Otimizando Penhora de mesenquimais humanas Células-Tronco em Poly (ε-caprolactona) electrospun Yarns

Neste procedimento, os andaimes PCL eletrofiados são configurados de maneiras diferentes para determinar uma configuração ideal de semeadura celular. Primeiro, os andaimes estéreis são colocados nas diferentes configurações que estão sendo investigadas, incluindo inserções de cultura de células, calhas e vasos rotativos de biorreatores. Uma vez no lugar, um número conhecido de células é semeado no andaime e depois deixado sem perturbação por 20 minutos.

Em seguida, todas as amostras são cuidadosamente movidas para uma incubadora, configuradas com 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius e submetidas a condições estáticas ou dinâmicas antes do expediente. Após esse tempo de cultivo, o número de células que se ligaram ao andaime é determinado por um ensaio de DNA para quantificar a quantidade de células no meio do andaime e nas frações do poço. Em última análise, isso é conseguido quantificando o DNA presente no andaime, no poço e no meio circundante para visualizar a ligação das células aos andaimes, microscopia eletrônica de varredura ou SEM é usada.

Tivemos a ideia para esta investigação pela primeira vez quando soubemos que nossos andaimes não cobriam toda a base da placa do poço, o que significava a possibilidade de que nem todas as células estivessem em contato com o andaime e, portanto, capazes de se fixar. Para começar, configure as inserções de cultura de células sob o fluxo da lâmina, abrindo as inserções estéreis de cultura de células de seis poços e separando os anéis mais curtos com dentes dos corpos com anéis mais largos. Em seguida, pegue o anel com os dentes apontando para cima e coloque um dos andaimes de quatro centímetros sobre o centro do anel, certificando-se de que ele se sobreponha em ambos os lados.

Pegue o corpo anelado e posicione-o sobre o anel do dente e o andaime. Em seguida, empurre para baixo, certificando-se de que o andaime permaneça na posição e fique no centro da cultura de células. Inserir. Coloque o inserto de cultura de células com andaime no poço de uma placa de baixa ligação de seis poços e adicione 10 mililitros de meio de cultura ao andaime.

Em seguida, coloque as calhas de politetrafluoretileno em placas de Petri individuais e adicione 10 mililitros de meios de cultura à calha. Usando uma pinça, coloque um dos andaimes de três centímetros na calha, certificando-se de que seu comprimento esteja paralelo à borda mais longa da calha. Para configurar o vaso do biorreator sob fluxo de lâmina, dispense 10 mililitros de solução salina tamponada com fosfato estéril ou PBS através da porta principal do vaso do biorreator.

Após 10 minutos, remova o PBS e substitua por oito mililitros de meios de cultura usando uma pinça. Insira um dos andaimes de três centímetros na embarcação através da porta principal. Em seguida, posicione fora da porta principal.

Depois de realizar a contagem de células-tronco mesenquimais humanas conforme descrito no protocolo de texto, aspire o meio do tubo de centrífuga deixando o pellet celular e substitua pelo volume de meio calculado. Resus suspende as células e o meio para uma mistura uniforme. Usando uma pipeta P 200 Gilson, distribua lentamente 200 microlitros de suspensão de células em cada andaime, passando a ponta da pipeta ao longo do comprimento do andaime e abaixo da superfície do líquido do meio.

Deixe sem perturbação por 20 minutos, ou os vasos do biorreator dispensaram 200 microlitros da suspensão celular pela porta principal. Complete os dois mililitros restantes de meios de cultura pelas portas da seringa para obter um volume total de 10 mililitros. Em seguida, transfira os vasos do biorreator para o biorreator do vaso rotativo e defina para girar.

A nove RPM, transfira as placas de poço com inserções e calhas de cultura de células para a placa agitadora e defina para girar a 30 RPM em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius, 5% ou cultura estática. Transfira as placas de poço com as inserções e calhas de cultura de células para a prateleira de uma incubadora de cultura de células. Fixado em 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Após quatro horas, retirar as amostras da incubadora e colocá-las sob fluxo de lâminas. Em seguida, remova as frações de mídia de todas as amostras e coloque em tubos de centrífuga rotulados separadamente. Após centrifugação por cinco minutos a 241 vezes G, remova o supinato antes de adicionar três mililitros de vórtice tampão de lise, a solução para quebrar o pellet celular que os andaimes mantinham dentro das inserções de cultura de células Primeiro, libere o andaime cortando-o próximo à borda das pastilhas usando um andaime.

