Ligadura altamente eficiente de pequeno RNA moléculas microRNA para quantificação por sequenciamento de alto rendimento

O objetivo geral deste procedimento é preparar microRNAs de forma imparcial para sequenciamento de alto rendimento. Isso é feito primeiro preparando ou comprando oligonucleotídeos de DNA que são competentes para ligação às três extremidades principais do micro RNA. O segundo passo é ligar os três oligonucleotídeos de DNA primários às três extremidades principais do micro RNA.

Em seguida, o produto de ligação é purificado em gel e o ligante de oligonucleotídeo de cinco RNA primários é ligado às cinco extremidades principais do micro RNA. A etapa final é converter as moléculas híbridas em CDNA e, em seguida, amplificar o CDNA por reação em cadeia da polimerase. Em última análise, a clonagem de microRNA e o sequenciamento de alto rendimento são usados para mostrar o perfil amplo do transcriptoma de microRNAs de maneira quantitativa na resolução de nucleotídeos individuais.

A principal vantagem de nossa técnica sobre as técnicas existentes, como micro sequenciamento de microray qPCR blot, é que nossa técnica reflete mais o nível real de microray em uma ampla escala de laboratório de transcrição em uma resolução de nucleotídeo único. Embora esse método possa fornecer informações sobre a biologia do microRNA, ele também pode ser aplicado a outras tecnologias de sequenciamento de alto rendimento, como clipe HC e RNA-Seq. Os oligonucleotídeos de DNA para este procedimento são projetados para três reações de ligação primária e devem ter um grupo fosfato de cinco primos, um dinucleotídeo randomizado na extremidade de cinco primos e uma citosina de três primos diluindo os oligonucleotídeos de DNA a 100 micromolares em água livre de nuclease.

Monte a reação de ventilação combinando esses agentes reagentes 200 pico moles dos três oligonucleotídeos ligantes primos, quatro microlitros de cinco tampão de ventilação DNAA primário, quatro microlitros de um TP, quatro microlitros de M-T-H-R-N-A, água livre de ligase e nuclease para um volume final de 40 microlitros. Incube a reação a 65 graus Celsius por uma hora. Termine a reação aquecendo a 85 graus Celsius por cinco minutos.

Precipite o ligante TED adicionando 2,5 volumes de etanol a 100% e um terço do volume de acetato de amônio 10 molar. Para remover um TP residual e evitar ligações imprevistas em reações futuras, misture a solução de álcool, sal e oligonucleotídeos até homogeneizar girando a velocidade máxima em uma microcentrífuga a quatro graus Celsius por 20 minutos. Lave o pellet em etanol a 70% ao ar seco e ressuspenda o pellet no volume apropriado de água livre de nuclease para produzir 50 a 100 micromolares de um oligonucleotídeo ventilado.

Confirme a ventilação do oligonucleotídeo por eletroforese em um gel de poliacrilamida a 18%. Pré-execute o gel por 30 minutos a 24 volts centímetro de largura do gel com um buffer de execução XTBE à temperatura ambiente. Quando os 30 minutos terminarem, lave os poços com buffer de corrida.

Os oligonucleotídeos de DNA para este procedimento são projetados para três reações de ligação primária e devem ter um grupo fosfato de cinco primos, um dinucleotídeo randomizado na extremidade de cinco primos e uma ocitocina de três primos. Diluir os oligonucleotídeos de DNA a 100 micromolares em água livre de nuclease. Execute o gel a 24 volts por centímetro até que o azul de bromo fenol esteja a três quartos do caminho até o fundo do pino de gel.

Pinte o gel com uma solução de ouro cibernético em um XTBE e visualize em uma caixa de transluminador UV. Deve haver uma única mudança de nucleotídeo no tamanho do oligonucleotídeo de DNA que foi submetido a uma ventilação por M-T-H-R-N-A ligase para a reação de ligação de três primos. Monte os seguintes componentes no gelo nesta ordem.

Um microlitro de 50% PEG 8, 000 0,5 microlitros de tampão ligase 10 XRNA. Um microlitro de um ligante ventilado de três primos, 0,5 microlitros de inibidor de RNAs, 0,5 a oito microgramas de RNA total, 0,5 microlitros de T, quatro RNA, Ligase, dois e água livre de nuclease até um volume final de cinco microlitros. Misture a reação pipetando uma vez bem misturada.

Coloque a reação em um termociclador com tampa aquecida. Defina o bloco para 16 graus Celsius e incube por quatro horas. Observe que a reação pode ser dimensionada até um volume final de 20 microlitros sem qualquer perda na eficiência da ligadura.

Após a ligação de três primos, misture a reação com um volume igual de dois XRNA carregando o calor do tampão a 70 graus Celsius por cinco minutos e deixe esfriar no gelo. Próximo gel. Purifique a amostra em um gel de poliacrilamida a 15%.

Pré-execute o gel a 24 volts centímetro de largura do gel por pelo menos 30 minutos. Desligue a fonte de alimentação e lave os poços com buffer de corrida. Carregue a amostra e execute o gel na mesma voltagem da pré-corrida até que o bromo fenol tenha acabado de sair do gel.

