Name: Ligadura altamente eficiente de pequeno RNA moléculas microRNA para quantificação por sequenciamento de alto rendimento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 15 s
Description: Aprenda a clonar microRNAs com alta eficiência usando ligadura de oligonucleotídeos e sequenciamento de alto rendimento. Este método permite quantificação genômica precisa para estudos de regulação gênica.

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Os autores gostariam de agradecer aos membros do laboratório Yi, especialmente Zhaojie Zhang, pelas discussões frutíferas sobre o design do linker e as eficiências de ligação, bem como à American Cancer Society por apoiar este trabalho por meio de uma bolsa de pós-doutorado (# 125209) para J.E.L. A pesquisa relatada nesta publicação também foi apoiada pelo Instituto Nacional de Artrite e Doenças Musculoesqueléticas e de Pele dos Institutos Nacionais de Saúde sob o número de prêmio R01AR059697 (para R.Y.) e uma bolsa de pesquisa do Instituto Linda Crnic para Síndrome de Down. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

NOTA: É crítico para manter condições isentas de RNase durante todo o procedimento. 1. adenilação de 3 &#39;Linker <ol><li> Diluir oligonucleótido de ADN concebidos para reacções 3 &#39;de ligação para 100 uM em meio livre de nuclease de H 2 O. NOTA: O oligonucleótido deve ter um &#39;grupo fosfato, um dinucleótido randomizados no terminal 5&#39; 5 fim, e um &quot;3 didesoxicitosina. A 5 &#39;grupo fosfato é um requisito da enzima Mth para eficiente 5&#39; 10 adenilação. O fosfato pode ser adicionado ao pré-tratamento do oligonucleótido com um polinucleótido-quinase, ou encomendado com a modificação directa. O dinucleótido randomizado na extremidade 5 &#39;é importante para minimizar a preferência ligases de ARN que exibem determinados para-extremidade final juntando reacções sobre os outros seis sequência. A 3 &#39;didesoxicitosina coloca um elemento de bloqueio na extremidade 3&#39; do oligonucleótido to inibir a formação de concatâmeros ligante-ligante durante os passos de ligação subsequentes e também serve para bloquear &#39;extremidade da molécula de miARN-Ligante formada na extremidade de 3&#39; da reacção de ligação 3 11. A sequência de oligonucleótido ligante escolhido para o método de miR-Seq imparcial é como se segue: 5&#39;PO 4 NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-dideoxyC3 &#39;. </li><li> Montar o seguinte reacção adenilação: 200 pmol 3 &#39;oligonucleótido ligante, 4 ul 10x 5&#39; tampão de adenilação de ADN, ATP 1 mM de 4 ul, 4 ul de RNA-ligase Mth, livre de nuclease H 2 O para um volume final de 40 ul. </li><li> Incubar reacção a 65 ° C durante 1 hora. Terminar a reacção por aquecimento a 85 ° C durante 5 min. </li><li> Precipitar ligante adenilada pela adição de 2,5 volumes de etanol a 100% e 1/3 volume de 10 M de acetato de amónio para remover o ATP residual e para evitar imprevistos em ligaduras reacções futuras. <ol><li> Resumidamente, misture o alcohol, sal, oligo e solução até à homogeneidade, girando à velocidade máxima numa microcentrífuga (~ 15.000 xg) a 4 ° C durante 20 min. Lavou-se a pelota em etanol a 70%, ar seco, e ressuspender em um volume apropriado de livre de nuclease H 2 O para dar 50-100 uM de oligo adenilada. </li></ol></li><li> Confirme adenilação executando um gel de poliacrilamida 18%. <ol><li> Prepare o gel por mistura do seguinte em conjunto: 6,3 g de ureia, 6,75 ml de 40% de acrilamida, e 1,5 ml de 10x TBE. Adicionar H2O a 15 ml. </li><li> Misturar até que a ureia é completamente dissolvido e adicionar 150 ul 10% (w / v) de persulfato de amónio (APS) e 15 ul tetramethlyethylenediamine (TEMED). </li><li> Depois gel definiu, pré-corrida por 30 minutos a 24 V / cm de largura com gel TBE 1x tampão de corrida à temperatura ambiente. Depois de 30 minutos é de até poços lave com tampão de corrida. </li><li> Misturar 5 pmol de oligonucleótidos adenilada e com igual volume de tampão de carga desnaturante ARN 2x (95% (v / v) de formamida,0,02% (w / v) de SDS, 0,02% de azul de bromofenol (w / v), 0,01% (w / v), xileno cianol, EDTA 1,0 mM), o calor rapidamente para 75 ° C, e SNAP arrefecida em gelo. Dispensar amostra inteira dentro do poço do gel. Também incluem uma quantidade idêntica de controle não-adenilada e baixos padrões de tamanho peso molecular. </li><li> Submeter o gel a 24 V / cm até o azul de bromofenol é ¾ do caminho para o fundo do gel. Desmonte aparelho, gel pós-mancha com uma solução de SYBR-gold 1x em 1x TBE e visualizar na caixa UV-transilluminator (Figura 2). NOTA: Gel purificar o oligo adenilada de um modo semelhante ao descrito acima, se &quot;nenhum ARN de entrada&quot; controles estão resultando numa elevada quantidade de produto de PCR, em comparação com amostras com níveis de ARN de entrada. </li></ol></li></ol> 2. Ligador Ligadura para 3 &#39;Fim da miARN <ol><li> 3 &#39;Ligadura <ol><li> Montar os seguintes componentes em gelo, na ordem indicada: 1,0 ul de 50% (w / v) de PEG 8000, 0,5 &amp;# 956; l 10x tampão de ligase de RNA (500 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT), 1,0 ul adenilada 3 &#39;Ligante (100 uM), 0,5 ul de inibidor de RNase, 0,5-8,0 ug de RNA total, 0,5 ul de RNA-ligase de T4 2, livre de nuclease H 2 O para um volume final de 5 mL. </li><li> Misturar por pipetagem a reacção como a solução é demasiado viscoso para vórtice, devido à alta concentração de PEG 8000. Uma vez cuidadosamente misturado, coloque a reacção num termociclador com uma tampa aquecida. Definir o bloco a 16 ° C, e incubar durante 4 horas. NOTA: A reacção pode ser dimensionado para um volume