Name: Otimizando Penhora de mesenquimais humanas Células-Tronco em Poly (ε-caprolactona) electrospun Yarns (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Aprenda a otimizar a adesão inicial de células-tronco mesenquimais humanas em fios de PCL electrospun. Este método compara condições estáticas e dinâmicas para engenharia de tecidos.

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Os autores gostariam de agradecer e reconhecer o Conselho de Pesquisa Médica para o financiamento desta pesquisa - MRC-FAP código concessão G1000788-98812.

Fabrication 1.Scaffold e Esterilização <ol><li> Dissolve-PCL em 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol para dar um 10% w concentração / v. Tal como descrito em Bosworth et al, 9 electrospin solução polimérica (parâmetros: 20 kV, 1 ml / h, 20 cm). E recolher fibras alinhadas na extremidade de um mandril rotativo (600 rpm). Com um bisturi remover a fita de fibra recolhido e, em seguida, cortado em comprimentos mais curtos - 3 cm (para calhas e vasos rotativos) e 4 cm (para inserções de cultura de células) comprimentos. </li><li> Usando fórceps finos submergir tiras individuais em água destilada e remover. </li><li> Segurando as duas extremidades entre o polegar eo indicador; torcer manualmente a banda até que se assemelha a discussão. </li><li> Resumidamente submergir este andaime do tipo fio em água destilada e colocar no cartão limpo, não fibrosas para secar. </li><li> Depois de seco, realiza individualmente em tubos de microcentrífuga limpo e adicionar 1 ml de 50% v / v de etanol em água destilada. Fechar as tampas e deixe por 24 hr. Nota: Execute as seguintes etapas em fluxo laminar: </li><li> Colocar em tubos de microcentrífuga de uma câmara de fluxo laminar e aspirar a solução de v / v de 50%. Substituir com 1 ml de 70% v / v de etanol em água destilada, tampas de fechar e deixar durante 24 horas. </li><li> Repetir para 90% e 100% v / v de etanol em água destilada (1 ml de volume). </li><li> Lavar andaimes duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS), 24 h por lavagem (2 x 1 ml). </li><li> Remover PBS e substitua com 1 ml de meio de cultura de células. Nota: Os andaimes estão prontos para uso pós-24 hr. </li></ol> 2. Determinar Area Andaime superfície e número de células <ol><li> Usando um microscópio de luz e o software de imagem, medir o diâmetro do fio electrospun ao longo do seu comprimento para determinar um valor significativo. </li><li> Assuma que o fio de ser uma haste cilíndrica e aproximar a área de superfície utilizando: </li><li> Onde A = área de superfície, r = raio e h = comprimento Nota: A área de superfície foi calculada como sendo de 18.902, 800 mm 2. Além disso, deve notar-se que a área de superfície real será superior a este cálculo, o fio é composto por centenas de fibras finas, o que irá aumentar a área de superfície. Consequentemente, um número maior de células deve ser capaz de anexar ao cadafalso. No entanto, isto não afecta a uma comparação directa entre os grupos de teste a ser feito. </li><li> Determine o número máximo de células que poderia anexar à superfície andaime expostos por: Nota: Usando um microscópio de luz e o software de imagem, o diâmetro de células estaminais mesenquimais humanas foi determinada como sendo de 20 um (assumindo que as células são redondas), portanto, neste caso, o número de células = 60.200. </li></ol> 3. Andaime Set-up - Cultura Celular inserções (Figura 1A) <ol><li> Sob fluxo laminar, aberto estéreis as inserções de 6 poços de cultura de células e separar os anéis com dentes mais curtos a partir dos corpos em anel mais largo. </li><li> Pegue o anel com dentes apontando para cima. Armar umados quatro centímetros andaimes sobre o centro do anel de ter certeza que ele se sobrepõe em ambos os lados. Tirar o corpo e a posição dos anéis sobre o anel dentado e andaime e empurrar para baixo para garantir que o andaime fica em posição e encontra-se através do centro da inserção de cultura de célula. </li><li> Coloque a inserção de cultura de células com o andaime no poço de um de 6 poços, baixo placa de ligação. </li><li> Adicionar 10 ml de meio de cultura para o andaime. </li></ol> 4. Andaime Set-up - Trough (Figura 1B) <ol><li> Sob fluxo laminar, local de poli (tetrafluoroetileno) (PTFE) calhas individuais em placas de petri e adicionam-se 10 ml de meio de cultura para a calha. </li><li> Usando fórceps armar um dos três centímetros andaimes para a calha, assegurando-se o seu comprimento situa-se paralelamente ao longo da calha de borda. </li></ol> 5. Andaime