Em seguida, usando uma pinça, remova os andaimes e coloque em tubos de centrífuga contendo três mililitros de tampão de lise. Em seguida, adicione três mililitros de tampão de lise a cada receptáculo de andaime e raspe a superfície. Remova o tampão de lise e coloque em tubos de centrífuga rotulados separadamente.

Agitar cada tubo de centrifugação durante cerca de um minuto para assegurar uma agitação suficiente e estimular a lise da membrana celular. Em uma placa preta de 96 poços, adicione 100 microlitros de tampão de lise para cada meio de andaime de fração de amostra e, em seguida, no escuro, adicione 100 microlitros de solução de DNA celular a todos os poços contendo tampão de lise e misture. Inclua suavemente os poços com tampão de lise sem DNA e solução de DNA celular para fornecer um controle negativo e positivo para a placa do poço.

Usando um leitor de placa de fluorescência, meça a absorbância dos poços com excitação de 485 nanômetros e emissão de 520 nanômetros. Compare os dados com a curva padrão gerada a partir dos padrões de DNA de acordo com as instruções do fabricante para realizar a fixação de MEV. Após quatro horas de incubação, remova todos os andaimes de seus recipientes e coloque dentro de poços separados de uma nova placa de seis poços e um fluxo de lâmina.

Em seguida, lave os andaimes duas vezes com PBS para cada um. Bem, adicione dois mililitros de 1,5% de glutaraldeído em PBS para garantir uma cobertura completa no andaime. Deixe a placa por no mínimo 30 minutos a quatro graus Celsius para fixação de células.

Remova a solução fixadora e lave os andaimes duas vezes com PBS. Em seguida, transfira os andaimes para uma nova placa de poço para desidratá-los com concentrações crescentes de etanol em água destilada, começando com 50% de etanol seguido de 70% e depois 90% para cada concentração. Mergulhe completamente os andaimes na solução e deixe por três minutos antes de descartar a solução e repetir.

Uma vez desidratados os andaimes em 100% de etanol, submergindo totalmente os andaimes em solução e deixando por cinco minutos, descarte a solução e repita quimicamente os andaimes. Usando HMDS dentro de uma hotte. Mergulhe os andaimes no HMDS e deixe por cinco minutos antes de remover o HMDS após repetir uma vez.

Remova o HMDS e deixe os andaimes secarem. Em seguida, monte os andaimes em stubs de SEM disponíveis comercialmente para facilitar a visualização dentro da camada de SEM, as amostras com uma camada de manchas douradas por dois minutos para garantir uma cobertura fina e uniforme. Finalmente, coloque as amostras dentro do SEM e visualize os andaimes assentados nas células usando um feixe de elétrons de cinco quilos.

Os resultados destacam a localização das células após quatro horas após a semeadura para cada configuração experimental investigada. Esta figura demonstra a porcentagem de células que se fixaram à superfície do andaime durante esse período em que todas as configurações de semeadura foram investigadas. A porcentagem de fixação celular é relativamente baixa, mas a maior aderência celular para andaimes mantidos dentro de inserções de cultura de células e agitados a 30 RPM.

A menor aderência foi para os andaimes mantidos dentro das inserções de cultura de células e mantidos em condições estáticas. Um grande número de células estava presente na fração média, principalmente para cultura de células. Inserções mantidas dentro de placas de baixa ligação a 50% e vasos rotativos a 51% Os andaimes mantidos dentro das calhas demonstraram um número elevado de células presentes no próprio suporte.

48% para agitador de calha e 50% para varredura estática de calha. A eletromicroscopia permitiu uma avaliação visual dos scaffolds semeados por células. Imagens representativas destacaram uma presença limitada de células na superfície fibrosa, independentemente da configuração de semeadura.

No entanto, um número maior de células e aglomerados celulares estava presente nos andaimes mantidos dentro das inserções de cultura de células e agitados a 30 RP M. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de que semear um número conhecido de células não equivale necessariamente a tantas células realmente ligadas ao andaime, especialmente para andaimes que não cobrem toda a base das placas selvagens. Para scaffolds como esses, recomenda-se que diferentes configurações de semeadura de células sejam primeiro otimizadas para maximizar a fixação inicial da célula ao scaffold.