a modelos animais por causa da condição de cultura 2D artificial nas fases iniciais de rastreio de drogas. Além disso, ao utilizar esta abordagem, organelos celulares específicos podem não ser correctamente visualizado, tal como o anel de actomiosina cytokinetic durante a mitose celular, e, geralmente, estruturas que estão a evoluir no plano perpendicular ao plano de observação. Algunsnovos ensaios 2D têm sido propostos a fim de ultrapassar os inconvenientes acima mencionados e conhecimentos importantes sobre a organização do citoesqueleto foram observados 2,3. No entanto, estes ensaios ainda apresentam uma séria limitação: células apresentam um fenótipo muito propagação em contraste com o que se observa in vivo, em que as células apresentam uma arquitectura 3D. Estes artefactos associados com o método de cultura pode desencadear características não-fisiológicos, tais como fibras de stress 1,4,5 melhoradas. Tridimensionais ensaios de cultura celular fornecer várias vantagens quando comparados com os ambientes 2D 6,7. Eles são fisiologicamente mais relevante, e os resultados são, portanto, significativa. Como um exemplo, as células embebidas em hidrogéis mostram estruturas 3D-like, mas as suas morfologias diferem de uma célula para outra 8,9. No entanto, as suas morfologias diferem de uma célula para outra, o que complica as aplicações de rastreio. Uma estratégia alternativa é incorporar únicacélulas em cavidades microfabricados 10,11. posição da célula, forma, polaridade e organização célula interna pode, então, tornar-se normalizada. Além de fornecer a arquitetura 3D-like para as células, microcavidades também permite estudos de triagem de alto conteúdo 10,12-14; As células individuais podem ser ordenadas em microarrays e organelos celulares e suas evoluções pode ser observada em paralelo. Essa regularidade fornece boas estatísticas com baixo número de células e melhores resoluções temporais / espaciais. Os compostos úteis são mais fáceis de identificar com segurança. Neste estudo, nós mostramos a fabricação e aplicação de um novo sistema de células única cultura 3D-like de alto conteúdo de triagem aplicações 10,12,13. O dispositivo consiste de uma matriz de microcavidades elastoméricos (10 5 cavidades / cm 2), cunhada &#39;eggcups »(CE). Dimensões e volume total de CE neste trabalho são otimizados para o volume típico de células NIH3T3 e HeLa individuaisdurante a divisão celular. Morfologia das cavidades cilíndricas - - é seleccionado a forma da célula orientar correctamente para a visualização de processos activos. Moldagem réplica é usado para padrão de um conjunto de CE para um (PDMS) camada fina polidimetilsiloxano aderiu em um vidro lamela 15,16. As células são introduzidas na CE por centrifugação. Relatamos aqui a observação e normalização das organelas celulares (fibras de stress de actina, aparelho de Golgi e núcleo) em 3D (CE), em comparação com as mesmas células em 2D (plana) superfícies. Nós também relatam a observação de processos dinâmicos ativos, tais como o fechamento do anel actomiosina cytokinetic durante a mitose de células 17. Por fim, mostramos resultados desta metodologia em outros sistemas com paredes rígidas, como a levedura de brotamento, levedura e C. embriões elegans, o que confirma a aplicabilidade da nossa metodologia para uma ampla gama de sistemas modelo. A seguir, apresentamos um p detalhada e exaustivarotocolo, a fim de fabricar e aplicar as &#39;eggcups&#39; para microfabricação 3D. Nossa abordagem é simples e não precisa de um quarto limpo. Nós antecipamos que essa nova metodologia será particularmente interessante para testes de rastreio de drogas e medicina personalizada, em substituição de placas de Petri. Finalmente, o nosso dispositivo irá ser útil para estudar a distribuição de respostas de células a estímulos externos, por exemplo no cancro ou 18 em pesquisa básica 19.