Set-up - Bioreactor Vessel (Figura 1C) <ol><li> Sob fluxo laminar, dispensar 10 ml de PBS estéril através do bioreactor de navioprincipal porto e deixe por 10 min. </li><li> Retire a PBS e substituir com 8 ml meios de cultura. </li><li> Usando pinças, inserir um dos suportes 3 centímetros para dentro do recipiente através da porta principal. </li><li> Fechar a porta principal. </li></ol> Contando 6. celular <ol><li> As células estaminais mesenquimais humanas de cultura (hMSC) derivadas de medula óssea de acordo com o protocolo do fabricante até 4 passagens, antes da colheita. </li><li> Aspirar a mídia a partir de um 75 centímetros 2 frasco contendo hMSCs derivadas da medula óssea (passagem 4, 80% de confluência). </li><li> Lavam-se as células com 10 ml de PBS estéril e aspirado. </li><li> Adicionar 3 ml de tripsina e incubar o balão a 37 ° C, 5% de CO2 até as células terem desalojado da superfície do frasco. </li><li> Adicionar 7 ml de meio de cultura para inactivar a enzima e transferir esse volume total (10 ml) para um tubo de centrífuga. </li><li> Ressuspender desta suspensão de células por pipetagem para cima e para baixo várias vezes para dispersar de forma homogénea no interior da célulasmeios de comunicação e aglomerados celulares limite (10 ml de pipeta). </li><li> Remover 20 pi de suspensão de células e transferir para um hemocitómetro. </li><li> Coloque o hemocitï¿½etro sob um microscópio e imagem luz no objetivo x10. </li><li> Concentre-se as linhas de grade e contar o número de células nos 4 x 4 quadrados em cada canto da rede e que se inserem no quadrado e aqueles que atravessam a mão direita ou linha de limite inferior. Contagem para cada conjunto de 4 x 4 quadrados (quatro contagens por grade). </li><li> Repita a ressuspensão e celular contagem três vezes (passos 6,6-6,9). </li><li> Calcula-se a média da contagem de células e determinação do volume de material necessário para a ressuspensão de células (concentração de células 60.200 em 200 ul). Por exemplo, determinar a contagem média de células do hemacitómetro e depois determinar o número médio total de células a partir dos três contagens separadas. Multiplicar este por 1 x 10 4 para indicar o número de células por ml e, em seguida, multiplica-se por o volume total de suspensão de células para dar anúmero tal de células. Utilize a seguinte equação para determinar o volume de mídia necessária para a ressuspensão: </li><li> Centrifuga-se a suspensão de células a 241 xg durante 5 min. </li></ol> Sementeira 7. celular <ol><li> Aspirar a mídia do tubo centrifugado deixando o pellet celular e substituir com o volume de mídia calculado. </li><li> Ressuspender as células e os media para uma misturar mesmo. </li><li> Usando uma pipeta Gilson P200, dispensar lentamente 200 ul de suspensão celular em cada andaime rodando a ponta da pipeta ao longo do comprimento do andaime e abaixo da superfície do líquido de suporte. Deixe em repouso por 20 min. </li><li> Para as embarcações de biorreatores, dispensar 200 mL de suspensão de células através da porta principal. Parte-se do meio de cultura de 2 ml remanescente através das portas de seringa para dar um volume total de 10 ml. </li></ol> 8. Experimental Iniciar <ol><li> Transfira os vasos de biorreatores para o biorreator RCCS-4DQ e definir a rodar a 9 rpm. </li><li> TransFer as placas bem com inserções de cultura de células e os cavados para o agitador de placas, e por rodar a 30 rpm. </li><li> Transferem-se as placas bem com inserções de cultura de células e as calhas para a prateleira de uma célula incubadora fixada em 37 ° C, 5% de CO 2 (cultura estática). </li></ol> 9. DNA Assay <ol><li> Preparar soluções - tampão de lise, 1x tampão TE, padrões de ADN e de solução de trabalho DNA celular - conforme as instruções do fabricante. </li><li> Após 4 horas, remover as amostras da incubadora e colocar sob fluxo laminar. </li><li> Retire as frações de mídia de todas as amostras e coloque em tubos de centrífuga marcados separadamente. Centrifugar os tubos 241 xg. Remover o sobrenadante e adicionar 3 ml de tampão de lise. Ressuspender a solução para quebrar-se o sedimento de células. </li><li> Utilizando uma pinça remover os andaimes e coloque em tubos de centrífuga contendo 3 ml de tampão de lise (para os andaimes no interior dos vasos de biorreatores, remova o andaime antes de aspirar o media). Para andaimes realizadas na inserções de cultura de células, em primeiro lugar libertar o andaime cortando o andaime perto da borda da inserção usando um bisturi. </li><li> Adicionar 3 ml de