Name: RNAi de triagem para identificar fenótipos pós-embrionário em C. elegans /em (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Aprenda a realizar triagem por RNAi para identificar reguladores pós-embrionários de expressão e localização de proteínas em C. elegans usando proteínas marcadas com fluorescência. Este método permite visualizar alterações fenotípicas com microscopia de fluorescência.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Rick Padgett (Instituto Waksman, Rutgers University, NJ) para o dom do dbl-1 cDNA e Christopher Dr. Rongo (Instituto Waksman, Rutgers University, NJ) para um marcador de injeção. O laboratório do Dr. Barth Grant realizou o bombardeio arma gene para a integração baixo número de cópias do GFP dbl-1 construto. O René Garcia laboratório forneceu assistência técnica durante a criação de texIs100. O René Garcia, lints Robyn, e Hongmin Qin laboratórios prestou assessoria produtivo. Este trabalho foi financiado por fundos start-up do Departamento TAMHSC de Medicina Molecular e Celular. O escopo composto e confocal girando do disco foram adquiridos com recursos fornecidos pelo departamento e do Colégio TAMHSC do Office Medicina do Dean.

<ol><li>Giacomotto, J., Segalat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+and+small+animal+models%2C+where+are+we%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening and small animal models, where are we.</a> Br. J. Pharmacol. 160, 204-216 (2010).</li>
<li>Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+approaches+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional genomic approaches in C. elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 351, 127-138 (2006).</li>
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<li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li>
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<li>Giordano-Santini, R., Dupuy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectable+genetic+markers+for+nematode+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life.+Sci%22%5BJournal%5D)">Selectable genetic markers for nematode transgenesis.</a> Cell. Mol. Life. Sci. , (2011).</li>
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<li>Simmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+putative+RNA-directed+RNA+polymerase+RRF-3+makes+C.+elegans+hypersensitive+to+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi.</a> Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).</li>
<li>Zhuang, J. J., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specificity+of+Caenorhabditis+elegans+enhanced+RNAi+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans enhanced RNAi mutants.</a> Genetics. , (2011).</li>
<li>Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Caenorhabditis+elegans+genes+regulating+longevity+using+enhanced+RNAi-sensitive+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of Caenorhabditis elegans genes regulating longevity using enhanced RNAi-sensitive strains.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 72, 489-497 (2007).</li>
<li>Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+misexpression+of+germline+P+granules+and+enhanced+RNA+interference+in+retinoblastoma+pathway+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants.</a> Nature. 436, 593-597 (2005).</li>
<li>Fraser, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+chromosome+I+by+systematic+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference.</a> Nature. 408, 325-330 (2000).</li>
<li>Kamath, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li>
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<li>Thacker, C., Peters, K., Srayko, M., Rose, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bli-4+locus+of+Caenorhabditis+elegans+encodes+structurally+distinct+kex2%2Fsubtilisin-like+endoproteases+essential+for+early+development+and+adult+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The bli-4 locus of Caenorhabditis elegans encodes structurally distinct kex2/subtilisin-like endoproteases essential for early development and adult morphology.</a> Genes & Development. 9, 956-971 (1995).</li>
<li>Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+cycle+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.+I.+Wild-type+growth+and+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction.</a> Dev. Biol. 51, 23-33 (1976).</li>
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<li>Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screen+for+small+body+size+mutants+in+C.+elegans+reveals+many+TGFbeta+pathway+components%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFbeta pathway components.</a> Genesis. 35, 239-247 (2003).</li>
<li>Qu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+analysis+of+the+Ahringer+Caenorhabditis+elegans+RNAi+feeding+library%3A+a+guide+for+genome-wide+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Reliability analysis of the Ahringer Caenorhabditis elegans RNAi feeding library: a guide for genome-wide screens.</a> BMC Genomics. 12, 1471-2164 (2011).</li>
<li>Nelson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Bow-Tie+Genetic+Architecture+for+Morphogenesis+Suggested+by+a+Genome-Wide+RNAi+Screen+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A Bow-Tie Genetic Architecture for Morphogenesis Suggested by a Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 7, e1002010(2011).</li>
<li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interference+by+ingested+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854(1998).</li>
<li>Sarin, S., Prabhu, S., O'Meara, M. M., Pe'er, I., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+mutant+allele+identification+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans mutant allele identification by whole-genome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 865-867 (2008).</li>
<li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+culture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Basic culture methods.</a> Methods in Cell Biology. 48, 3-29 (1995).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
</ol>

Não temos nada a divulgar.