<table><tbody><tr><td>ddH20 (ultrapuro)</td><td>Millipore-Use</td><td></td> <td>sempre água fresca.</td></tr><tr><td>Parafilm (filme plástico)</td><td>Bemis</td><td>PM-999</td><td>Cole o Parafilm na bancada do laboratório usando algumas gotas de água e garanta um nivelamento perfeito da superfície.</td></tr><tr><td>Foto-máscara</td><td>Selba</td><td>-</td><td><a href="http://www.selba.ch/" name="RANGE! D4">http://www.selba.ch</a></td></tr><tr><td>Bolacha de silício</td><td>Siltronix</td><td>-</td><td><a href="http://www.siltronix.com/">http://www.siltronix.com/</a></td></tr><tr><td>SU-8 fotorresistente</td><td>MicroChem</td><td>série 2000</td><td><a href="http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm">http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm&nbsp; </a></td></tr> <tr><td>é necessário trabalhar em um exaustor; consulte a folha de dados do fabricante para obter mais informações.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desenvolvedor SU-8</td><td>MicroChem</td><td>-</td><td><a href="http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm">http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm&nbsp; </a></td></tr><tr><td>trabalhar em uma capela é necessário; consulte a folha de dados do fabricante para obter mais informações</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19030</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&amp; região=CA">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&amp; region=CA</a></td></tr><tr><td>Disponível em várias empresas.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote (reagente siliconizante)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-25ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&amp; região=FR">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&amp; região=FR&nbsp; </a></td></tr><tr><td>prejudicial, é necessário trabalhar em uma capela; consulte a ficha técnica do fabricante para obter mais informações.&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clorotrimetilsilano (TMCS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>386529-100ML</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr&region=FR&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">TMCS produz inalação aguda e toxicidade dérmica, e é altamente inflamável (com flashback de ignição capaz de ocorrer a distâncias consideráveis), conseqüentemente deve ser usado em uma capela de exaustão longe de fontes de ignição</td></tr><tr><td>Luvas de nitrilo</td><td>Kleenguard</td><td>57372</td><td><a href="http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m">http://www.kcprofessional. com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m</a></td></tr><tr><td>Disponível em várias empresas.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro #0</td><td>Vidro Knittel</td><td>KN00010022593</td><td><a href="http://www.knittelglass.com/index_e.htm">http://www.knittelglass.com/index_e.htm</a></td></tr><tr><td>Muito frágil. Manipule suavemente.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinça reta afiada</td><td>SPI</td><td>0WSSS-XD</td><td>http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7</td></tr><tr><td>tubo de 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp</td></tr><tr><td>Disponível em várias empresas.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184 <</td><td>a href="http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx? R=131EN">http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx? R=131EN&nbsp; </a></td></tr><tr><td>O pacote contém a base PDMS e o agente de cura. Elastômeros semelhantes estão disponíveis em várias empresas.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de vidro para microscópio</td><td>Dutscher</td><td>100001</td><td><a href="http://www.dutscher.com/frontoffice/search">http://www.dutscher.com/frontoffice/search</a></td></tr><tr><td>Disponível em várias empresas.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meio DMEM com alto teor de glicose</td><td>Fisher Scientific</td><td>41965-039</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search? LBCID=12301479& palavra-chave = 41965-039 & store=Scientific& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search? LBCID=12301479& palavra-chave = 41965-039 & store=Scientific& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD</a></td></tr><tr><td>Soro de bezerro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8056-500ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&amp; região=CA">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&amp; região = CA < / a ></td></tr> <tr><td>0,25% Tripsina-EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>25200-072</td><td><a href = "http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&amp; store=Scientific& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&amp; store=Scientific& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD</a></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Fisher Scientific</td><td>14200-067</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&amp; store=Scientific& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&amp; store=Scientific& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD</a></td></tr><tr><td>PBS está em 10x e deve ser diluído para 1x usando o meio ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-15</td><td>Fisher Scientific</td><td>21083-027</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&amp; store=Scientific& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&amp; store=Scientific& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD</a></td></tr><tr><td>Medium para atmosferas sem controle</td><td></td><td></td><td></td>de CO2</tr><tr><td>Fibronectina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141-5MG</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; termo = F1141-5MG & lang=pt-br& região = CA & foco = produto & N=0+220003048+219853082+219853286& modo=correspondência%20parcialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; termo = F1141-5MG & lang=pt-br& região = CA & foco = produto & N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax</a></td></tr><tr><td>Penicilina & Estreptomicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&amp; store=Scientific& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=CHEM">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&amp; store=Scientific& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=CHEM</a></td></tr><tr><td>Placa de Petri P35</td><td>Greiner</td><td>627102</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com/">http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/</a></td></tr><tr><td>Placa de Petri P60</td><td>Greiner</td><td>628163</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com/">http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/</a></td></tr><tr><td>Placa de Petri P94</td><td>Greiner</td><td>633179</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com/">http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/</a></td></tr><tr><td>Paraformaldeído 3 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&amp; região=FR">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&amp; região=FR&nbsp; </a></td></tr><tr><td>Nocivo em particular para os olhos, é necessário trabalhar em uma capela; consulte a ficha técnica do fabricante para obter mais informações.