tampão de lise a cada recipiente de andaime e raspe a superfície (vigorosamente para agitar os recipientes reactores biológicos). Remover o tampão de lise e colocar em tubos de centrífuga rotulado separadamente. </li><li> Vortex de cada tubo de centrifugação durante cerca de 1 min para assegurar a agitação suficiente das células e o tampão e para estimular a lise da membrana celular. </li><li> Em um preto placa de 96 poços, adicione 100 ml de tampão de lise para cada fração amostral - andaime, mídia e bem (duplicar). </li><li> No escuro, adicionar 100 uL de solução de ADN celular de todos os poços contendo tampão de lise, e misturar suavemente. </li><li> Incluem os poços com tampão de lise contendo nenhuma solução de ADN e ADN de células para proporcionar um controlo negativa e positiva para o poço de placa. </li><li> Utilizando um leitor de placas de fluorescência, mede-se a absorvância do poços usando excitação a 485 nm e 520 nm de emissão. </li><li> Comparar os dados com a curva padrão gerada a partir dos padrões de ADN conforme as instruções do fabricante. </li></ol> 10. Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) Fixação <ol><li> Execute as seguintes etapas sob fluxo laminar: Após 4 horas, remover todos os scaffolds de seus recipientes e lugar dentro de uma nova placa de 6 poços (poços separados). </li><li> Lavar os andaimes duas vezes com PBS. </li><li> Execute as seguintes etapas no banco aberto: Para cada poço, adicione 2 ml de 1,5% v / v em PBS para garantir a cobertura completa do andaime. </li><li> Deixar a placa para um mínimo de 30 min a 4 ° C durante a fixação das células. </li><li> Remover a solução fixadora e lavam os andaimes duas vezes com PBS. </li><li> Desidratar os andaimes com concentrações crescentes de etanol em água destilada começando com 50% v / v, seguido por 70% v / v e 90% v / v. Para cada concentração, mergulhe totalmente os andaimes em solution (2 ml) e deixar durante 3 min. Descartar a solução e repita. </li><li> Desidratar em etanol a 100% por submergir completamente os suportes na solução (2 ml) e deixando durante 5 min. Descartar a solução e repita. </li><li> Quimicamente secar os scaffolds usando hexametildisilazano (HMDS) dentro de um exaustor. Mergulhe os andaimes em HMDS (2 ml) e deixe por 5 min. Retire os HMDS e repita. </li><li> Remover os HMDS e permitir que os andaimes para secar. Monte os andaimes sobre tocos SEM comercialmente disponíveis (neste caso topos de aço inoxidável com abas adesivas de carbono). </li><li> Para facilitar a visualização dentro do SEM, revestem-se as amostras usando um aplicador de ouro por borrifamento de 2 min para garantir uma cobertura fina e uniforme. </li><li> Colocar as amostras dentro do SEM e visualizar os scaffolds de células-semeado usando um feixe de elétrons 5 KeV. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Matrizes de fibra electrospun fabricados a partir de biopolímeros são regularmente utilizados para apoiar a fixação das células e proliferação de biomateriais e / ou aplicações de engenharia de tecidos 11,12. Nestes casos, as matrizes são muitas vezes folhas finas de fibras que facilmente cobrir toda a base de uma placa de cultura de células e, assim, estão em contacto total com células semeadas que melhora a fixação das células. No entanto, se o cadafalso biomaterial não cobrir totalmente a base da placa bem, há uma grande chance de que uma grande proporção das células semeadas não vai ficar em contato com o cadafalso e, finalmente, não será capaz de anexar. Este estudo investigou vários métodos diferentes para a sementeira de células para andaimes que não cobrem a base da placa com cavidades, a fim de determinar uma técnica optimizada que pode ser recomendado para experiências futuras baseados em células. Cinco diferentes set-ups foram investigados (Figura 1): ScaffoLDS (fio electrospun), realizada utilizando inserções de cultura de células dentro de placas de baixo bem ligação e ou mantidos sob condições estáticas ou agitado em 30 rpm; andaimes colocados dentro calhas PTFE estreitas e detidos estática ou abaladas em 30 rpm; e andaimes alojado dentro de vasos de biorreatores rotativas às 9 rpm. Determinar o número de células que tinham aderido aos fios electrospun por ensaio DNA demonstrou um baixo percentual de fixação para todos os semeando set-ups (Figura 2); e isto foi confirmado a partir de micrografias de varredura por electrões (SEM) (Figura 3). Fixação das células maior - 30% ou ~ 18.060 células -foi observado para os fios que foram realizadas dentro de inserções de cultura