Name: Desenvolvimento de um In vitro Sistema modelo para estudar a interacção de Equus Caballus IgE ao seu receptor de elevada afinidade FceRI (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Aprenda a desenvolver um ensaio in vitro para medir a libertação de mediadores dependente de IgE em células de leucemia basofílica de rato transfectadas com o gene FcεRIα equino. Este método permite estudar reações alérgicas em Equus caballus.

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Os autores agradecem à Dra. Lynda Partridge pelo fornecimento de aconselhamento e instalações laboratoriais.

1) Preparação de Linha de Células: <ol><li> O desenvolvimento da linha celular RBL-2H3.1 expressando α FcsRI eqüinos: <ol><li> Usando técnicas básicas de cultura de tecidos para linhas de células em monocamada, transfectar células RBL-2H3.1 parental usando o plasmídeo pEE6, que transporta o gene equina FceRIa (GenBank: Y18204.1) 28. Adicionar 2 ug -1 ul do DNA de plasmídeo a 0,8 ml de células a uma densidade de 1,2 x 10 7 células mL @ 1. Electroporate as células a 250 V, 960 uF utilizando um 0,4 centímetros electrocuvette depois incubar imediatamente em gelo durante 10 min. </li><li> Selecione as células transformadas utilizando meios contendo 0,4 g de sulfato de geneticina G418, em seguida, classificar as restantes células vivas através FACS por marcá-los com um anticorpo IgE fluorescente. Use o RBL-2H3.1 resultando expressar eqüinos linha celular FceRIa para a investigação 2, 3. </li></ol></li><li> Pré-ensaio de anticorpo de sensibilização: <ol><li colheita da rbl-2h3.1 expressando c eq fceria de um confluente placa petri. lavar em seguida re-suspender as meio cultura a uma densidade celular>5 células ml -1. </li><li> Adicionar a IgE de interesse para as células suspensas a uma concentração final de 1 ng mL-1, em seguida, a placa 100 ul de células numa placa de 96 poços em colunas 1-6 e incubar a 37 ° C + 5% de CO 2 + 90% humidade relativa durante 16 horas. Após o tempo de incubação, e antes de realizar o ensaio de libertação, verificar os poços sob um microscópio para o bem de confluência e aderência celular. </li></ol></li></ol> 2) Lançamento de Ensaio: <ol><li> Lavar as células: <ol><li> Tampão de libertação Quente (PIPES 25 mM, cloreto de sódio 120 mM, cloreto de potássio 5 mM, cloreto de magnésio 0,04 mM e 1 mM de cloreto de cálcio) a 37 ° C para permitir uma lavagem das células suavemente. </li><li> Lave as células sacudindo a placa para remover a mídia de células e adicionar 100 ml quente, 37 ° C, tampão de libertação. Repita duas vezes. </li></ol></li><li> Desafio Antígeno: <ol><li> Prepara-se uma diluição em série do antigénio (NIP-HSA ou DNP-HSA) de 0 ng ml -1, 0,1 ng ml -1, 1 ng ml-1, 10 ng mL-1, 100 ng ml -1, 1.000 ng ml -1, 10.000 ng ml-1 em tampão de liberação e quente a 37 ° C. </li><li> Após a segunda lavagem das células, os meios de descarte e substituído por 100 ul das soluções de antigénio. Certifique-se de que os poços de uma mesma fila (A1-6 por exemplo) têm a mesma concentração de antigénio adicionados a eles. </li><li> Configurar um controle negativo na linha A, adicionando 0 ng antígeno -1 ml. Adicionar o aumento da concentração de antigénio para baixo as linhas (BG), seguido de triton x-tampão (5% de Triton X-100) H em células de linha para lisar as células a serem utilizadas como um controlo positivo. Incubar a 37 ° C durante 20 minutos para permitir que as células de libertar os seus mediadores. </li></ol></li><li> Configurar controles bem individuais: <ol><li> Após a incubação, transferir 50 ul de sobrenadante de célula para a outra metade dos poços (placa de poços A1-6 A7-12, etc). Descartar as restantes 50 ul de sobrenadante e substituir com 50 ul de Triton-x tampão para permitir a medição da quantidade de mediadores libertados em cada cavidade nas colunas 7-12 como uma percentagem do total de mediadores no interior das células na coluna 1-6 . </li></ol></li><li> O substrato enzimático: </li><li> Adicionar 50 ul de substrato β-hexosaminidase (50 mM de 4-nitrofenilo N-acetil-β-D-glucosaminida preparado em DMSO diluídos até 2 mM, adicionando-o ao tampão de citrato ácido cítrico 0,2 M e 0,2 M de acetato de sódio, pH 4,5) a todos os poços para facilitar a conversão do substrato a 4-nitrofenol pela enzima β-hexosaminidase. Incubar as placas a 37 ° C durante 2 horas. </li></ol><img alt="Figura 2.4.1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52222/52222fig241.jpg" width='"400"'><ol start="5"><li> Encerrando a reação: <ol><li> Parar a reacção pela adição de 150 ul de tampão Tris (1 M Tris-HCl, pH 9) a cada poço como o elevado pH do tampão de pára a reacção e transforma o 4-nitrofenol em uma cor amarela. </li></ol></li><li> Lendo e analisando os resultados: <ol><li> Ler a placa utilizando uma placa espectrofotómetro a 405 nm para medir a absorvência da cor amarela. Calculado a percentagem de β-hexosaminidase libertada utilizando a seguinte fórmula: </li></ol></li></ol><img alt="Figura 2.6.1" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52222/52222fig261.jpg" width="100"><ol start="2"><li> Aplicar esta fórmula para cada poço, após o que é feita uma média para cada linha. A1 e A7 representam a localização dos poços da placa de 96 poços. Traçar uma curva de porcentagem de liberação β-hexosaminidase (o que corresponde a total liberação de mediador) açaíantígeno nst concentração 2, 3. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes neste artigo.