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tritão 0,5 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443-100ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; termo = 93443-100ML & lang=pt-br& região = CA & foco = produto & N=0+220003048+219853082+219853286& modo=correspondência%20parcialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; termo = 93443-100ML & lang=pt-br& região = CA & foco = produto & N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax</a></td></tr><tr><td>Phallodin-Green Fluorescente Alexa Fluor 488</td><td>InVitrogen</td><td>A12379</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379? CID=search-a12379">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379? CID=search-a12379&nbsp; </a></td></tr><tr><td>dissolver o pó em 1,5 ml de metanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647</td><td>InVitrogen</td><td>A21245</td><td>diluição 1:200 em PBS 1x</td></tr><tr><td>policlonal de coelho anti-Giantin</td><td>Abcam</td><td>ab24586</td><td>diluição 1:500 em PBS</td></tr> <tr><td>1x<a href="http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html">http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html&nbsp; < / a></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>rabbit anti-anilina</td><td>Cortesia de M. Glotzer, publicado em Piekny, A. J. & amp Glotzer, M. A anilina é uma proteína de andaime que liga RhoA, actina e miosina durante a citocinese. Biologia atual 18, 30&ndash; 6 (2008).</td><td></td><td>Diluição 1:500 em PBS 1x</td></tr><tr><td>Anti-fosfotirosina</td><td>Transdução Lab</td><td>610000</td><td>http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000</td></tr><tr><td>Cy3 anti-coelho para cabras&nbsp;</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-166-047</td><td><a href="http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp">http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp&nbsp; </a></td></tr><tr><td>1:1.000 diluição em PBS 1x</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417&nbsp;</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&amp; região=FR">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&amp; região=FR&nbsp; < / a ></td></tr> <tr><td>1 mg / ml por 1 min</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2025</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; termo = G2025 & lang=pt-br& região = CA & foco = produto & N=0+220003048+219853082+219853286& modo=correspondência%20parcialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; termo = G2025 & lang=pt-br& região = CA & foco = produto & N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax</a></td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410-500ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; termo = M8410-500ML & lang=pt-br& região = CA & foco = produto & N=0+220003048+219853082+219853286& modo=correspondência%20parcialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; termo = M8410-500ML & lang=pt-br& região = CA & foco = produto & N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax</a></td></tr><tr><td>Células HeLa</td> <td>-</td><td></td> <td>Células de mamíferos estão disponíveis em muitas empresas. Veja também Tabela 1</td></tr><tr><td>NIH3T3 células</td><td>ATCC-Mammalian</td><td></td> <td>estão disponíveis em muitas empresas. Veja também <forte>Tabela 1</forte></td></tr><tr><td>Levedura de fissão&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>Para detalhes sobre cepas, entre em contato com o autor correspondente.&nbsp; Veja também Tabela 1</td></tr><tr><td>C. elegans worms</td><td>-</td><td>-</td><td>Para obter detalhes, entre em contato com o autor correspondente.&nbsp; Veja também Tabela 1</td></tr><tr><td>YES (Agar) + 5 Suplementos incluídos</td><td>MP Biomedicals</td><td>4101-732</td><td><a href="http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&amp; s=Pesquisar">http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&amp; s=Pesquisar&nbsp; </a></td></tr><tr><td>Para preparação: siga&nbsp; as instruções fornecidas na caixa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SIM (Mídia) + 5 Suplementos incluídos</td><td>MP Biomedicals</td><td>4101-522</td><td><a href="http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&amp; s=Pesquisar">http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&amp; s=Pesquisar&nbsp; </a></td></tr><tr><td>Para preparação: siga as instruções fornecidas na caixa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EMM (Mídia)</td><td>MP Biomedicals</td><td>4110-012</td><td><a href="http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&amp; s=Pesquisar">http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&amp; s=Pesquisar&nbsp; </a></td></tr><tr><td>Para preparação: siga&nbsp; as instruções fornecidas na caixa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EMM esterilizado por filtro (Mídia) - Somente para imagens</td><td>MP Biomedicals</td><td>4110-012</td><td>Para preparação: siga as instruções fornecidas na caixa. Esterilize o filtro usando um 0.22 &micro; m em vez de autoclavagem. Isso dá transparência ao meio e reduz a autofluorescência.</td></tr><tr><td>Suplementos (para EMM)</td> <td>MP Biomedicals</td><td>4104-012</td><td><a href="http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&amp; s=Pesquisa">http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&amp; s=Pesquisar</a></td></tr><tr><td>&nbsp;( Adicione 225 mg/L ao meio EMM antes de autoclavar ou filtrar)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtros estéreis acionados por vácuo Stericup e Steritop</td><td>Millipore</td><td>-</td><td><a href="http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&amp; tab1=2& tab2=1#tab2=1:tab1=2">http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&amp; tab1=2& tab2=1#tab2=1:tab1=2</a></td></tr></tbody></table>