final de 20 ul, sem qualquer perda na eficiência da ligação. Reagir durante 4 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C, para se obter eficiências de ligação essencialmente idênticos. </li></ol></li><li> Gel Purificação <ol><li> Após 3 &#39;ligadura, misturar a mistura reaccional com um volume igual de 2x tampão de carga de ARN. Aquece-se a 70 ° C durante 5 min, e encaixe fria em gelo. </li&gt; <li> Correr a amostra num gel de poliacrilamida a 15% para a purificação PAGE. <ol><li> Prepare-se um gel de poliacrilamida a 15% contendo ureia 7 M, de um modo semelhante ao descrito anteriormente no passo 1.5. </li><li> Pré-correr o gel a 24 V / cm de largura do gel para, pelo menos, 30 min. Desligue a alimentação, lavar poços, amostra de carga e gel corrida em mesma tensão como pré-corrida. </li><li> Coloque a amostra e execute a página até o azul de bromofenol acaba de sair o gel. O produto desejado migrará perto do cianol xileno. </li></ol></li></ol></li><li> Coloração, visualização e Excisão <ol><li> Desmonte aparelho de gel e coloque gel na bandeja limpa com 1x tampão de corrida (TBE), 1x SYBR-ouro e pedra para 15 min. </li><li> Retire o gel da coloração prato e visualizar na caixa transiluminador UV coberta com filme plástico limpo. O produto de ligação deve ser cerca de 45 nucleótidos de comprimento. </li><li> Impostos especiais de consumo da região que contém o produto da ligação com uma razo limpor lâmina e coloque em 0,5 ml tubo micro-centrífuga. </li></ol></li><li> Isolamento produto e precipitação <ol><li> Pierce fundo do tubo 0,5 ml de microcentrífuga com uma agulha de 30 G e colocar o tubo perfurado em um segundo limpo, baixa retenção, 1,5 ml tubo de microcentrífuga. Centrifugar durante 5 min a 15.000 x g ~. </li><li> Visualmente confirmar que toda a fatia de gel foi movido através do furo no tubo interior. Se necessário, use uma ponta de pipeta limpa para empurrar alguns fragmentos de gel mais perto do buraco. </li><li> Descartar o tubo vazio de 0,5 ml e adicionar 400 ul de tampão de coluna de alto teor salino (HSCB NaCl 400 mM, 25 mM Tris-HCl pH 7,5, SDS a 0,1%) para a pasta de acrilamida. Tubo (s) de rocha, a 4 ° C durante a noite. </li><li> Transferência de lodo a uma coluna de rotação de acetato de celulose de 0,22 micron, com uma pipeta de ponta de todo o furo. Centrifugar durante 3 minutos à temperatura ambiente em ~ 15.000 xg para recolher todo o líquido para longe da matriz de gel de acrilamida. </li><li> Transferir o líquido para um, de baixa retenção limpo, tubo de 1,5 ml contering 1 ml de 20 mg / ml de glicogênio. Adicionar um volume igual de isopropanol e 1/10 de volume de acetato de sódio. Misturar a solução por inversão do tubo várias vezes e precipitar no freezer -80 ° C durante 20 min. </li><li> Centrifugar a plena velocidade a 4 ° C durante 20 min para sedimentar o ácido nucleico. Remover o sobrenadante e lava-se em etanol a 70%. Ar sedimento seco durante 10 min à temperatura ambiente e seguir directamente a 5 &#39;passo de ligação. </li></ol></li></ol> 3. Ligador Ligadura para 5 &#39;Fim da miARN-3&#39; Ligador híbrido <ol><li> Para o ácido nucleico sedimentadas, adicionar os seguintes componentes: 2 uL de PEG 8000 (50% w / v), 0,5 ul de RNA-ligase 10x Tampão, 0,5 ul de ATP (10 mM), 0,5 ul de RNA-NN oligo (100 uM), e H 2 O para um volume final de 4 mL. NOTA: A composição do &#39;oligo NN-ARN &quot;é como se segue 5&#39;-didesoxi-TCUACAGUCCGACGAUCNN3 invertido&#39; e foi purificado por HPLC pelo fabricante. </li><li> Misturaresta amostra por pipetagem cima e para baixo repetidamente. Fazer isso há algum tempo (até 5 minutos), para assegurar que o sedimento foi completamente re-solubilizado. Se a re-solubilização é problemático, aquecer a amostra brevemente (3-5 min) a 37 ° C e retomar pipetagem para misturar. </li><li> Uma vez que o sedimento é de volta em solução, transferir o conteúdo para um tubo limpo de PCR contendo 1 ml de uma mistura 1: 1 de inibidor de RNase e T4 RNA ligase 1 (5 unidades). Novamente misture por pipetagem cima e para baixo. </li><li> Incubar a reacção num termociclador a 37 ° C durante 4 h. Prosseguir imediatamente para a síntese de cDNA. </li></ol> 4. Transcrição Reversa / cDNA Synthesis <ol><li> Adicionar os seguintes componentes para a 5 &#39;da reacção de ligação: 2 ul de tampão 5x RT, 0,75 ul de DTT 100 mM, 1 ul Iniciador RT Ilumina-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA 5&#39;-3&#39; (1 uM), e 0,5 ul de dNTPs (10 mM). </li><li> Misturar por pipetagem e aquecer a 65 ° C durante 5 min. Em seguida, resfriar lentamente no banco top. </li><li> Depois da reacção ter arrefecido até à temperatura ambiente, coloque o tubo em gelo e adicionar 0,5 ul de cada enzima transcriptase inversa e um inibidor de RNase. Misturar por pipetagem, e colocados no termociclador para o passo de extensão indicado nas instruções do fabricante. </li><li> Uma vez completa suplemento de 5 ul livre de nuclease H2O para levar o volume final da biblioteca de cDNA até 15 ul. </li></ol> 5. Preparação Biblioteca <ol><li> Para a indexação de PCR, montar a seguinte reacção em gelo: 6 ul de 5x Tampão Phusion, 1 ul de dNTPs (10 mM), 0,9 ul de DMSO, 0,75 ul 5 &#39;iniciador (25? M), 0,75 ul iniciador 3&#39; (25? M), biblioteca de cDNA de 3 ul (concentração variável, dependendo da quantidade de entrada), 0,5 ul Phusion polimerase (1 unidade), isento de nuclease de H 2 O para um volume final de 30 ul. Escolha as seqüências de primers para garantir a compatibilidade com o modelo ea plataforma de sequenciamento deescolha. <ol><li> Executar a reacção de PCR com as seguintes definições: desnaturação inicial