O método de triagem RNAi aqui apresentado permite uma análise rápida e sensível de produtos de genes necessários para um fenótipo (ou transgénico) normal pós-embrionário. O exemplo mostrado é um ecrã para genes envolvidos na localização subcelular de uma proteína fluorescentemente marcado. No entanto, este protocolo pode ser modificado para identificar genes que afectam outros fenótipos pós-embrionário de interesse. Este método tira proveito de uma abordagem do gene candidato usando uma bibl...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Agar NGM </td><td> Meio de crescimento de nemátodos </td><td> IPM Scientific, Inc </td><td> Pode ser preparado seguindo NGM protocolo ágar 25 </td></tr><tr><td> Meio M9 </td><td> 22mm KH 2 PO 4, 42mm de Na 2 HPO 4, 86mm de NaCl, 1 mM de MgSO4 </td><td></td><td> 26 </td></tr><tr><td> Agar-Agar </td><td> Merck </td><td> 1.01614.1000 </td><td> 2% em água para placas NGM. 4% em água para almofadas de lâmina de microscópio (autoclave inicialmente e de microondas para derreter a seguir). </td></tr><tr><td> Bacto Peptona </td><td> Becton Dickinson - Difco CP </td><td> 211677 </td><td> 0,25% </td&gt; </tr><tr><td> IPTG </td><td> Research Products International Corp </td><td> I56000-5.0 </td><td> 1 mM de concentração final, </td></tr><tr><td> carbenicilina </td><td> Research Products International Corp </td><td> C46000-5.0 </td><td> 50 ug / ml de diluição de trabalho </td></tr><tr><td> LB Broth Lennox </td><td> Becton Dickinson - Difco CP </td><td> 240230 </td><td> 20 g / litro </td></tr><tr><td> tetraciclina </td><td> Sigma </td><td> 268054 </td><td> 12,5 ug / ml de diluição de trabalho </td></tr><tr><td> hipoclorito de sódio </td><td> Qualquer marca </td><td> Lixívia a 5% </td><td> Use água sanitária fresco. </td></tr><tr><td> de hidróxido de sódio </td><td> Qualquer Marca </td><td> CAS 1310-73-2 </td><td> 5 estoque de N </td></tr><tr><td> Meio M9 </td><td> Wormlab Livro de Receitas </td><td> <a href="http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab">http://1</a>30.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm # Commonlab </td><td> 26 </td></tr><tr><td> levamisol </td><td> Sigma </td><td> 31742 </td><td> 100 uM - 1 mM de diluição de trabalho </td></tr><tr><td> de azida de sódio </td><td> Fisher Scientific </td><td> S227 </td><td> 10 mM em M9 diluição de trabalho </td></tr><tr><td> 24-bem placa </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 662160 </td><td> Distribuidor VWR </td></tr><tr><td> lâminas de microscópio </td><td> Qualquer marca </td><td> 75 x 25 x 1 mm </td><td></td></tr><tr><td> cobertura deslizamentos de microscópio </td><td> Qualquer marca </td><td> 22 x 22 mm No.1.5 </td><td> Utilizar a espessura recomendada pelo fabricante microscópio. </td></tr><tr><td> microscópio composto </td><td> Carl Zeiss, Inc. </td><td> A1m </td><td> Use objetivos e filtros para atender às necessidades do experimento. </td></tr><tr><td> bomba de mídia</td><td> Manómetro da bomba Varistaltic </td><td> Kate modelo # 72-620-000 </td><td> Utilize tubos e configurações adequadas para a máquina </td></tr></tbody></table>

rnai de triagem para identificar fenótipos pós-embrionário em c. elegans</em

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans tem provado ser um sistema de modelo valioso para a descoberta e caracterização funcional de muitos genes e vias gene 1. Instrumentos mais sofisticados e recursos para estudos neste sistema estão facilitando a descoberta contínua de genes com fenótipos mais sutis ou funções. Aqui nós apresentamos um protocolo generalizada, adaptado para a identificação de C. elegans genes com fenótipos pós-embrionário de interesse usando RNAi 2. Este procedimento é facilmente modificado para ensaio do fenótipo de escolha, seja por óptica de luz ou de fluorescência em um microscópio de dissecação ou composto. Este protocolo de triagem capitaliza os ativos físicos do organismo e ferramentas moleculares a C. elegans comunidade científica tem produzido. Como um exemplo, que demonstram o uso de um transgene integrado que expressa um produto fluorescente em uma tela RNAi para identificar genes necessários para a localização normal desteproduto em larvas fase tardia e adultos. Em primeiro lugar, utilizou-se uma biblioteca genómica comercialmente disponível RNAi com full-length inserções de ADNc. Esta biblioteca facilita a rápida identificação de vários candidatos por RNAi redução do produto do gene candidato. Em segundo lugar, gerou um transgene integrado que expressa nossa proteína fluorecently marcados de interesse em um fundo RNAi-sensível. Em terceiro lugar, por exposição dos animais a eclodidos RNAi, esta tela permitir a identificação de produtos de genes que desempenham um papel vital embrionário que de outra forma mascarar um papel pós-embrionário na regulação da proteína de interesse. Por último, este ecrã utiliza um microscópio composto equipado para a resolução de célula única.

Nós descrevemos um método sensibilizada para identificar os reguladores pós-embrionário de expressão da proteína e localização no<em&gt; C. elegans</em&gt; Usando uma tela de genoma baseada em RNAi e um transgene integrado que expressa uma proteína fluorescente funcional marcada.

RNAi de triagem para identificar fenótipos pós-embrionário em C. elegans</em

O C. elegans provou ser um sistema modelo valioso para a descoberta e caracterização funcional de muitos genes e vias gênicas1. Métodos mais sofisticados...