de células e sujeitos a movimento contínuo. Curiosamente, menor a fixação das células (15%) foi obtida para os fios mantidos por inserções de cultura de células, mas mantidos sob condições estáticas, o que sugere que a inclusão de movimento radial tem um efeito positivo sobre a manter as células em contacto com o andaime. No entanto,deve notar-se que circulando contínua de fluxo dos meios de comunicação pode ser responsável por aglomerados de células observadas a partir das imagens de SEM. O agitador de placas foi definido em sua configuração mais baixa - 30 rpm - o que poderia ser uma limitação para este set-up. Usando um movimento radial mais lenta pode ajudar a prevenir ou reduzir a aglomeração de células e também pode melhorar a fixação das células como células experimentará menos força. Experimentos futuros devem se concentrar em otimizar a velocidade do agitador ideal para uma melhor fixação das células. Incorporando movimento para fios realizadas dentro das calhas não resultou em uma tendência semelhante, com ambos os cenários produzindo 18% de fixação (~ 10.836 células); embora isto possa ser devido à flutuação parcial dos andaimes no interior das calhas (observada durante calhas colocadas no agitador de placas) por não terem sido ancoradas à base. Flutuante parcial do andaime vai impedir quaisquer células que se afundaram para o fundo da calha a partir de terem entrado em contacto com o material e aderente. Para tseu especial set-up, o cocho foi alojado dentro de um prato de petri e um volume total de 10 ml de media acrescentou. As pequenas dimensões da calha significa que a maior parte dos meios de comunicação está presente no interior da placa de petri e se houver qualquer movimento, as células podem afastar-se a partir da calha para a placa de petri e permanecer completamente fora do alcance do andaime. Para superar estas limitações, as experiências devem incluir um passo extra no protocolo, através do qual as extremidades dos andaimes são fixadas à base das calhas utilizando agulhas estéreis-finas, como este deve evitar a sua flutuação e movimento (particularmente para andaimes expostos a movimento radial), o que, em última análise deve levar a um aumento do número de células inerentes ao cadafalso. 16% de células tinham ligado aos fios presentes no interior dos vasos rotativos. Apesar de ser uma técnica bem estabelecida para a cultura 3D, os problemas que surgem com a remoção de andaimes do porto principal dos vasos, o que pode ter resultado em ATTAC vagamentecélulas HED sendo perdida. Os navios que pode ser totalmente aberto eliminaria este problema; estes estão disponíveis para aquisição, mas são consideravelmente mais caros do que os recipientes descartáveis ​​utilizados neste estudo. Este estudo demonstra os problemas atuais com a semeadura andaimes que não cobrem toda a base de placas de cultura de células normais. Semeando um número de celular conhecido resultou em menos de um terço de fixação para o cadafalso, apesar de a área de superfície do andaime permitindo a todas as células para aderir. Isto pode ter consequências prejudiciais em outros ensaios baseados em células, que pode avaliar o comportamento biocompatibilidade e célula-célula-célula de material / e interacções com a escora, tal como um potencial futuro dispositivo médico. As limitações do estudo podem incluir o ponto de momento de 4 h - apesar de ser suficientemente longo para garantir a sementeira inicial de células (células foram mostrados para prender firmemente a substratos dentro de trinta minutos 13,14,15), pode ser razoável emterrogam posteriores pontos temporais fornecimento de células não proliferam durante um espaço de tempo mais longo como este, de outra forma distorcer o número de células de partida. A redução do volume do meio, neste caso, 10 ml, poderiam também melhorar o contacto entre as células e andaime e, finalmente, aumentar a aderência celular. Futuros estudos devem considerar também a viabilidade celular como o processo de semeadura de células pode causar danos às células e / ou morte celular 16. Ensaios de ADN celular não diferenciar entre células viáveis ​​e não viáveis, como a / ensaio mortos tal ao vivo, por exemplo, gostaria de destacar o nível de viabilidade. Esta investigação aumenta a consciência para o número real de células que se ligam ao cadafalso apesar semeando uma quantidade conhecida. Para os estudos que se baseiam no número inicial de células, é muito importante que os pesquisadores sabem exatamente quantas daquela figura de fato aderir ao substrato de interesse.