a 98 ° C durante 3 minutos, durante os primeiros 4 ciclos, desnaturar a 98 ° C durante 15 seg, recozimento a 50 ° C durante 15 seg, estender a 72 ° C durante 15 seg . NOTA: Dependendo da quantidade de material de entrada, variar o total de números de ciclos de PCR. Tipicamente, para uma entrada de 1-2 ug de RNA total, 13 ciclos de PCR no total são suficientes para gerar a biblioteca de miR-Seq. </li><li> Realizar os ciclos subsequentes, por exemplo, ciclos de 5-12, de um modo em duas etapas, onde os ciclos de recozimento e de extensão são combinados e realizados a 70 ° C durante 30 seg e desnaturação é novamente 98 ° C durante 15 seg. NOTA: O volume de reacção é de 30 uL para permitir a pausa do programa de PCR e remover uma alíquota de 10 ul em números de ciclos pré-determinados para monitorizar a aparência do produto desejado. Tipicamente, os ciclos de 10, 13, e 16 são escolhidos para o teste a partir de uma amostra de ARN total. </li></ol></li><li> Preparara 8% não desnaturante em gel de acrilamida por mistura de 2 ml de 40% de acrilamida, 1 ml de 10x TBE, e H 2 O a 10 ml. Em seguida, adicione 100 ml de 10% de APS e 10 ml de TEMED. Despeje gel e deixe set. <ol><li> Pré-correr o gel a 12 V / cm de largura de gel durante 30 min. Poços flush. Adicionar 1 ml de tampão de carregamento de 10x (15% de Ficoll-400, 66 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1% (w / v) de SDS, 0,01% (w / v) de azul de bromofenol), adicionar 10 ul de amostra a cada poço de dimensões 5 milímetros x 1 mm x 15 milímetros. Normalmente, cada poço pode carregar até 30 l de amostras. Executar o gel de amostra a 10 V / cm de largura de gel em tampão 1 x TBE até que o corante azul de bromofenol apenas corre para fora do fundo do gel. </li><li> Mancha e visualizar gel como descrito no passo 2.3. </li><li> Excisar o par de banda de base 146 e elui-se durante a noite em 0,25 mL de HSCB de uma forma similar ao que é descrito na secção 2.4. Precipitar o DNA num volume igual de isopropanol e 1/10 de volume de acetato de sódio. Lavar o granulado em 70% eThanol e ressuspender em tampão TE. </li><li> Quantificar a biblioteca usando PicoGreen de acordo com as recomendações do fabricante. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-ligase-dependent+biases+in+miRNA+representation+in+deep-sequenced+small+RNA+cDNA+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries.</a> RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).</li>
<li>Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+RNA+cloning+enables+accurate+quantification+of+miRNA+expression+by+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing.</a> Genome Biology. 14 (10), 109(2013).</li>
<li>Consortium, T. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ENCODE+%28ENCyclopedia+Of+DNA+Elements%29+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) Project.</a> Science. 306 (5696), 636-640 (2004).</li>
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<li>Linsen, S. E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+and+possibilities+of+small+RNA+digital+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling.</a> Nature Methods. 6 (7), 474-476 (2009).</li>
<li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39 (21), 141(2011).</li>
<li>McLaughlin, L. W., Romaniuk, E., Romaniuk, P. J., Neilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+Acceptor+Oligoribonucleotide+Sequence+on+the+T4+RNA+Ligase+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Effect of Acceptor Oligoribonucleotide Sequence on the T4 RNA Ligase Reaction.</a> European Journal of Biochemistry. 125 (3), 639-643 (1982).</li>
<li>Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+bias+in+T4+RNA+ligase-mediated+3%E2%80%B2-adapter+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3′-adapter ligation.</a> Nucleic Acids Research. 40 (7), 54(2012).</li>
<li>Harrison, B., Zimmerman, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer-stimulated+ligation%3A+enhanced+ligation+of+oligo-+and+polynucleotides+by+T4+RNA+ligase+in+polymer+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions.</a> Nucleic Acids Research. 12 (21), 8235-8251 (1984).</li>
<li>Torchia, C., Takagi, Y., Ho, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Archaeal+RNA+ligase+is+a+homodimeric+protein+that+catalyzes+intramolecular+ligation+of+single-stranded+RNA+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Archaeal RNA ligase is a homodimeric protein that catalyzes intramolecular ligation of single-stranded RNA and DNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (19), 6218-6227 (2008).</li>
<li>Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Abundant+Class+of+Tiny+RNAs+with+Probable+Regulatory+Roles+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An Abundant Class of Tiny RNAs with Probable Regulatory Roles in Caenorhabditis elegans.</a> Science. 294 (5543), 858-862 (2001).</li>
<li>Yi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DGCR8-dependent+microRNA+biogenesis+is+essential+for+skin+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">DGCR8-dependent microRNA biogenesis is essential for skin development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 498-502 (2009).</li>
<li>Leung, A. K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+Ago2+binding+sites+from+mouse+embryonic+stem+cells+with+and+without+mature+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of Ago2 binding sites from mouse embryonic stem cells with and without mature microRNAs.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 18 (2), 237-244 (2011).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