O objetivo deste procedimento é identificar reguladores pós-embrionários da expressão e localização de proteínas em C. elegans utilizando uma triagem genômica baseada em RNAi e proteínas marcadas com fluorescência. Uma vez que a linhagem apropriada para triagem é construída, uma biblioteca de RNAi é escolhida. O primeiro passo do procedimento é empacotar os clones da biblioteca em bactérias.As bactérias são então selecionadas, cultivadas e fornecidas como alimento a nematoides C. elegans em estágios definidos. Após permitir que os nematoides cresçam por 72 horas, eles são observados quanto a alterações no fenótipo de interesse. Em última instância, alterações na expressão ou na localização subcelular da proteína alvo são visualizadas por microscopia de fluorescência.Este método pode identificar genes necessários para a correta localização subcelular de uma proteína marcada com fluorescência. No entanto, este protocolo pode ser modificado para identificar genes que afetam outros fenótipos pós-embrionários de interesse. A principal vantagem desta técnica em relação aos protocolos publicados existentes é que otimizamos a consistência e o nível da resposta de RNAi em animais mediante a

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Neurexinas e neuroliginas são proteínas da membrana do neurônio-adesão que desempenham papéis essenciais na diferenciação e transmissão sináptica. Mutantes neuroligina deficiente...

Evitar osmótica em Caenorhabditis elegans: Função Synaptic de dois genes, Orthologues dos Direitos Humanos NRXN1 E NLGN1, Como candidatos para o autismo

Imagem C. elegans Os embriões utilizando um microscópio de epifluorescência e Software de Código Aberto

Quantitativos e automatizada de alto rendimento de todo o genoma Telas de RNAi em C. elegans</em

Nós demonstramos como usar a técnica de alimentação RNAi para derrubar genes-alvo e pontuação fenótipo tamanho do...

Usando RNA mediada estratégia de alimentação Interferência em tela para genes envolvidos na regulação do tamanho corporal na Nemátodo<em&gt; C. elegans</em

Enquanto dsRNA alimentação em C. elegans é uma ferramenta poderosa para avaliar a função do gene, os protocolos atuais para telas de alimentação em grande escala resultar em eficiências knockdown variáveis. Descreve-se um protocolo melhorado para a realização em grande escala de RNAi telas de alimentação, que resulta em knockdown altamente eficaz e reprodutível de expressão do gene.

Em larga escala Knockdown Gene em<em&gt; C. elegans</em&gt; Usando bibliotecas de alimentação dsRNA para gerar fenótipos robustos perda de função

Este protocolo descreve como as células em divisão imagem dentro de um tecido em Caenorhabditis elegans embriões. Embora vários protocolos descrevem como a divisão celular imagem no embrião precoce, este protocolo descreve como imagem divisão celular dentro de um tecido em desenvolvimento em meados embriogénese tardia.

Visualizando neuroblasto Cytokinesis Durante<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriogênese

Este trabalho descreve um protocolo semi-alta de supressão que permite imagens simultâneas de lapso de tempo 3D de embriaênese embrionária em embriões de 80-100 C. elegans em uma única corrida noturna. Além disso, as ferramentas de processamento e visualização de imagens são incluídas para simplificar a análise de dados. A combinação destes métodos com tensões personalizadas do repórter permite a monitoração detalhada do embryogenesis.

Um método de imagem semi-alta-fonte e um kit de ferramentas de visualização de dados para analisar o desenvolvimento embrionário de C. elegans

Para estudar as interações acompanhante-acompanhante e acompanhante-substrato, realizamos telas de interação sintética em elegans caenorhabditis usando interferência de RNA em combinação com mutações leves ou sobre-expressão de acompanhantes e monitorar disfunção proteica específica do tecido no nível do organismo.

Usando elegans caenorhabditis para tela para interações de acompanhantes específicas de tecido

O nematode geneticamente tratável Caenorhabditis elegans pode ser usado como um modelo simples e barato para a descoberta de drogas. Descrito aqui é um protocolo para identificar terapêutica anticancerígenas que inibem a sinalização a jusante das proteínas RAS e EGFR.

Identificação de Inibidores EGFR e RAS utilizando elegans caenorhabditis

Esse protocolo oferece um procedimento simples e de baixo custo para quantificar a taxa de letalidade embrionária em Caenorhabditis elegans. Ele permite a detecção direta de anomalias embrionárias em populações, sem equipamentos especializados ou expertise em coleta de vermes. O protocolo pode ser usado para quantificar os efeitos de mutações genéticas, derrubamentos gênicos mediados por interferência de RNA e dieta.

Quantificando a Taxa de Letalidade Embrionária em Caenorhabditis elegans

Aprenda a realizar triagem por RNAi para identificar reguladores pós-embrionários de expressão e localização de proteínas em C. elegans usando proteínas marcadas com fluorescência. Este método permite visualizar alterações fenotípicas com microscopia de fluorescência.

RNAi de triagem para identificar fenótipos pós-embrionário em C. elegans

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