Os andaimes são rotineiramente sendo desenvolvidos e pesquisados ​​para aplicações de biomateriais e engenharia de tecidos. Como tal, eles são vulgarmente semeadas com células e o seu comportamento in vitro, caracterizadas através de ensaios que determinam a proliferação celular e o número de células, por exemplo. Para experiências como essas, é imperativo que o número de células inicial é conhecida e pesquisadores freqüentemente a máxima concentração de semeadura, em termos de número de células por ml ou cm 2. Enquanto isto é uma boa prática, especialmente para fins de aumento de escala, que não tem em conta o número real de células que aderem à superfície de andaime (que também é dependente das propriedades adesivas da superfície do biomaterial 1). Isto é especialmente verdadeiro para os andaimes que não cobrem toda a base da célula de cultura bem como placa de células poderiam cair fora da construção e, devido à natureza muitas vezes estática do experimento, pode nunca mais voltar em contacto com o material de interesto. Fios de fibra electrospun são um bom exemplo de um andaime que não cobre a base da cavidade (Figura 1A). Neste caso, os baixos placas de poços de ligação que não foram tratados à superfície deve ser usada para evitar que as células de se ligarem à superfície da placa e, consequentemente, distorcem os resultados de qualquer ensaio bem fundamentada. Poços são facilmente utilizados para semeadura de células para andaimes, mas eles não são o único método disponível. Sistemas de cultura de células do Rotary, um tipo de biorreator desenvolvido pela Divisão de Ciências da Vida da NASA no final de 1980, da mesma forma pode ser usado para semear andaimes dentro de um ambiente tridimensional (3D) com microgravidade simulada. Este tipo de biorreator continua a ser uma escolha popular entre os pesquisadores em todo o mundo e tem sido incorporada nos estudos para a sinalização celular 2,3, as células estaminais e engenharia de tecidos de 4,5 6,7. O que faz com que o bioreactor rotativo preferível placas de poços é a manutençãode um ambiente 3D, o que ajuda a evitar que as células diferenciadas de dedifferentiating, como é frequentemente o caso quando cultivadas dentro de condições 2D convencionais 8. Este artigo investiga técnicas diferentes para sementeira de células estaminais mesenquimais humanas em electrospun poli (ε-caprolactona) como fios de fibra fabricada em Bosworth et al., 9, a fim de maximizar o número inicial de células ligadas a estes esqueletos dentro de um período de 4 h. Para a cultura 2D, os fios foram solidamente mantidos dentro de poços ou feitos sob medida de poli (tetrafluoroetileno) (PTFE) calhas e mantidos em condições estáticas, ou agitado em 30 rpm. Para a cultura 3D, fios e células foram realizadas dentro dos vasos de biorreatores rotativas às 9 rpm.

<table><tbody><tr><td>Água destilada</td><td>abastecimento interno</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>1117271000</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Life Technologies</td><td>70013016</td><td></td></tr><tr><td>Células estaminais mesenquimais humanas</td><td>PromoCell GmbH</td><td>C-12974</td><td></td></tr><tr><td>Meios de cultura MSC</td><td>PromoCell GmbH</td><td>C-28010B</td><td>Aquecido a 37 oC antes da utilização</td></tr><tr><td>Mistura de suplementos</td><td>PromoCell GmbH</td><td>C-39810</td><td>Adicionar aos meios de cultura</td></tr><tr><td>Mistura antibiótica/antimótica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>Adicionar aos meios de cultura</td></tr><tr><td>Tripsina (0,05%) EDTA (0,02%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59417C</td><td>Aquecido a 37 &#176; C antes do uso</td></tr><tr><td>Frascos de cultura de células (T75)</td><td>Becton Dickinson Ltd</td><td>353110</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 poços de ligação baixa</td><td>Costar Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>CellCrowns de 6 poços</td><td>Andaime</td><td>C00003S</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri 50 ml de profundidade</td><td>Esterilina</td><td>124</td><td></td></tr><tr><td>Calhas de PTFE</td><td>produção interna</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>RCCS descartável vasos 10 ml</td><td>Synthecon</td><td>D-410</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Cultura de Células Rotativas de 4 Vasos biorreator</td><td>Synthecon</td><td>RCCS-4DQ</td><td></td></tr><tr><td>Placa do agitador</td><td>Stuart</td><td>SSM1</td><td>Mini Agitador Orbital</td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Digital Bio</td><td>DHC-F01</td> Tubo de centrífuga <td>C-Chip descartável</td></tr><tr><td></td><td>Deltalab</td><td>352096, 429901</td><td>Centrífuga de 15 ml e 50 ml</td></tr><tr><td></td><td>Hettich</td><td>Rotafix 32 A</td><td></td></tr><tr><td>Seringa 3 ml</td><td>Shield Medicare Ltd</td><td>3039820</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>Sterilin</td><td>40305, 47310, 40125</td><td>5, 10 e 25 ml</td></tr><tr><td>Pipetas Gilson</td><td>SLS</td><td>F144801, F144802, F123600, F123601, F123602</td><td>P2 - P1000</td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta</td><td>SLS</td><td>PIP7852, PIP7834, PIP7840</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de ensaio micro 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30125.15</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>PicoGreen Assay</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td>Configuração do ensaio no escuro</td></tr><tr><td>Placa preta de 96 poços</td><td>Greiner Bio One</td><td>655086</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de placas fluorescentes</td><td>BGM Labtech</td><td>FLUOstar Optima</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeído 25%</td><td>TAAB Laboratories</td><td>G002</td><td>Feito a uma concentração de 1,5% v / v em PBS</td></tr><tr><td>Hexametildisilazane (HMDS)</td> <td>Sigma</td><td>999-97-3</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de alumínio (SEM)</td> <td>Agar Scientific</td><td>G301</td><td></td></tr><tr><td>Abas de carbono (SEM)</td> <td>Agar Scientific</td><td>G3347N</td><td></td></tr><tr><td>Revestidor de pulverização catódica de ouro</td><td>Edwards</td><td>S150B</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Eletrônico de Varredura (SEM)</td> <td>Phenom World</td><td>Phenom Pro</td><td></td></tr></tbody></table>