ordenando células individuais e único embriões em 3d confinamento: um novo dispositivo de alta screening conteúdo

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

As células biológicas são geralmente observados em superfícies planas (2D). Esta condição não é fisiológica, e fenótipos e formas são altamente variáveis. A triagem com base em células em tais ambientes têm limitações, portanto, graves: organelas celulares mostram fenótipos extremos, morfologias celulares e tamanhos são organelos celulares heterogêneos e / ou específicos não pode ser correctamente visualizado. Além disso, as células in vivo situam-se num ambiente 3D; Nesta situação, as células mostram diferentes fenótipos principalmente por causa da sua interacção com a matriz extracelular em torno do tecido. A fim de padronizar e gerar fim de células individuais em um ambiente 3D fisiologicamente relevantes para ensaios baseados em células, relatamos aqui a microfabricação e aplicações de um dispositivo para o cultivo in vitro de células 3D. Este dispositivo é composto por uma matriz 2D de microcavidades (tipicamente 10 cavidades 5 / cm2), cada um cheio com células individuais ou embriões. posi celularção, a forma, a polaridade e organização celular interna tornar-se então normalizados mostrando uma arquitetura 3D. Usamos moldagem réplica de padrão de uma matriz de microporos, (PDMS) camada &#39;eggcups&#39;, em um polidimetilsiloxano fina aderiu em uma lamela. Cavidades foram cobertas com fibronectina para facilitar a aderência. As células foram inseridos por centrifugação. A porcentagem de preenchimento foi otimizado para cada sistema que permite até 80%. As células e os embriões viabilidade foi confirmada. Esta metodologia foi utilizada para a visualização dos organelos celulares, tais como aparelhos de Golgi e núcleo, e para estudar processos activos, tais como o encerramento do anel cytokinetic durante a mitose celular. Este dispositivo permitiu a identificação de novas funcionalidades, tais como acumulações periódicas e heterogeneidades de miosina e actina durante o encerramento do anel cytokinetic e fenótipos compactadas para Golgi e alinhamento núcleo. Caracterizamos o método de células de mamíferos, levedura de fissão, brotação de levedura, C. elegans wom adaptação específica em cada caso. Finalmente, as características deste dispositivo torná-lo particularmente interessante para ensaios de rastreio de drogas e medicina personalizada.

Dos eggcups »(CE) são uma metodologia de alto teor-triagem romance que permite a visualização de células orientadas e embriões em um ambiente 3D. Além disso, alguns processos celulares, que são difíceis de observar em culturas 2D padrão (planas), pode ser observada por este novo método. A Figura 1a mostra um resumo do processo de microfabricação CE (ver também a secção 1 em o protocolo acima descrito ). O método é simples, rápido, eficiente e sem qualquer exigência de equipamentos especiais. Fig...

Nós relatamos um dispositivo e um novo método para estudar células e embriões. células individuais são precisamente ordenados em matrizes microcavidade. Seu confinamento 3D é um passo para ambientes 3D encontrados em condições fisiológicas e permite a orientação organela. Ao controlar a forma da célula, esta configuração minimiza variabilidade relatados em ensaios convencionais.

Ordenando células individuais e único embriões em 3D Confinamento: Um novo dispositivo de alta Screening conteúdo

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

O objetivo geral do experimento a seguir é observar a morfologia e a dinâmica das organelas celulares em uma série de microcavidades que imitam o ambiente 3D encontrado em condições fisiológicas. Para células com paredes rígidas, como leveduras de fissão, as cavidades podem organizar e orientar as estruturas celulares. Isso é conseguido primeiro fabricando uma matriz de pilares PDMS de um mestre para obter uma matriz de microcavidades PDMS, denominadas copos de ovo, por moldagem de réplica.Como segunda etapa, os copos de ovo são funcionalizados com proteínas da matriz extracelular e introduzidos em um tubo com uma peça plástica cilíndrica feita sob medida, que suporta a amostra de microcavidade e permite a introdução de células individuais de mamíferos em cada uma das microcavidades. Em seguida, os copos de ovos cheios de células são removidos e incubados com a droga ou composto de interesse, a fim de estudar o fenótipo e os processos dinâmicos das células em um confinamento 3D. São obtidos resultados que mostram diferenças no fenótipo celular e novas estruturas dinâmicas observadas quando comparadas aos ensaios in vitro 2D padrão com base na orientação das células.A principal vant