Em resumo, os resultados desta investigação mostraram que, quando as células RBL-2H3.1 expressando FceRIa eqüinos são sensibilizados com IgE eqüinos e desafiado por um antígeno, eles dão um pico de liberação mediador de 36,68% ± 4,88% do montante total de mediador dentro do As células, em comparação com o RBL-2H3.1 células parentais não expressam eqüinos FceRIa. Assim, este ensaio fornece uma ferramenta útil para investigar e estudar respostas alérgicas eqüinos in vitro. Sua permite...

Alergia é conhecida há milênios. Um tratamento da asma foi descrita no texto médico egípcio antigo conhecido como o Papiro de Ebers (~ 1.550 aC) e discutido ervas remédios para tratá-la 7. Hoje alergia é classificada como uma resposta de hipersensibilidade do tipo I, em que o tipo de célula T helper 2 (TH 2) o braço do sistema imunitário dirige a produção de (IgE) anticorpos imunoglobulina E em resposta a antigénios ambientais chamados alérgenos. Estes são diversas substâncias que normalmente interagem com as células do sistema imunológico e estimular a síntese e secreção de citocinas pró-inflamatórias, incluindo a interleucina-4 e interleucina-13 8, 9, conforme se em partículas do fumo do cigarro ou do escape de diesel de partículas que aumentam a síntese de IgE 10. O aumento nas manifestações alérgicas em países industrializados nos últimos 50 anos, tem sido atribuída a uma combinação do efeito depoluentes ambientais e uma tendência para um ambiente mais higienizado, que combinam a mudar a resposta imunológica para um perfil predominou por TH duas citocinas, tal como proposto pelo &quot;Hipótese da Higiene&quot; 11. Como mencionado acima, os seres humanos não são os únicos mamíferos afetados por alergia. Notavelmente cavalos e cães também podem desenvolver reações alérgicas clássicos e um estudo de 12 mostrou que, como nos seres humanos, a alergia eqüina é atribuída a fatores genéticos e ambientais. Como consequência, esses animais apresentam bons modelos para o estudo da interação entre causas genéticas e ambientais de alergia, a sua progressão de sensibilização para a doença, e as possíveis estratégias de intervenção uma vez que as manifestações clínicas definidas em Em 1887, Stömmer foi a primeira pessoa a descrever a semelhança entre o ser humano e asma equina 13, o efeito da histamina sobre o sistema cardiovascular é equinamuito semelhante à dos seres humanos 14. Cavalos também são a pedra angular da indústria de corridas a cavalo, que vale US $ 72 bilhões, com um volume de apostas de US $ 115 bilhões por ano 15. A maioria dos cavalos de corrida contemporâneos são descendentes do pequeno número de cavalos árabes criados por Lady Anne Blunt de 1878 em diante. Cavalos de corrida modernos são comumente pura a escolha de habilidades de desempenho. Eles são propensas a doenças genéticas, uma das quais é a sua susceptibilidade para montar respostas alérgicas. Eles também têm mil vezes mais altos níveis séricos de IgE do que até mesmo os mais severamente alérgica seres humanos 16. Respostas alérgicas cavalo são geralmente se manifesta como hipersensibilidade picada de inseto (IBH) 17, 18. Resultados IBH na dermatite devido a picadas de insetos formam no gênero Culicoides. Outra forma de doença alérgica eqüina é obstruções das vias respiratórias recorrentes (RAO), isso se manifesta nos pulmões e vias respiratórias. É caracterizada por chiado e laboratóriorespiração ORed. RAO comumente ocorre em resposta a esporos, e altos níveis de IgE alérgeno-específicos foram registrados em cavalos que sofrem de RAO em um estudo de 19, embora outra investigação não confirmou esta 20. Estudos sobre alergia equina girado em torno da tentativa de controlar e neutralizar equina IgE através do desenvolvimento de anticorpos monoclonais anti-IgE equino (mAbs) 21, 22. Além disso, o estudo de 23 discute a produção dos domínios extracelulares de α o de elevada afinidade do receptor de Fc equina cadeia (FceRIa) receptor, na tentativa de detectar e quantificar soro eqüino IgE. Um estudo relacionado por Ledin 24 discute uma nova abordagem visando neutralizar IgE soro por priming do sistema imunológico através