otimizando penhora de mesenquimais humanas células-tronco em poly (ε-caprolactona) electrospun yarns

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

A investigação sobre biomateriais e engenharia de tecidos, muitas vezes inclui investigações in vitro baseados em células, que exigem conhecimento inicial do número de células de partida. Enquanto os pesquisadores comumente referenciar a sua densidade de semeadura isso não indica necessariamente o número real de células que aderiram ao material em questão. Este é particularmente o caso dos materiais, ou andaimes, que não cobrem a base de placas de cultura de células padrão. Este estudo investiga a ligação inicial de células-tronco mesenquimais humanas semeados em um número conhecido em poli electrospun (ε-caprolactona) de fios após 4 horas em cultura. Fios electrospun foram realizadas dentro de vários set-ups diferentes, incluindo os navios de biorreatores rotativas às 9 rpm, inserções de cultura de células posicionadas em baixas poços de ligação e de politetrafluoretileno (PTFE) calhas colocadas dentro de caixas de Petri. Os dois últimos foram submetidos a condições tanto estáticas ou posicionado num agitador de placas (30 ° C, 5% de CO 2, o local de células semeadas foram determinados pelo ensaio de ADN da célula. Os andaimes foram removidos dos respectivos recipientes e colocados em tampão de lise. A fracção meio foi removido e centrifugado de forma semelhante - o sobrenadante descartado e o sedimento dividida com tampão de lise. O tampão de lise foi adicionada a cada recipiente, ou bem, e raspadas para libertar quaisquer células que possam estar presentes. O ensaio de DNA de células determinada a percentagem de células presentes no andaime, mídia e frações bem. A adesão celular foi baixa para todos os arranjos experimentais, com maior apego (30%) para os fios realizadas na inserções de cultura de células e sujeitas a agitação movimento. Este estudo levanta a consciência para o número real de células inerentes aos andaimes, independentemente da densidade de semeadura de células indicada.

Estes resultados indicam a localização das células seguintes quatro horas após a sementeira para cada conjunto experimental investigado. A Figura 2A demonstra a percentagem de células que têm ligado à superfície do andaime durante este tempo. Um factor de conversão de 8,5 pg / célula foi usada para converter o teor de ADN medido em número de células e, assim, determinar a percentagem de células 10. Para todos os semeadura set-ups investigado, o percentual de fixação das células é relativamente baixa, com maior aderência celular (30%) para andaimes realizadas na inserções de cultura de células e agitando a 30 rpm (Insert Shaker). Mais baixa aderência (15%) foi realizada por andaimes dentro das inserções de cultura de células e mantidos sob condições estáticas (Inserir estáticas). Um grande número de células estavam presentes dentro da fracção de media (Figura 2B), mais notavelmente para inserções de cultura de células mantidas dentro de placas de ligação (baixos) Inserir estáticas e vasos rotativos sendo 50% e 51%respectivamente. Andaimes realizada nos cochos demonstraram um elevado número de células presentes no interior do próprio titular - 48% das células para Trough Shaker e 50% para Trough estático. Microscopia eletrônica de varredura permitiram uma avaliação visual dos scaffolds de células-semeado (Figura 3). Imagens representativas em destaque uma presença limitada de células na superfície fibroso, independentemente de semear set-up. No entanto, um maior número de células e aglomerados celulares estavam presentes nos andaimes mantidos dentro das inserções de cultura de células e agitados a 30 rpm (Inserir Shaker). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52135/52135fig1.jpg"> Figura 1. arranjos experimentais, onde electrospun Yarn é realizada dentro; (A) inserções de cultura de células e baixo bem placa de ligação; (B) poli (tetrafluoroetileno) (PTFE) cocho e placa de Petri; e (C) navio biorreator. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52135/52135fig2.jpg"> Figura 2. localização das células 4 horas pós-semeadura Onto PCL electrospun Yarns utilizando diferentes Sementeira set-ups. (A) Demonstra a percentagem de células que se ligaram ao andaime PCL (média ± desvio padrão); (B) evidencia a percentagem de propagação de célula local nas três fracções - meios de comunicação, e assim andaime (n = 4, apresentado como dados Os valores médios). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52135/52135fig3.jpg" files ftp_upload> Figura 3. O representante Eletrônica de Varredura micrografias para PCL electrospun Yarns com mesenquimais humanas células-tronco, 4 horas após a semeadura inicial utilizando diferentes arranjos experimentais. (Todas as imagens na ampliação 1000X, barra de escala = 130 m.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este artigo descreve uma variedade de configurações para semear células-tronco mesenquimais humanas em materiais, neste caso fios eletrofiados, que não cobrem a base das placas de poço de cultura padrão, a fim de maximizar e quantificar o número de células que inicialmente se ligam em comparação com a densidade de semeadura conhecida.