A metodologia aqui descrita faz uso de diversas variáveis-chave para maximizar a eficiência de ligação, ou seja, altas concentrações de PEG, o uso de ligantes randomizados, e alta concentração de ligantes 2,6,9. Esta abordagem permite que bibliotecas de sequenciamento de forma confiável quantitativos a partir de amostras de RNA total de 2. Nós conduzimos várias titulações de ARN de entrada e concluíram que a metodologia anterior é o mais adequado para quantidades de ARN total na gama de 1-8 ug (dad...

Metodologias baseadas em alta capacidade de sequenciamento têm sido amplamente aplicada em muitas amostras biológicas nos últimos anos em expandir muito a nossa compreensão da complexidade molecular de sistemas biológicos 3,4. No entanto, a preparação de amostras de RNA de high-throughput seqüenciamento muitas vezes transmite preconceitos específicos inerentes à metodologia empregada, o que limita a utilidade potencial destas técnicas poderosas. Estes método específico polarizações ter sido bem documentado para preparações de biblioteca, de pequena ligadura de ARN baseado em 1,2,5,6. Estes preconceitos resultar em variação mil vezes na lê números de miRNAs sintéticos equimolares, fazendo inferência de abundância miRNA a partir de dados de sequenciamento descontroladamente variável e sujeito a erros. Os estudos focam as propriedades de ligases T4 RNA derivadas de fagos têm documentado que as enzimas exibem preferências à base de nucleótidos 7, que se manifestam como bibliotecas enviesados ​​em experiências de sequenciação de alto rendimento <saté&gt; 1,2,8. A fim de minimizar os preconceitos transmitidos por ligases RNA, várias estratégias têm sido empregadas; macromolecular aglomerando 9, randomizando a sequência de nucleótidos do adaptador que é proximal em relação ao local de ligação 6, e empregando concentrações elevadas de adaptador de ligação 2. Através de uma combinação destes três abordagens temos desenvolvido um fluxo de trabalho para a preparação isenta de bibliotecas de ARN pequenas compatíveis para a sequenciação de alto rendimento (Figura 1). Para comparações diretas entre os protocolos atuais e nosso método otimizado, por favor consulte o nosso recente relatório 2. Este método produz optimizado eficiências de ligação de mais de 95% em ambas as 3 &#39;e 5&#39; etapas e permite a ligação isenta de moléculas de ARN a partir de pequenas amostras biológicas sintéticas e 2.

