Microstructured dispositivos para Microinjection otimizado e imagem latente de larvas de Zebrafish

O objetivo geral desta metodologia é tornar a microinjeção de larvas de zerbrafish mais fácil e precisa. Este método ajuda os pesquisadores a usar sistemas de modelo de peixe-zebra para imobilizar larvas de peixe-zebra em orientações específicas em grandes matrizes. A técnica permite um acesso mais fácil a tecidos específicos para microinjeção e imagem, e é muito eficaz quando um grande número de larvas é necessário para aplicações como modelos de infecção ou câncer de xenoenxerto.

Minhas estratégias de fabricação em modelos de peixe-zebra são altamente complementares. Um é feito pelo homem e simples. O outro é vivo e complexo.

Ambos compartilham a mesma escala de tamanho. Ambos são transparentes. E ambos permitem observações com resolução de célula única.

Como você mostra aqui, eles podem ser facilmente combinados e podem ter aplicações no estudo de praticamente qualquer doença importante. Depois de preparar um bloco PDMS em uma placa de Petri coberta por uma fina película de E-3, de acordo com o protocolo de texto, use uma pipeta de transferência para transferir o número necessário de embriões para a superfície do bloco PDMS. Usando um laço de cabelo ou ferramenta semelhante, empurre os embriões para os divots da microestrutura, principalmente para orientações dorsal e ventral.

Ao carregar larvas nos divots, é importante ter água suficiente cobrindo o bloco PDMS para permitir fácil manipulação. Também é importante empurrá-los para dentro dos divots para que permaneçam no lugar durante a injeção. Para orientar o peixe-zebra em canais de microestrutura previamente preparados de acordo com o protocolo de texto, use uma pipeta de transferência para extrair E-3 do bloco PDMS padronizado.

O nível de E-3 deve cair abaixo da borda do bloco, mas ainda estar presente no reservatório e nos canais, e uma fina camada permanece no PDMS. Usando uma pipeta de transferência, transfira 10 embriões anestesiados para o reservatório, tomando cuidado para não transbordar as bordas. Usando uma alça de cabelo, manipule cada embrião na cabeça do funil, primeiro na entrada do canal apropriado, garantindo que o embrião tenha a orientação apropriada ao entrar no canal.

Em seguida, use um laço de cabelo para deslizar cada embrião pelo canal, até atingir as microcaracterísticas de orientação nas paredes do canal que o mantêm no lugar. Após a preparação das agulhas de microinjeção e da solução de microinjeção, use uma ponta de pipeta finamente cônica para carregar cinco microlitros da solução na agulha. Monte a agulha em um micromanipulador montado em um suporte magnético e conecte-o a um microinjetor de bomba PICO.

Em seguida, use uma pinça para quebrar a ponta de uma agulha em um ângulo de 45 graus, apertando a ponta cônica. Ajuste o tamanho do bolus de injeção para um nanolitro ajustando o tempo de injeção no controlador da bomba PICO. Ajuste o ângulo da agulha de microinjeção no controlador de micromanipulação, começando com 45 graus com a agulha paralela ao comprimento do embrião.

Um ângulo mais acentuado pode ser usado para minimizar o movimento lateral do embrião durante a microinjeção. Controlando a placa de Petri com a mão esquerda e o micromanipulador necessário com a direita, aproxime a agulha o mais possível do local pretendido da microinjeção, como a vesícula ótica. Usando o controlador de micromanipulação, insira a agulha no tecido alvo e use o pedal da bomba PICO para injetar o volume predefinido.

Se o tecido resistir à penetração, bata suavemente no botão do controlador de micromanipulação. Para liberar os embriões, use uma pipeta de transferência para fluir E-3 sobre a superfície de cima para baixo, ou girando o prato de forma que os embriões sejam liberados no E-3 circundante. Transfira os embriões para uma placa de recuperação de E-3 sem MS-222.

Para rastrear os embriões usando o dispositivo PDMS nos poços de uma placa de seis poços, use uma pipeta de 1.000 microlitros ou uma pipeta de transferência de ponta estreita para preparar o dispositivo fluindo E-3 através da porta. Use E-3 e MS-222 para encher o poço até que o dispositivo esteja coberto. Em seguida, use uma pipeta de transferência para entregar quatro embriões previamente injetados em cada poço.

Usando um laço de cabelo ou ferramenta semelhante, posicione os embriões nas entradas dos canais de imagem na orientação desejada e empurre-os parcialmente para dentro do dispositivo. Isso ajudará a atraí-los para o dispositivo uniformemente. Usando uma pipeta de 1.000 microlitros ou pipeta de transferência, desenhe E-3 através do dispositivo a partir da porta até que os embriões sejam puxados para os canais na orientação correta para a imagem.

Transfira a placa do poço para um microscópio fluorescente invertido. Para obter imagens dos embriões, ajuste a ampliação selecionando a lente apropriada, como 10x para imagens da migração de neturaohil de peixe-zebra. Ajuste a intensidade da fonte de luz e o tempo de exposição para cada canal, para que cada sinal fique claro, mas não saturado.

Por fim, capture imagens para cada canal fluorescente e transmitido. Utilizando o dispositivo de canal microestruturado para estabilizar embriões na orientação lateral, foi testada a capacidade dos neutrófilos de responderem aos quimioatraentes padrão fMLP e LTB4 microinjetados nas vesículas óticas, de dois dias após a fertilização de embriões de peixe-zebra. Para visualizar o recrutamento de neutrófilos, as injeções foram rastreadas com rodamina dextrana de alto peso molecular e realizadas em embriões transgênicos com neutrófilos fluorescentes verdes.

Embriões não injetados e embriões injetados apenas com rodamina foram usados como controles negativos. Após a microinjeção, os embriões foram transferidos para o dispositivo de canal de imagem e fotografados usando um microscópio fluorescente EVOS 30 minutos e cinco horas após a injeção. Como esperado, um pequeno número de neutrófilos fluorescentes foi recrutado para a vesícula ótica injetada simulada no ponto inicial, provavelmente devido ao recrutamento mediado danificado.

Curiosamente, observou-se que o traçador de rodamina dextrana se acumulava nos otólitos durante o experimento. Para ambos os quimioatraentes, os neutrófilos foram recrutados em maior número, particularmente em resposta ao LTB4. Uma vez dominada, essa técnica pode melhorar muito a velocidade e a precisão da microinjeção de peixe-zebra.

O desenvolvimento dessa técnica foi impulsionado por desafios específicos em nosso laboratório. Refinamos essa abordagem para atender às necessidades de nossos projetos sobre infecção fúngica e xenoenxertos tumorais em modelos de peixe-zebra. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar matrizes de superfície microestruturadas para microinjeção de peixe-zebra e para imagens ao vivo estendidas.