Otimizando Penhora de mesenquimais humanas Células-Tronco em Poly (ε-caprolactona) electrospun Yarns

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Neste procedimento, os andaimes PCL eletrofiados são configurados de maneiras diferentes para determinar uma configuração ideal de semeadura celular. Primeiro, os andaimes estéreis são colocados nas diferentes configurações que estão sendo investigadas, incluindo inserções de cultura de células, calhas e vasos rotativos de biorreatores. Uma vez no lugar, um número conhecido de células é semeado no andaime e depois deixado sem perturbação por 20 minutos.Em seguida, todas as amostras são cuidadosamente movidas para uma incubadora, configuradas com 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius e submetidas a condições estáticas ou dinâmicas antes do expediente. Após esse tempo de cultivo, o número de células que se ligaram ao andaime é determinado por um ensaio de DNA para quantificar a quantidade de células no meio do andaime e nas frações do poço. Em última análise, isso é conseguido quantificando o DNA presente no andaime, no poço e no meio circundante para visualizar a ligação das células aos andaimes, microscopia eletrônica de varredura ou SEM é usada.Tivemos a ideia para esta investigação pela primeira vez quando soubemos que nossos andaimes não cobriam toda a base da placa do poço, o que significava a possibilidade de que nem todas as células estivessem em contato com o andaime e, portanto, capazes de se fixar. Para começar, configure as inserções de cultura de células sob o fluxo da lâmina, abrindo as inserções estéreis de cultura de células de seis poços e separando os anéis mais curtos com dentes dos corpos com anéis mais largos. Em seguida, pegue o anel com os dentes apontando para cima e coloque um dos andaimes de quatro centímetros sobre o centro do anel, certificando-se de que ele se sobreponha em ambos os lados.Pegue o corpo anelado e posicione-o sobre o anel do dente e o andaime. Em seguida, empurre para baixo, certificando-se de que o andaime permaneça na posição e fique no centro da cultura de células. Inserir. Coloque o inserto de cultura de células com andaime no poço de uma placa de baixa ligação de seis poços e adicione 10 mililitros de meio de cultura ao andaime.Em seguida, coloque as calhas de politetrafluoretileno em placas de Petri individuais e adicione 10 mililitros de meios de cultura à calha. Usando uma pinça, coloque um dos andaimes de três centímetros na calha, certificando-se de que seu comprimento esteja paralelo à borda mais longa da calha. Para configurar o vaso do biorreator sob fluxo de lâmina, dispense 10 mililitros de solução salina tamponada com fosfato estéril ou PBS através da porta principal do vaso do biorreator.Após 10 minutos, remova o PBS e substitua por oito mililitros de meios de cultura usando uma pinça. Insira um dos andaimes de três centímetros na embarcação através da porta principal. Em seguida, posicione fora da porta principal.Depois de realizar a contagem de células-tronco mesenquimais humanas conforme descrito no protocolo de texto, aspire o meio do tubo de centrífuga deixando o pellet celular e substitua pelo volume de meio calculado. Resus suspende as células e o meio para uma mistura uniforme. Usando uma pipeta P 200 Gilson, distribua lentamente 200 microlitros de suspensão de células em cada andaime, passando a ponta da pipeta ao longo do comprimento do andaime e abaixo da superfície do líquido do meio.Deixe sem perturbação por 20 minutos, ou os vasos do biorreator dispensaram 200 microlitros da suspensão celular pela porta principal. Complete os dois mililitros restantes de meios de cultura pelas portas da seringa para obter um volume total de 10 mililitros. Em seguida, transfira os vasos do biorreator para o biorreator do vaso rotativo e defina para girar.A nove RPM, transfira as placas de poço com inserções e calhas de cultura de células para a placa agitadora e defina para girar a 30 RPM em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius, 5% ou cultura estática. Transfira as placas de poço com as inserções e calhas de cultura de células para a prateleira de uma incubadora de cultura de células. Fixado em 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Após quatro horas, retirar as amostras da incubadora e colocá-las sob fluxo de lâminas. Em seguida, remova as frações de mídia de todas as amostras e coloque em tubos de centrífuga rotulados separadamente. Após centrifugação por cinco minutos a 241 vezes G, remova o supinato antes de adicionar três mililitros de vórtice tampão de lise, a solução para quebrar o pellet celular que os andaimes mantinham dentro das inserções de cultura de células Primeiro, libere