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este protocolo descreve um método para isolar células únicas de embriões de peixe-zebra, enriquecendo para células de interesse, capturando células de peixe-zebra em sistemas multiplex de célula única baseados em microfluídica e avaliando a expressão gênica de células únicas.

Isolamento e caracterização de células individuais de embriões Zebrafish

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e cultivar células únicas com uma plataforma microfluídica, que utiliza um novo conceito de design de micropoços para permitir o isolamento de célula única de alta eficiência e cultura clonal de longo prazo.

Uma plataforma microfluídica para a isolação de alta taxa de transferência de célula única e Cultura

Microinjeção de zebrafish embriões e larvas é uma técnica crucial mas desafiador, usada em muitos modelos de zebrafish. Aqui, apresentamos uma gama de ferramentas de microescala para auxiliar na estabilização e orientação do zebrafish para microinjeção e a imagem latente.

Microstructured dispositivos para Microinjection otimizado e imagem latente de larvas de Zebrafish

Apresentamos um procedimento para controlar a forma de cluster inicial célula em uma matriz extracelular 3D para obter uma formação de padrão repetitivo. Um dispositivo cúbico contendo dois diferentes hidrogel é empregado para conseguir imagens multi-direcional para formação de padrão de tecido.

Controle de Cluster inicial célula 3D em um dispositivo de cubo híbrido Gel para formações padrão repetitivo

Nós descrevemos um método para construir dispositivos para a cultura 3D e a experimentação com pilhas e os organoids multicelular. Este dispositivo permite a análise de respostas celulares a sinais solúveis em microambientes 3D com gradientes quimioatrativos definidos. Os organóides são melhores do que as células únicas na detecção de entradas barulhentas fracas.

Análise 3D de respostas multicelulares a gradientes Quimioatrativos

Este protocolo explica como preparar e montar amostras bacterianas para imagens tridimensionais vivas e como reconstruir a forma tridimensional de E. coli a partir dessas imagens.

Imagem tridimensional de células bacterianas para representações celulares precisas e localização precisa de proteínas

Este trabalho descreve um protocolo semi-alta de supressão que permite imagens simultâneas de lapso de tempo 3D de embriaênese embrionária em embriões de 80-100 C. elegans em uma única corrida noturna. Além disso, as ferramentas de processamento e visualização de imagens são incluídas para simplificar a análise de dados. A combinação destes métodos com tensões personalizadas do repórter permite a monitoração detalhada do embryogenesis.

Um método de imagem semi-alta-fonte e um kit de ferramentas de visualização de dados para analisar o desenvolvimento embrionário de C. elegans

Toda a estrutura 3D e o conteúdo celular dos organoides, bem como sua semelhança fenotípica com o tecido original podem ser capturados usando o protocolo de imagem 3D de resolução unicelular descrito aqui. Este protocolo pode ser aplicado a uma ampla gama de organoides variando em origem, tamanho e forma.

Resolução unicelular imagens tridimensionais de organoides intactos

Apresentado aqui é um protocolo para microinjetar e simultaneamente imaginar múltiplos embriões de Drosophila durante o desenvolvimento embrionário usando um imager de alto teor baseado em placas.

Preparação e microinjeção de embriões Drosophila para Microscopia de Células Vivas Realizadas usando um Analisador automatizado de alto teor

Este protocolo detalha um método para a produção de três tipos diferentes de esferoides de uma maneira que os torna adequados para triagem e análise de alto conteúdo em larga escala. Além disso, são apresentados exemplos mostrando como eles podem ser analisados nos níveis esferoide e células individuais.

Um método robusto para a produção em larga escala de spheroids para aplicativos de triagem e análise de alto conteúdo

Aprenda a ordenar células individuais em microcavidades PDMS para estudar morfologia e dinâmica de organelas em ambiente 3D fisiológico. Este método reduz variabilidade e revela estruturas dinâmicas não observadas em ensaios 2D tradicionais.

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