A interferência RNA larval no Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

O objetivo geral deste procedimento é derrubar um gene de interesse via interferência de RNA no cádio trium do besouro vermelho da flor, injetando solução de RNA de fita dupla na cavidade do corpo larval. Isso é feito isolando primeiro o estágio adequado das larvas da cultura, peneirando a flor da cultura e separando as larvas de outros estágios dos besouros em uma bandeja de sementes. O segundo passo é preparar uma agulha de injeção quebrando a ponta da agulha, colocando-a em um porta-agulha e carregando frontalmente, solução de RNA de fita dupla da concentração desejada na agulha.

Em seguida, autorize as larvas isoladas e coloque-as em uma lâmina de vidro pegajosa. A etapa final é injetar as larvas com uma solução de RNA de fita dupla sob um microscópio de dissecação. Em última análise, os fenótipos relacionados ao RNAi no estágio desejado são analisados para determinar a função do gene alvo.

A principal vantagem desta técnica sobre o método existente, como neurogênese ou transgênese, é que apenas uma simples injeção de solução de RNA de fita dupla na cavidade corporal do besouro pode induzir um knockdown de genes eficiente e duradouro em qualquer estágio desejado do desenvolvimento do bedo. Embora o protocolo descrito aqui se concentre nas larvas de trium castin com algumas modificações, os procedimentos de injeção podem ser aplicados a outros estágios de trium, castin e outros insetos. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldade em fazer uma boa agulha e injetar a quantidade apropriada de solução de RNA de fita dupla sem matar as larvas.

A demonstração visual dessa técnica é crítica, pois as etapas de injeção de RNA de fita dupla e preparação da agulha são difíceis de descrever e só podem ser aprendidas por meio da observação e da prática da cultura. A cepa de escolha do elenco de chá, conforme detalhado no protocolo de texto que acompanha. Esvazie uma garrafa de cultura dos besouros em uma peneira número 25 imediatamente e peneire agressivamente para coletar as larvas mais velhas, pupi e adultos.

Em seguida, transfira os besouros junto com o exus para uma bandeja de sementes, batendo para evitar que os besouros escapem. Agora, sopre suavemente sobre a bandeja de sementes para remover o exus e as partículas de flores da superfície dos besouros. Bata na bandeja de sementes para assentar.

O conteúdo. Espere que os adultos mais móveis saiam da pilha e remova-os para separar o ângulo do pupi, a panela ligeiramente para baixo. Bata suavemente para rolar e remova o pupi, deixando apenas as larvas na bandeja de sementes.

Agora coloque as larvas isoladas em uma placa de Petri limpa. Selecione o estágio larval desejado para injeção sob um microscópio e mantenha-os em uma placa de Petri até a autorização. Combine os estágios restantes dos besouros e coloque-os de volta em uma garrafa de cultura.

Conecte uma agulha de vidro puxada em um microscópio de vidro. Deslize sob um microscópio de dissecação. Localize onde a ponta se dobra.

Agarre a área ligeiramente em direção ao lado da ponta e gire para quebrar para uma penetração ideal da cutícula larval, selecione uma agulha com uma abertura angular de aproximadamente 0,05 milímetros de diâmetro. Agora desaperte a ponta do porta-agulhas. Coloque a extremidade traseira da agulha na ponta do suporte e a junta de borracha sob a ponta do suporte.

Em seguida, insira a parte de trás da agulha no suporte, certificando-se de que a junta de borracha seja inserida na abertura. Aparafuse a ponta de volta no suporte. Agora coloque o porta-agulhas montado no manipulador de agulhas.

Ajuste a posição de modo que a ponta da agulha fique centralizada sob o campo de visão do microscópio. Prepare a solução de RNA de fita dupla imediatamente antes da injeção. Corte a ponta de uma ponta de pipeta descartável de 20 microlitros.

Agora pipete 10 microlitros da solução na ponta da pipeta aparada. Remova cuidadosamente a ponta da pipeta da pipeta, mantendo o fluido na ponta, fornecendo contrapressão. Coloque a ponta da pipeta com a solução de RNA de fita dupla no microscópio stage.