<table><tbody><tr><td>3' Linker (5' fosforilado, 3' bloqueado)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>personalizado</td><td></td></tr><tr><td>5' Linker</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>personalizado</td><td>5' bloqueado, HPLC purificado</td></tr><tr><td>T4RNL2 (1-249 K227Q)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0351S</td><td>Especializado para ligação de adaptadores de DNA pré-adenilados</td></tr><tr><td>10x Ligation buffer (sem ATP)</td><td>New England Biolabs</td><td>Incluído com M0351S</td><td></td></tr><tr><td>10x Tampão de ligação (com ATP)</td><td>New England Biolabs</td><td>Incluído com M0204L</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenoglicol (mol. Wt. 8.000)</td><td>New England Biolabs</td><td>Incluído com M0204L</td><td></td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>Descobrimos que a água coletada de um aparelho de destilação é de qualidade equivalente.</td></tr><tr><td>T4RNL1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III RT kit</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kit de PCR Phusion</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Illumina RP1 primer</td> Integrated <td>DNA</td><td>Technologies</td><td>personalizado Informações de sequência disponíveis no</td></tr><tr><td>Illumina Illumina RT primer</td> Integrated <td>DNA</td> Technologies <td>personalizado</td><td>Informações de sequência disponíveis no</td></tr><tr><td>Illumina Illumina Index primer(s)</td><td></td> integrado DNA <td>Technologies personalizado</td><td>Informações de sequência disponíveis na Illumina</td></tr><tr><td>40% Acrilamida</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP14081</td><td></td></tr><tr><td>Ureia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amônio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametilenodiamina (TEMED)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>2x Tampão de carregamento de RNA desnaturante</td><td>New England Biolabs</td><td>Incluído com M0351S</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de barbear</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>SpinX Tubos Centricon</td><td>Costar</td><td>CLS8161</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microfífugas de baixa retenção</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>Sybr Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>Kit de adenilação</td><td>New England Biolabs</td><td>E2610L</td><td></td></tr></tbody></table>

ligadura altamente eficiente de pequeno rna moléculas microrna para quantificação por sequenciamento de alto rendimento

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

Mirna clonagem e sequenciamento de alto rendimento, denominada miR-Seq, assume-se como uma abordagem ampla transcriptoma quantificar miRNAs com resolução de nucleotídeo único. Esta técnica de captura miARNs, anexando os adaptadores 3 &#39;e 5&#39; de oligonucleótidos para moléculas de miARN e permite a descoberta de novo miARN. Acoplamento com plataformas de sequenciamento de próxima geração poderosos, miR-Seq tem sido fundamental para o estudo da biologia miRNA. Contudo, desvios significativos introduzidas por passos de ligação de oligonucleótidos têm impedido o miR-SEQ de ser empregado como uma ferramenta de quantificação precisa. Os estudos anteriores demonstram que polarizações em métodos de miR-Seq actuais conduzem frequentemente a quantificação imprecisa miARN com erros de até 1.000 vezes superior para algumas miARNs 1,2. Para resolver estes preconceitos, transmitidas por meio de ligação de ARN, temos desenvolvido um método de ligação de ARN pequenas que resulta em eficiências de ligação de mais de 95% tanto para 3 &#39;e 5&#39; etapas de ligação. O benchmarking este improvou método de construção da biblioteca utilizando miARNs equimolares sintéticos ou mistos diferencialmente, produz consistentemente lê números com desvio inferior a duas vezes a partir do valor esperado. Além disso, essa alta eficiência método miR-Seq permite preciso de todo o genoma miRNA perfil de in vivo total de amostras de RNA 2.

Os resultados esperados para o método anterior deve, inicialmente, ser observação de uma única troca de nucleótidos (aumento) no tamanho do oligonucleótido de ADN que foi sujeita a adenilação por Mth RNA ligase (Figura 2). Após 3 'ligadura, a visualização do gel de acrilamida indica (ver Figura 3) bandas de peso molecular elevado afiadas evidentes na região de nucleótidos 100-300 do gel. Isto indica que a amostra de ARN total a ser utilizado é de alta qualidade (não degradado)....

