Ordenando células individuais e único embriões em 3D Confinamento: Um novo dispositivo de alta Screening conteúdo

O objetivo geral do experimento a seguir é observar a morfologia e a dinâmica das organelas celulares em uma série de microcavidades que imitam o ambiente 3D encontrado em condições fisiológicas. Para células com paredes rígidas, como leveduras de fissão, as cavidades podem organizar e orientar as estruturas celulares. Isso é conseguido primeiro fabricando uma matriz de pilares PDMS de um mestre para obter uma matriz de microcavidades PDMS, denominadas copos de ovo, por moldagem de réplica.

Como segunda etapa, os copos de ovo são funcionalizados com proteínas da matriz extracelular e introduzidos em um tubo com uma peça plástica cilíndrica feita sob medida, que suporta a amostra de microcavidade e permite a introdução de células individuais de mamíferos em cada uma das microcavidades. Em seguida, os copos de ovos cheios de células são removidos e incubados com a droga ou composto de interesse, a fim de estudar o fenótipo e os processos dinâmicos das células em um confinamento 3D. São obtidos resultados que mostram diferenças no fenótipo celular e novas estruturas dinâmicas observadas quando comparadas aos ensaios in vitro 2D padrão com base na orientação das células.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como os ensaios de cultura de células 2D padrão, é que as células de mamíferos em copos de ovos experimentam um ambiente 3D semelhante aos microambientes lógicos, mas são organizadas em um grau ordenado e padronizado. Ordem e orientação também são melhorias significativas no caso da levedura de fissão. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da descoberta de células, como a identificação de medicamentos novos e anticancerígenos com triagem de alto conteúdo.

As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico de doenças multifatoriais, como o câncer, pois os ensaios de triagem de medicamentos podem ser facilmente realizados e analisados por meio de copos de ovos, tornando esse método particularmente interessante para a medicina personalizada. Este método pode fornecer uma chave interna para estruturas e dinâmicas organizadas em células individuais de mamíferos e células de levedura de fissão, e também pode ser aplicado à organização de estudos, desenvolvendo embriões como C.elegans e ri-so-flu-a. Neste protocolo, uma série de microcavidades ou copos de ovo é padronizada em uma camada de polidimetilsiloxano ou PDMS aderida a uma lamínula por moldagem de réplica.

O primeiro passo é a fabricação do mestre, que não será mostrado, mas está descrito no protocolo de texto. Uma vez que o mestre tenha sido feito, a próxima etapa é fabricar a réplica do PDMS. Em um tubo de 50 mililitros, misture bem o reticulador e o pré-polímero em uma proporção de um para 10 peso para peso ou volume para um total de 30 gramas.

Centrifugue o tubo a 1.800 vezes g por cinco minutos para remover as bolhas de ar. Solte suavemente o PDMS em cima do mestre. Se aparecerem bolhas, desgaseifique a mistura.

Coloque a amostra em um forno a 65 graus Celsius por quatro horas. Depois que o PDMS estiver curado, use um bisturi para cortar suavemente a área de interesse de cerca de um centímetro quadrado, que inclui aproximadamente 10 a quinta microcavidades, ou copos de ovo. Retire o carimbo PDMS com cuidado.

Para iniciar o procedimento de moldagem de réplica, ative o carimbo PDMS por tratamento com plasma de oxigênio por 30 segundos. Armazenar temporariamente o carimbo activado numa placa de Petri fechada para evitar a deposição de poeiras. Trabalhando em uma capela de exaustão, coloque o carimbo PDMS ativado com o lado com as estruturas voltadas para cima ou de cabeça para cima em uma placa de Petri ao lado de uma tampa de 15 mililitros.

Encha a tampa com 200 microlitros de trimetilclorossilano. Feche a placa de Petri e deixe o selo salinizar por sete minutos. Coloque o carimbo PDMS no revestidor giratório com as estruturas de cabeça para cima.

Coloque uma pequena gota de PDMS líquido em cima das estruturas. Gire a camada a 1500 RPM por 30 segundos para depositar uma fina camada de PDMS no topo das estruturas. Coloque o carimbo no forno a 65 graus Celsius por quatro horas para curar a camada de PDMS revestida por rotação depositada.

Em seguida, ative a fina camada de PDMS colocando o carimbo PDMS de cabeça para cima junto com uma lamínula de vidro em um limpador de plasma de oxigênio por 30 segundos. Coloque imediatamente o carimbo em contato com a lamínula de vidro e pressione suavemente toda a superfície do carimbo com uma pinça para a colagem. Depois disso, mantenha uma pressão constante em cima do carimbo por cerca de 10 segundos.

30 minutos depois, retire delicadamente o carimbo da lamínula para liberar os copos de ovos. Tenha muito cuidado para não quebrar a amostra. Lave bem os copos de ovos com etanol e seque.

Se os copos de ovos PDMS não estiverem na lamínula de vidro e soltos durante a etapa de desfixação, considere ajustar as configurações do limpador de plasma e reinicie o procedimento de moldagem de réplica. Para facilitar a manipulação da amostra posteriormente, recomenda-se que um pequeno pedaço de PDMS curado seja colado na borda da lamínula. No caso de células de mamíferos apresentadas neste vídeo, a superfície do PDMS deve ser funcionalizada com proteínas de adesão da matriz extracelular.

Hidrofilize os copos de ovo no limpador de plasma de oxigênio por 30 segundos. Depois disso, esterilize os copos de ovos com luz ultravioleta por cinco minutos. Deposite uma pequena gota de solução de fibronectina para cobrir toda a área do copo de ovos e incube por uma hora em temperatura ambiente.