Olhando pelo microscópio, mova lentamente a ponta carregada em direção à agulha até que a ponta da agulha esteja dentro da ponta da pipeta carregada e na solução. Em seguida, puxe suavemente o êmbolo da seringa de injeção para puxar lentamente a solução para dentro da agulha sem sobrecarregar a agulha. À medida que a extremidade da solução de RNA DS se aproxima da ponta da agulha, diminua a taxa de tração e pare de carregar a solução antes que a ponta da agulha alcance o ar para evitar a rápida absorção no porta-agulha.

Abra a torneira de parada para remover a pressão da seringa de injeção e do porta-agulhas. Em seguida, afaste a ponta da pipeta da ponta da agulha. Agora levante a agulha para cima no stage e remova a ponta da pipeta vazia do stage do microscópio.

Coloque as larvas na cesta de autorização e, em seguida, coloque a cesta na garrafa de éter e feche a tampa. Após três minutos, verifique se as larvas se movem. Se eles ainda estiverem em movimento, coloque-os de volta na garrafa de éter por mais 30 segundos.

Transfira as larvas autorizadas E da cesta para a borda antiaderente de uma lâmina de vidro pegajosa. Transfira as larvas sequencialmente para a lâmina. Coloque cada um lateralmente.

Bata suavemente no corpo da cabeça à cauda com uma pinça e estique-o levemente para prender as larvas no slide. Agora posicione a lâmina preparada no microscópio stage. Insira a agulha carregada de RNA de fita dupla suavemente no lado dorsal das larvas, usando o estágio para mover as larvas para a agulha.

Em seguida, puxe a agulha ligeiramente para trás para o RNA DS. Para entrar na cavidade do corpo da larva, empurre suavemente a seringa de injeção até que as larvas fiquem verdes e pareçam esticadas e cheias. Em seguida, remova a agulha das larvas enquanto puxa ligeiramente a seringa para injeção.

Injete todas as larvas na lâmina. Certifique-se de remover as larvas que não foram injetadas com sucesso. Deixe as larvas injetadas de lado até que todas as larvas se recuperem da autorização E.

Agora, levante suavemente as larvas da cabeça à cauda, transfira para uma placa de Petri limpa e deixe-as por pelo menos 10 minutos para permitir que a ferida da injeção coagule. Em seguida, cultive as larvas injetadas a 30 graus Celsius com 70% de umidade. Observe as larvas para fenótipos de RNAI regularmente.

Esses exemplos mostram níveis variados de sucesso de injeções com solução de RNA verde de fita dupla na larva do último ínstar com uma agulha de injeção de tamanho adequado. A ponta da agulha penetra na cutícula da larva com resistência mínima e a solução verde de RNA DS flui para as larvas sem qualquer vazamento. Na cepa PU 11, a proteína fluorescente amarela aprimorada pode servir como um bom controle positivo para experimentos de injeção de RNA de fita dupla.

Quando o RNA EYFP DS é injetado no último estágio larval, uma redução significativa no sinal EYFP na futura asa primordial pode ser observada já um dia após a injeção. O knockdown da expressão de EYFP é geralmente observável dois dias após a injeção e, se a concentração de RNA DS for alta o suficiente, persistirá durante o estágio da pupila e durante toda a vida do besouro. Como o EYFP é uma sequência gênica não endógena, esse gene também pode ser usado como um controle negativo que não deve causar interrupções morfológicas ou fisiológicas.

Neste experimento, o RNA de fita dupla para vestigial, um gene de asa crítica foi injetado em larvas do penúltimo estágio. Observe que a perda completa das estruturas das asas pode ser observada no estágio de pupila. O adulto resultante também carece completamente de estruturas de asa.

Uma vez dominado, esta técnica pode ser feita em menos de duas horas se for realizada corretamente Seguindo este procedimento. Outros métodos, como PCR quantitativo em tempo real, hibridização in situ ou imuno-histoquímica, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como quais genes são regulados pelo gene alvo após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para os pesquisadores realizarem análises de perda de função e estágios pós-embrionários em traum casten sem utilizar técnicas genéticas complexas.

A natureza simples desse método também o torna altamente aplicável a um ambiente de ensino. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como selecionar o estágio apropriado de amor para injeção, como fazer uma agulha de injeção e realizar a injeção permitida de RNA de padrão duplo com sucesso. Este protocolo permitirá avaliar a função do gene através do nível de RNI no Trium.