MicroRNAs (miRNAs) são uma classe amplamente conservada de moléculas reguladoras. Aqui descrevemos um método de clonagem de miRNA que se baseia em duas etapas de ligação potentes seguidas de sequenciamento de alto rendimento. Nosso método permite a quantificação precisa de miRNAs em todo o genoma.

Ligadura altamente eficiente de pequeno RNA moléculas microRNA para quantificação por sequenciamento de alto rendimento

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

O objetivo geral deste procedimento é preparar microRNAs de forma imparcial para sequenciamento de alto rendimento. Isso é feito primeiro preparando ou comprando oligonucleotídeos de DNA que são competentes para ligação às três extremidades principais do micro RNA. O segundo passo é ligar os três oligonucleotídeos de DNA primários às três extremidades principais do micro RNA.Em seguida, o produto de ligação é purificado em gel e o ligante de oligonucleotídeo de cinco RNA primários é ligado às cinco extremidades principais do micro RNA. A etapa final é converter as moléculas híbridas em CDNA e, em seguida, amplificar o CDNA por reação em cadeia da polimerase. Em última análise, a clonagem de microRNA e o sequenciamento de alto rendimento são usados para mostrar o perfil amplo do transcriptoma de microRNAs de maneira quantitativa na resolução de nucleotídeos individuais.A principal vantagem de nossa técnica sobre as técnicas existentes, como micro sequenciamento de microray qPCR blot, é que nossa técnica reflete mais o nível real de microray em uma ampla escala de laboratório de transcrição em uma resolução de nucleotídeo único. Embora esse método possa fornecer informações sobre a biologia do microRNA, ele também pode ser aplicado a outras tecnologias de sequenciamento de alto rendimento, como clipe HC e RNA-Seq. Os oligonucleotídeos de DNA para este procedimento são projetados para três reações de ligação primária e devem ter um grupo fosfato de cinco primos, um dinucleotídeo randomizado na extremidade de cinco primos e uma citosina de três primos diluindo os oligonucleotídeos de DNA a 100 micromolares em água livre de nuclease.Monte a reação de ventilação combinando esses agentes reagentes 200 pico moles dos três oligonucleotídeos ligantes primos, quatro microlitros de cinco tampão de ventilação DNAA primário, quatro microlitros de um TP, quatro microlitros de M-T-H-R-N-A, água livre de ligase e nuclease para um volume final de 40 microlitros. Incube a reação a 65 graus Celsius por uma hora. Termine a reação aquecendo a 85 graus Celsius por cinco minutos.Precipite o ligante TED adicionando 2,5 volumes de etanol a 100% e um terço do volume de acetato de amônio 10 molar. Para remover um TP residual e evitar ligações imprevistas em reações futuras, misture a solução de álcool, sal e oligonucleotídeos até homogeneizar girando a velocidade máxima em uma microcentrífuga a quatro graus Celsius por 20 minutos. Lave o pellet em etanol a 70% ao ar seco e ressuspenda o pellet no volume apropriado de água livre de nuclease para produzir 50 a 100 micromolares de um oligonucleotídeo ventilado.Confirme a ventilação do oligonucleotídeo por eletroforese em um gel de poliacrilamida a 18%. Pré-execute o gel por 30 minutos a 24 volts centímetro de largura do gel com um buffer de execução XTBE à temperatura ambiente. Quando os 30 minutos terminarem, lave os poços com buffer de corrida.Os oligonucleotídeos de DNA para este procedimento são projetados para três reações de ligação primária e devem ter um grupo fosfato de cinco primos, um dinucleotídeo randomizado na extremidade de cinco primos e uma ocitocina de três primos. Diluir os oligonucleotídeos de DNA a 100 micromolares em água livre de nuclease. Execute o gel a 24 volts por centímetro até que o azul de bromo fenol esteja a três quartos do caminho até o fundo do pino de gel.Pinte o gel com uma solução de ouro cibernético em um XTBE e visualize em uma caixa de transluminador UV. Deve haver uma única mudança de nucleotídeo no tamanho do oligonucleotídeo de DNA que foi submetido a uma ventilação por M-T-H-R-N-A ligase para a reação de ligação de três primos. Monte os seguintes componentes no gelo nesta ordem.Um microlitro de 50% PEG 8, 000 0,5 microlitros de tampão ligase 10 XRNA. Um microlitro de um ligante ventilado de três primos, 0,5 microlitros de inibidor de RNAs, 0,5 a oito microgramas de RNA total, 0,5 microlitros de T, quatro RNA, Ligase, dois e água livre de nuclease até um volume final de cinco microlitros. Misture a reação pipetando uma vez bem misturada.Coloque a reação em um termociclador com tampa aquecida. Defina o bloco para 16 graus Celsius e incube por quatro horas. Observe que a reação pode ser dimensionada até um volume final de 20 microlitros sem qualquer perda na eficiência da ligadura.Após a ligação de três primos, misture a reação com um volume igual de dois XRNA carregando o calor do tampão a 70 graus Celsius por cinco minutos e deixe esfriar no gelo. Próximo gel. Purifique a amostra em um gel de poliacrilamida a 15%.Pré-execute o gel a 24 volts centímetro de largura do gel por pelo menos 30 