RNAi de triagem para identificar fenótipos pós-embrionário em C. elegans

O objetivo deste procedimento é identificar reguladores pós-embrionários da expressão e localização de proteínas em C elegance usando uma triagem genômica baseada em RNAi e proteínas marcadas com fluorescência. Uma vez que a cepa de triagem apropriada é construída, uma biblioteca de RNAi é escolhida. O primeiro passo do procedimento é empacotar os clones da biblioteca em bactérias.

As bactérias são então selecionadas, crescidas e alimentadas com nematóides c elegance encenados. Depois de permitir que os nematóides cresçam por 72 horas, eles são observados quanto a alterações no fenótipo de interesse. Em última análise, as alterações na expressão ou localização subcelular da proteína atacada são visualizadas com microscopia de fluorescência.

Este método pode identificar genes necessários para a localização subcelular adequada de uma proteína marcada com fluorescência. No entanto, este protocolo pode ser modificado para identificar genes que afetam outros fenótipos pós-embrionários de interesse. A principal vantagem desta técnica sobre os protocolos publicados existentes é que otimizamos a consistência e o nível da resposta do RNAi em animais, induzindo a produção do RNA de fita dupla em bactérias antes do plaqueamento.

Demonstrando o procedimento Será Kathy Fuss, uma pesquisadora associada do meu laboratório Dentro de dois meses após o início do experimento, prepare a biblioteca de clones com as primeiras bactérias da biblioteca de alimentação selecionadas, bem como controles positivos e negativos em placas de tetraciclina carbônica LB. Para um controle positivo, use um clone contendo um gene que produz um fenótipo pós-embrionário dependente da dose, como o BLE quatro. Para um controle negativo, use um vetor vazio ou um clone contendo um pseudogene previsto sem fenótipos observados.

Incubar as placas durante a noite para cada clone e inocular dois mililitros de meio LB contendo 50 microgramas por mililitro. Ácido carbônico com uma única colônia das placas de estrias, incube as culturas durante a noite com agitação na manhã seguinte. As soluções devem ser a produção induzida por turvação de RNA de fita dupla adicionando IPTG às culturas e incubando-as por mais quatro a cinco horas nas mesmas condições.

A adição de IPTG garante um knockdown induzido por RNAI mais consistente e robusto do produto gênico do que depender apenas do IPTG e da broca da placa NGM Após a incubação do IPTG, coloque 30 microlitros de cultura de cada clone em cada poço das placas de RNAi NGM de 24 poços preparadas. Um clone por poço. Cada placa deve ter dois poços dedicados aos controles.

Cuidadosamente ma a localização de cada biblioteca. Clone nas placas de 24 poços agora coloque as placas descobertas em uma capa de fluxo estéril para secar por cerca de 20 minutos. Não permita que as bordas do ágar se soltem da placa.

Uma vez secos em nematóides estadiados nas placas, são dadas instruções sobre a preparação do nematóide. Na próxima seção, comece com uma população em estágios do primeiro estágio larval ou nematóides Lone. Começando com L, uma larva ignora potenciais fenótipos letais embrionários.

Ter uma população de animais em estágios para rastrear também aumenta a confiança de que quaisquer variações observadas são devidas ao RNAi e não são simplesmente variações normais que ocorrem em diferentes estágios. No entanto, se o RNAi causar um atraso no desenvolvimento, isso deve ser observado pelo rastreador Bleach. Uma população de estágio misto da cepa de triagem.

Apenas embriões protegidos com casca de ovo sobreviverão a esta etapa estágios animais dentro de 12 horas se conduzido a 20 graus Celsius ou dentro de 18 horas. Se realizado a 16 graus Celsius no dia em que as culturas bacterianas são inoculadas. Selecione três placas de 100 milímetros de triagem de animais de linhagem que são saudáveis e contêm gravidade, adultos e embriões.

Lavar todos os animais em meios M nine estéreis e transferir a lavagem para um tubo estéril de 15 mililitros com uma tampa de rosca. Se a lavagem for superior a 3,5 mililitros, gire sobre os animais e remova tudo, exceto 3,5 mililitros de líquido. Se for inferior a 3,5 mililitros.

Aumente o volume para 3,5 mililitros com água ou M nove para liberar os embriões dos adultos a 1,5 mililitros de uma mistura de hidróxido de sódio e alvejante a cada lavagem. Deixar os animais incubarem nesta solução durante um máximo de 10 minutos. Depois de iniciar um cronômetro, vórtice cada tubo por 10 segundos e repita o vórtice a cada dois minutos.