Proteja a amostra da secagem. Enxágue suavemente os copos de ovos com cerca de um mililitro de PBS, usando uma pipeta de plástico. Repita um total de três vezes.

Em seguida, coloque uma peça de plástico cilíndrica feita sob medida em um tubo de 50 mililitros. Adicione 13 mililitros de meio de cultura de células ao tubo. O meio deve atingir pelo menos dois centímetros acima da peça cilíndrica para garantir a imersão completa da amostra.

Usando uma pinça afiada e reta para segurar a amostra pela alça do PDMS, coloque cuidadosamente os copos de ovo dentro do tubo, pressionando suavemente a lamínula até que ela fique em cima da parte superior da peça de plástico e esteja totalmente imersa. As células a serem introduzidas nas xícaras de ovos devem ser cultivadas a 80 a 100% de confluência e ressuspensas em cinco mililitros de meio de cultura. Pipete 200 microlitros de células em cima dos copos de ovos, deixando cair as células o mais centralizadas possível em cima dos copos de ovos, mas evitando o contato físico.

Isso evitará quebras e/ou danos à amostra. Centrifugar o tubo de 50 mililitros a 1 800 vezes g durante dois minutos. Pipete mais 200 microlitros de células em cima dos copos de ovos e centrifugue novamente a 1.800 vezes g por dois minutos.

Repita por um total de três vezes para otimizar a porcentagem de enchimento. Após a última centrifugação, verifique a porcentagem de enchimento dos copos de ovos com um microscópio. Usando a pinça para segurar a alça do PDMS, remova a amostra cuidadosamente do tubo sem perturbar as células nos copos de ovos e coloque a amostra em uma placa de Petri com meio.

Para remover o excesso de células que não estão nos copos de ovo, enxágue pipetando suavemente para cima e para baixo três vezes ao lado de cada lado da matriz de microestrutura. Por fim, substitua o meio por meio novo para remover as células não aderidas. Para observar organelas celulares fixas, coloque os copos de ovos com uma amostra fixa no palco de um microscópio invertido de epifluorescência e selecione a objetiva de óleo 60x.

Neste exemplo, a amostra são fibroblastos NIH 3T3, onde o aparelho de Golgi, o núcleo e as fibras de actina foram corados. Foque cuidadosamente usando luz de campo brilhante até que os copos e células do ovo estejam no plano de observação. Selecione e foque a região de interesse e inicie a captura da imagem.

Comece este procedimento colocando os copos de ovo em um suporte de microscópio e enchendo-o com um mililitro de meio de cultura de células 10% FCS L15. Instale o suporte na platina do microscópio. Para evitar a evaporação, coloque uma tampa de vidro em cima do suporte.

Observe as células com um microscópio invertido de epifluorescência equipado com uma objetiva de óleo 60x. Este exemplo usa células HeLa que expressam miosina e actina marcadas com fluorescência, duas moléculas-chave envolvidas no fechamento do anel citocinético durante a mitose. Selecione a região de interesse e procure um anel citocinético, usando o canal GFP ou Texas Red.

Foque com precisão. Execute a aquisição automática em ambos os canais até que o anel esteja completamente fechado. Imagens de microscópio eletrônico de varredura de copos de ovos mostram que sua forma e tamanho são muito regulares.

Para células com paredes rígidas, como levedura de fissão, os copos de ovo podem orientar o anel citocinético. Para células de mamíferos, uma comparação entre células em copos de ovos 3D e superfícies planas 2D revela que as primeiras formam uma matriz ordenada com o fenótipo homogêneo do tipo esférico, enquanto as últimas mostram uma morfologia desordenada e heterogênea. As células nos copos dos ovos também mostram uma redução no número de fibras de estresse, conforme indicado pelo número de efeitos modestos do tratamento com Blebbistatina.

O aparelho de Golgi em culturas 2D normalmente mostra um fenótipo estendido, enquanto em copos de ovo, mostra um fenótipo mais compactado. Isso foi confirmado por uma quantificação dos fenótipos de Golgi. Por fim, em superfícies 2D, o núcleo da célula é orientado aleatoriamente, enquanto em copos de ovo, é orientado ortogonalmente no plano xy, tanto no tipo selvagem quanto nas células tratadas com blebbistatina.

Uma determinação dos valores de esfericidade do núcleo revela que os copos dos ovos não afetam a esfericidade normal do núcleo da célula. No entanto, a diferença entre o tipo selvagem e as células tratadas com blebistina em copos de ovo sugere que os copos de ovo estão revelando um efeito real da droga que é mascarada em 2D. Estudos de células vivas usando copos de ovos permitem a identificação de novos processos ativos, que não são visíveis em culturas padrão.

Por exemplo, acúmulos periódicos de miosina que se movem radialmente à medida que o anel citocinético se fecha durante a mitose foram observados em células HeLa. Uma vez dominados, os copos de ovo podem ser preparados a partir de uma réplica em menos de seis horas, e o enchimento das células pode ser feito em cerca de 15 minutos. Ao tentar esse processo, é importante ter o tamanho dos copos dos ovos para as células em estudo.

Este procedimento pode ser adaptado a plataformas de triagem de alto conteúdo em empresas farmacêuticas para atividades de triagem em massa e também em ensaios diagnósticos personalizados de pacientes na avaliação de tratamentos específicos individuais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fabricar e usar as microcavidades dos copos de ovo. Os copos de ovos padronizam e geram ordem para uma variedade de sistemas semelhantes, desde células individuais sem paredes, como células de mamíferos, até sistemas com paredes, como leveduras e embriões.