minutos. Desligue a fonte de alimentação e lave os poços com buffer de corrida. Carregue a amostra e execute o gel na mesma voltagem da pré-corrida até que o bromo fenol tenha acabado de sair do gel.O produto desejado migrará para perto do ciano xileno quando a eletroforese em gel de poliacrilamida estiver completa. Coloque o gel em uma bandeja limpa com um x tampão de corrida e um x cyber gold e balance por 15 minutos. Remova o gel da placa de coloração e visualize em uma caixa de transluminador UV coberta com filme plástico limpo.O produto de ligação deve ter cerca de 45 nucleotídeos de comprimento. Como esse produto de ligação geralmente não é visível, é importante incluir uma amostra de RNA sintético de controle positivo na faixa adjacente usando uma lâmina de barbear limpa, a região que contém o produto de ligação. Guiado pelas posições da amostra de RNA sintético e pelos padrões de tamanho.Colocar o fragmento de gel de consumo num tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitros. Perfure a parte inferior do tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro com uma agulha de calibre 30 e coloque o tubo de perfuração em uma segunda centrífuga de tubo de microcentrífuga limpa de baixa retenção, de 1,5 mililitro por cinco minutos a cerca de 15.000 vezes. G. Confirme visualmente se toda a fatia de gel se moveu através do orifício no tubo interno.Se necessário, use uma ponta de pipeta limpa para empurrar alguns fragmentos de gel para mais perto do orifício. Descarte o tubo vazio de 0,5 mililitro e adicione 400 microlitros de tampão de coluna de alto teor de sal à pasta de acrilamida. Balance o tubo a quatro graus Celsius durante a noite no dia seguinte.Transfira a pasta para uma coluna de rotação de acetato de celulose de 0,22 mícron usando uma centrífuga de ponta de pipeta de diâmetro largo por três minutos à temperatura ambiente em cerca de 15.000 vezes. G para coletar todo o líquido da matriz de gel de acrilamida. Transfira o líquido para um tubo limpo de baixa retenção de 1,5 mililitro contendo um microlitro de uma solução de glicogênio de 20 miligramas por mililitro.Adicione um volume igual de isopropanol e um décimo volume de acetato de sódio e misture a solução invertendo o tubo várias vezes. Precipite em um freezer de 80 graus Celsius negativos por 20 minutos. Centrifugue em velocidade máxima a quatro graus Celsius por 20 minutos.Para pellet o ácido nucléico, remova o snat e lave em ar com etanol a 70%. Seque o pellet por 10 minutos em temperatura ambiente e prossiga diretamente para a etapa de ligação de cinco primos. Para iniciar este procedimento, adicione os seguintes componentes ao ácido nucleico peletizado anteriormente, dois microlitros de PEG 8.000, 0,5 microlitros de tampão RNA Ligase, 0,5 microlitros de TP, 0,5 microlitros de ligante, oligonucleotídeo de RNA e água para um volume final de quatro microlitros.Misturar esta amostra pipetando repetidamente para cima e para baixo durante um período máximo de cinco minutos, para garantir que o pellet foi completamente resolubilizado. Assim que o pellet estiver em solução, transfira o conteúdo para um tubo de PCR limpo contendo um microlitro de uma mistura um-para-um de inibidor de RNAs e T quatro RNA ligase um misturado por pipetagem para cima e para baixo. Incube a reação em um termociclador a 37 graus Celsius por quatro horas.Quando a reação estiver completa, prossiga imediatamente para a síntese de CD NA conforme descrito no texto do protocolo após a ligação do ligante aos três primos do RNA e a análise de página das reações. Bandas nítidas de alto peso molecular são evidentes na região de 100 a 300 nucleotídeos do gel, o que indica que a amostra total de RNA usada é de alta qualidade. O sinal muito brilhante na região de 25 nucleotídeos do gel é o excesso de RNA sintético de três ligantes primos não ligados, indicando uma ligação realizada com cinco picomoles de micro RNA sintético e um ligante de três primos, que foi purificado em gel.Aqui é mostrado um auto radiograma de três reações de ligação primária realizadas com P 32 5 prime e micro RNA sintético marcado. O número de horas que a reação foi autorizada a prosseguir é indicado na parte superior, e os números na parte inferior indicam os valores ligados como uma porcentagem da soma de não ligados e ligados. Este auto radiograma é de cinco reações de ligação primária realizadas com P 32 5 micro RNA sintético marcado com extremidade primária três híbridos de ligante primo.Os números na parte inferior indicam as quantidades ligadas como uma porcentagem da soma de não ligado e ligado e revelam a importância de usar uma alta concentração de PEG 8.000 pequenos R-N-A-D-N-A. Bibliotecas compatíveis para sequenciamento de alto rendimento são geradas posteriormente por PCR. O número adequado de ciclos de PCR é determinado empiricamente.Neste exemplo, o tamanho do produto de DNA esperado é de 146 pares de bases Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada corretamente em apenas dois dias. Ao realizar esta técnica, é importante lembrar de manter todas as pontas e tubos livres de RNAs.