Após cada vórtice, observar a solução sob uma luneta de dissecação para carcaças de animais. Dentro de seis a oito minutos, os adultos serão fragmentados e os embriões devem ser liberados. Remover os embriões da solução de lixívia peletizando-os e removendo o máximo possível do sobrenadante sem perturbar o sedimento.

Em seguida, ressuspenda o pellet em um volume de 10 mililitros adicionando M nine estéril e usando agitação. Repita este processo de lavagem pelo menos mais uma vez até que o cheiro de alvejante seja completamente indetectável. Para um estágio mais apertado, os animais os prendem em seu estágio L um, chocando embriões em meio M nove sem comida.

Isso é feito transferindo os embriões em M nove para um pequeno frasco erlenmeyer. Agitar o balão durante a noite à temperatura adequada para a tensão e experimentar. Nesse período, todos os animais eclodirão e pararão na diapausa L one no dia seguinte.

Retome o crescimento das larvas a partir de um determinado ponto de tempo, transferindo-as para as bactérias preparadas que expressam RN de fita dupla. Este é o mesmo dia em que as placas de 24 poços foram manchadas com bactérias. Comece transferindo os animais L one para um tubo de 15 mililitros e girando-os para baixo. Em seguida, concentre os animais em meio a um mililitro de M nove e coloque cinco microlitros de nematóides concentrados em um prato.

Contar o número de animais na placa e ajustar a solução concentrada de nemátodes. TE 30 minhocas para cada três a 10 microlitros. Finalmente, coloque aproximadamente 30 L de animais de um estágio nas bactérias em cada poço preparado.

Placa de 24 poços mais de 30 animais por poço pode resultar em fome Depois que as manchas secarem, o que levará alguns minutos, prenda a tampa com o elástico incube os animais invertidos na temperatura e duração necessárias para pontuar os animais no estágio desejado. Quando os nematóides estiverem prontos para serem rastreados, confirme se os controles positivos e negativos produzem os fenótipos esperados. Em seguida, observe os animais experimentais em busca de anormalidades no desenvolvimento.

Em seguida, usando um microscópio de dissecação, monte de oito a 12 animais de cada poço em lâminas de PET 4% Agri com uma gota de anestésico de cinco microlitros. Depois de aplicar a lamínula adequada, fazer observações de, pelo menos, cinco animais utilizando microscopia composta. Mantenha um banco de dados organizado do gene, número de animais observados e resultados fenotípicos.

Para cada experimento de RNAI, verifique qualquer fenótipo produzido por R RNAi por outro fenótipo secundário, se possível, e repetindo o experimento, experimentos repetidos podem usar bactérias da mesma linhagem. Estrias mais velhas podem resultar em crescimento deficiente em culturas líquidas durante a noite e devem ser redesenhadas primeiro. Algumas culturas bacterianas não crescem bem por causa do produto gênico expresso em seu plasmídeo.

Nesse caso, basta concentrar as bactérias antes do revestimento. Para uma triagem contínua, é importante manter muitos embriões sempre prontos para o estadiamento. A cepa de triagem deve sempre ser alimentada, não morrer de fome e livre de contaminantes que possam afetar o fenótipo de interesse.

Estabelecemos um cronograma de manutenção para alimentação dos animais. Os genes que afetam a localização do DBL um foram identificados por RNAi usando um design de cepa para esta tela. A expressão normal da tag GFP dbl um inclui corpos celulares do cordão nervoso ventral e uma fileira de animais puncti alimentados com RA antisense para DBL.

Um mRNA mostrou expressão severamente atenuada de DBL um. Esses animais também eram pequenos, como animais sem DBL L um. A triagem de RNA I identificou com sucesso muitos outros genes cujos produtos afetam a localização do DBL um, expandindo assim nossa compreensão de como o TGF beta é trafegado subcelular e fornecendo um ponto de partida para muitas outras investigações.

Usando esse método, uma única pessoa pode razoavelmente encenar e observar de dois a quatro conjuntos de experimentos por semana. Por exemplo, animais encenados na segunda e terça-feira podem ser observados na quinta e sexta-feira, respectivamente, e os animais podem ser novamente encenados na sexta e sábado para segunda e terça-feira. Observação Ao seguir este procedimento em toda a tela.

É importante manter muitos embriões prontos para o estadiamento, portanto, mantenha a cepa de triagem regularmente. Além disso, é importante fazer anotações detalhadas sobre todas as observações.