o andaime cortando-o próximo à borda das pastilhas usando um andaime.Em seguida, usando uma pinça, remova os andaimes e coloque em tubos de centrífuga contendo três mililitros de tampão de lise. Em seguida, adicione três mililitros de tampão de lise a cada receptáculo de andaime e raspe a superfície. Remova o tampão de lise e coloque em tubos de centrífuga rotulados separadamente.Agitar cada tubo de centrifugação durante cerca de um minuto para assegurar uma agitação suficiente e estimular a lise da membrana celular. Em uma placa preta de 96 poços, adicione 100 microlitros de tampão de lise para cada meio de andaime de fração de amostra e, em seguida, no escuro, adicione 100 microlitros de solução de DNA celular a todos os poços contendo tampão de lise e misture. Inclua suavemente os poços com tampão de lise sem DNA e solução de DNA celular para fornecer um controle negativo e positivo para a placa do poço.Usando um leitor de placa de fluorescência, meça a absorbância dos poços com excitação de 485 nanômetros e emissão de 520 nanômetros. Compare os dados com a curva padrão gerada a partir dos padrões de DNA de acordo com as instruções do fabricante para realizar a fixação de MEV. Após quatro horas de incubação, remova todos os andaimes de seus recipientes e coloque dentro de poços separados de uma nova placa de seis poços e um fluxo de lâmina.Em seguida, lave os andaimes duas vezes com PBS para cada um. Bem, adicione dois mililitros de 1,5% de glutaraldeído em PBS para garantir uma cobertura completa no andaime. Deixe a placa por no mínimo 30 minutos a quatro graus Celsius para fixação de células.Remova a solução fixadora e lave os andaimes duas vezes com PBS. Em seguida, transfira os andaimes para uma nova placa de poço para desidratá-los com concentrações crescentes de etanol em água destilada, começando com 50% de etanol seguido de 70% e depois 90% para cada concentração. Mergulhe completamente os andaimes na solução e deixe por três minutos antes de descartar a solução e repetir.Uma vez desidratados os andaimes em 100% de etanol, submergindo totalmente os andaimes em solução e deixando por cinco minutos, descarte a solução e repita quimicamente os andaimes. Usando HMDS dentro de uma hotte. Mergulhe os andaimes no HMDS e deixe por cinco minutos antes de remover o HMDS após repetir uma vez.Remova o HMDS e deixe os andaimes secarem. Em seguida, monte os andaimes em stubs de SEM disponíveis comercialmente para facilitar a visualização dentro da camada de SEM, as amostras com uma camada de manchas douradas por dois minutos para garantir uma cobertura fina e uniforme. Finalmente, coloque as amostras dentro do SEM e visualize os andaimes assentados nas células usando um feixe de elétrons de cinco quilos.Os resultados destacam a localização das células após quatro horas após a semeadura para cada configuração experimental investigada. Esta figura demonstra a porcentagem de células que se fixaram à superfície do andaime durante esse período em que todas as configurações de semeadura foram investigadas. A porcentagem de fixação celular é relativamente baixa, mas a maior aderência celular para andaimes mantidos dentro de inserções de cultura de células e agitados a 30 RPM.A menor aderência foi para os andaimes mantidos dentro das inserções de cultura de células e mantidos em condições estáticas. Um grande número de células estava presente na fração média, principalmente para cultura de células. Inserções mantidas dentro de placas de baixa ligação a 50% e vasos rotativos a 51% Os andaimes mantidos dentro das calhas demonstraram um número elevado de células presentes no próprio suporte.48% para agitador de calha e 50% para varredura estática de calha. A eletromicroscopia permitiu uma avaliação visual dos scaffolds semeados por células. Imagens representativas destacaram uma presença limitada de células na superfície fibrosa, independentemente da configuração de semeadura.No entanto, um número maior de células e aglomerados celulares estava presente nos andaimes mantidos dentro das inserções de cultura de células e agitados a 30 RP M. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de que semear um número conhecido de células não equivale necessariamente a tantas células realmente ligadas ao andaime, especialmente para andaimes que não cobrem toda a base das placas selvagens. Para scaffolds como esses, recomenda-se que diferentes configurações de semeadura de células sejam primeiro otimizadas para maximizar a fixação inicial da célula ao scaffold.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Otimizando Penhora de mesenquimais humanas Células-Tronco em Poly (ε-caprolactona) electrospun Yarns

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