O produto desejado migrará para perto do ciano xileno quando a eletroforese em gel de poliacrilamida estiver completa. Coloque o gel em uma bandeja limpa com um x tampão de corrida e um x cyber gold e balance por 15 minutos. Remova o gel da placa de coloração e visualize em uma caixa de transluminador UV coberta com filme plástico limpo.

O produto de ligação deve ter cerca de 45 nucleotídeos de comprimento. Como esse produto de ligação geralmente não é visível, é importante incluir uma amostra de RNA sintético de controle positivo na faixa adjacente usando uma lâmina de barbear limpa, a região que contém o produto de ligação. Guiado pelas posições da amostra de RNA sintético e pelos padrões de tamanho.

Colocar o fragmento de gel de consumo num tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitros. Perfure a parte inferior do tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro com uma agulha de calibre 30 e coloque o tubo de perfuração em uma segunda centrífuga de tubo de microcentrífuga limpa de baixa retenção, de 1,5 mililitro por cinco minutos a cerca de 15.000 vezes. G. Confirme visualmente se toda a fatia de gel se moveu através do orifício no tubo interno.

Se necessário, use uma ponta de pipeta limpa para empurrar alguns fragmentos de gel para mais perto do orifício. Descarte o tubo vazio de 0,5 mililitro e adicione 400 microlitros de tampão de coluna de alto teor de sal à pasta de acrilamida. Balance o tubo a quatro graus Celsius durante a noite no dia seguinte.

Transfira a pasta para uma coluna de rotação de acetato de celulose de 0,22 mícron usando uma centrífuga de ponta de pipeta de diâmetro largo por três minutos à temperatura ambiente em cerca de 15.000 vezes. G para coletar todo o líquido da matriz de gel de acrilamida. Transfira o líquido para um tubo limpo de baixa retenção de 1,5 mililitro contendo um microlitro de uma solução de glicogênio de 20 miligramas por mililitro.

Adicione um volume igual de isopropanol e um décimo volume de acetato de sódio e misture a solução invertendo o tubo várias vezes. Precipite em um freezer de 80 graus Celsius negativos por 20 minutos. Centrifugue em velocidade máxima a quatro graus Celsius por 20 minutos.

Para pellet o ácido nucléico, remova o snat e lave em ar com etanol a 70%. Seque o pellet por 10 minutos em temperatura ambiente e prossiga diretamente para a etapa de ligação de cinco primos. Para iniciar este procedimento, adicione os seguintes componentes ao ácido nucleico peletizado anteriormente, dois microlitros de PEG 8.000, 0,5 microlitros de tampão RNA Ligase, 0,5 microlitros de TP, 0,5 microlitros de ligante, oligonucleotídeo de RNA e água para um volume final de quatro microlitros.

Misturar esta amostra pipetando repetidamente para cima e para baixo durante um período máximo de cinco minutos, para garantir que o pellet foi completamente resolubilizado. Assim que o pellet estiver em solução, transfira o conteúdo para um tubo de PCR limpo contendo um microlitro de uma mistura um-para-um de inibidor de RNAs e T quatro RNA ligase um misturado por pipetagem para cima e para baixo. Incube a reação em um termociclador a 37 graus Celsius por quatro horas.

Quando a reação estiver completa, prossiga imediatamente para a síntese de CD NA conforme descrito no texto do protocolo após a ligação do ligante aos três primos do RNA e a análise de página das reações. Bandas nítidas de alto peso molecular são evidentes na região de 100 a 300 nucleotídeos do gel, o que indica que a amostra total de RNA usada é de alta qualidade. O sinal muito brilhante na região de 25 nucleotídeos do gel é o excesso de RNA sintético de três ligantes primos não ligados, indicando uma ligação realizada com cinco picomoles de micro RNA sintético e um ligante de três primos, que foi purificado em gel.

Aqui é mostrado um auto radiograma de três reações de ligação primária realizadas com P 32 5 prime e micro RNA sintético marcado. O número de horas que a reação foi autorizada a prosseguir é indicado na parte superior, e os números na parte inferior indicam os valores ligados como uma porcentagem da soma de não ligados e ligados. Este auto radiograma é de cinco reações de ligação primária realizadas com P 32 5 micro RNA sintético marcado com extremidade primária três híbridos de ligante primo.

Os números na parte inferior indicam as quantidades ligadas como uma porcentagem da soma de não ligado e ligado e revelam a importância de usar uma alta concentração de PEG 8.000 pequenos R-N-A-D-N-A. Bibliotecas compatíveis para sequenciamento de alto rendimento são geradas posteriormente por PCR. O número adequado de ciclos de PCR é determinado empiricamente.

Neste exemplo, o tamanho do produto de DNA esperado é de 146 pares de bases Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada corretamente em apenas dois dias. Ao realizar esta técnica, é importante lembrar de manter todas as pontas e tubos livres de RNAs.