highly-efficient-ligation-small-rna-molecules-for-microrna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui nós descrevemos um otimizado multiplex da transcriptase reversa PCR quantitativo protocolo (qRT-PCR) em combinação com uma plataforma microfluídica como ferramenta de triagem de custo e tempo efetivo de alto rendimento para microRNA (miRNA) níveis de expressão, especialmente quando se trabalha com quantidades limitadas de amostra.

Profiling MicroRNA de Alto Rendimento: Multiplex Optimized qRT-PCR em Escala nanolitros no IFCS Fluidigm dinâmico ArrayTM

Nós descrevemos um protocolo de PCR em tempo real para o perfil de microRNAs no líquido cefalorraquidiano (LCR). Com a excepção dos protocolos de extracção de ARN, o procedimento pode ser estendido para o RNA extraído a partir de outros fluidos do corpo, as células cultivadas, ou amostras de tecido.

Líquido cefalorraquidiano MicroRNA perfil usando Quantitative PCR em Tempo Real

MicroRNAs circulam surgiram recentemente como biomarcadores promissoras e inovadoras para vários tipos de câncer e outras doenças. O objetivo deste artigo é discutir três diferentes plataformas baseadas em sonda de PCR em tempo real e métodos que estão disponíveis para quantificar e determinar a abundância de microRNAs em circulação.

Baseado-Probe-PCR em tempo real Abordagens para a medição quantitativa de microRNAs

O objetivo deste protocolo é usar a microdissecção por captura a laser como um método eficaz para isolar populações puras de tipos de células de tecidos heterogêneos da próstata para análise de RNA a jusante.

Captura de Laser Microdissection de Próstata Humano Epithelium para Análise de RNA

Aqui, descrevemos uma estratégia passo a passo para isolar pequenas RNAs, enriquecedora para microRNAs e preparando amostras para sequenciamento de alta taxa de transferência. Em seguida, descrevemos como processar leituras de sequência e alinhá-las ao microRNAs, usando ferramentas de código aberto.

Um pipeline completo para isolar e sequenciar MicroRNAs e analisá-los usando ferramentas de código aberto

Nós apresentamos um protocolo pequeno detalhado da reparação da biblioteca do RNA com menos viés do que métodos padrão e uma sensibilidade aumentada para 2 '-O-methyl RNAs. Este protocolo pode ser seguido usando reagentes caseiros para economizar custos ou usar kits para conveniência.

Melhorando O RNA-Seq pequeno: menos polarização e melhor deteção de 2 '-O-methyl RNAs

Este método demonstra o uso da técnica de hibridização do norte para detectar miRNAs a partir do extrato total de RNA.

Análise de blot de RNA para detecção e quantificação de MicroRNAs vegetais

O sequenciamento de RNA de quantificação absoluta (AQRNA-seq) é uma tecnologia desenvolvida para quantificar a paisagem de todos os pequenos RNAs em misturas biológicas. Aqui, as etapas de preparação da biblioteca e processamento de dados do AQRNA-seq são demonstradas, quantificando as mudanças no pool de RNA de transferência (tRNA) em Mycobacterium bovis BCG durante a dormência induzida por fome.

AQRNA-seq para quantificar RNAs pequenos

O protocolo descreve um ensaio de hibridização de imunofluorescência em tandem com tecido embebido em parafina fixado em formalina para detectar e quantificar microRNA e proteínas multiplexadas simultaneamente.

Amplificação e reconhecimento de microRNA por meio de hibridização in situ de ácido nucleico bloqueado como um novo método de detecção e quantificação

Este método descreve a síntese in vitro com alto rendimento de RNA mensageiro (mRNA) tanto com capuz quanto sem capuz, a partir de um plasmídeo linearizado contendo o gene da luciferase de Gaussia (GLuc). O RNA é purificado e uma fração do RNA sem capuz é cappingada enzimaticamente utilizando a enzima de capping do vírus Vaccinia. Na etapa final, o mRNA é transfetado em células HeLa e os sobrenadantes do cultivo celular são analisados quanto à atividade da luciferase.

Transcrição in vitro e nivelamento de Gaussia mRNA luciferase Seguido por HeLa transfecção celular

Aprenda a clonar microRNAs com alta eficiência usando ligadura de oligonucleotídeos e sequenciamento de alto rendimento. Este método permite quantificação genômica precisa para estudos de regulação gênica.

Ligadura altamente eficiente de pequeno RNA moléculas microRNA para quantificação por sequenciamento de alto rendimento

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