de um auto / não-auto imunógeno. Todos estes estudos, no entanto, faltava um ensaio eficaz para testar a segurança e eficácia dos seus protocolos. Neste artigo, vamos agora apresentar tal sys ensaiotempe aplicável ao estudo de estratégias de diagnóstico e terapêuticos relevantes para o sistema equina, onde libertação β-hexosaminidase, como um indicador de mediador de células desgranulação, foi avaliada em células RBL-2H3.1 expressam equina FceRIa. Este protocolo baseia-se em publicações anteriores 25, 4, 5, 2, 3 descrevem a engenharia de células RBL transfectadas com o gene que codifica o domínio de ligação do receptor de IgE de alta afinidade para IgE a partir de espécies diferentes. O protocolo explica como realizar um ensaio de libertação de β-hexosaminidase, cujos resultados são apresentados como a média ± desvio padrão de experiências em triplicado. O ensaio de liberação foi desenvolvido pela primeira vez por Siraganian e Gancho 25 para estudar alergia humano. O grupo de laboratório liderado pelo Dr. Reuben Siraganian também desenvolveu a linha de células RBL. Estas células RBL foram desenvolvidos para expressar o FceRIa humana e o protocolo foi publicada por 4. A peça finaldo ensaio de veio com o desenvolvimento do plasmídeo pSV no papel por Neuberger 26, que descreveu a produção de anticorpos IgE por uma clonagem do seu gene de cadeia pesada a jusante de um gene de rato para uma região variável de IgE que tem como alvo o hapteno 4-hidroxi-3 -nitro-fenacetilo (NP), o anticorpo quimérico resultante era totalmente funcional. A capacidade de desenvolver qualquer IgE direccionamento do mesmo hapteno, ao mesmo tempo, a clonagem do seu receptor na superfície das células RBL resultaram na padronização do ensaio tornando-se um protocolo útil para medir a desgranulação de basófilos. O ensaio tem prós e contras. As vantagens do ensaio é a sua adaptabilidade para ser utilizado em qualquer sistema de mamífero, o nosso laboratório tem, assim, usou-o para testar para a desgranulação nos sistemas humanos, caninos e equinos, e isso pode ser conseguido simplesmente através da síntese de IgE do organismo e a clonagem do seu receptor sobre a superfície das células RBL. Por outro lado,os contras do ensaio é que as células RBL são muito sensíveis a alterações térmicas, mecânicas e de PH, tornando-os dão uma variação de níveis de degranulação dentro do mesmo ensaio. É, portanto, altamente recomendável que os ensaios são sempre repetidas em triplicata e, em seguida, uma média é tomada a partir delas. Além disso, as células RBL tendem a deslocar para um fenótipo de não desprendimento, se forem deixados em cultura de tecidos durante tempos prolongados (&gt; 10 semanas) 27, tornando complicada a sua manutenção. Eles também são propensos a infecções por micoplasma, bactérias que não são visíveis a partir de um microscópio de luz e não modificam a morfologia da célula, mas iria alterar drasticamente os seus níveis de degranulação. Assim, são necessários testes de micoplasma regulares.

<table><tbody><tr><td>RBL-2H3.1 Expressando Fc e épsilon equino; RI&alfa;</td><td>-</td><td>-</td><td>Produzido em laboratório</td></tr><tr><td>Equine IgE anti NIP-HSA</td><td>-</td><td>-</td><td>Produzido em laboratório</td></tr><tr><td>96 Well Plate</td><td>Sigma</td><td></td> <td>CLS3595-Multi</td></tr> <tr><td>Channel Pipeta</td><td>Anachem</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Galaxy R</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>4Hidroxi-5-iodo-3-ácido nitrofenilacético</td><td>Cambridge Research Biochemicals</td><td>N-1070-1</td><td>NIP-OH foi conjugado com albumina sérica humana para fazer NIP-HSA no laboratório</td></tr><tr><td>Dinitrofenil conjugado com albumina sérica humana</td><td>Sigma</td><td>A6661</td> Espectrofotômetro de placa <td>DNP-HSA abreviado</td></tr><tr><td></td><td>Anthos Labtec HT2</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Tubos</td><td>Sigma</td><td>P1851-Cloreto</td> <td>de</td></tr> <tr><td>sódio</td><td>Sigma</td><td>S7653-Cloreto</td><td></td></tr> de <tr><td>potássio</td><td>Sigma</td><td>P9333-Cloreto</td> <td>de</td></tr> <tr><td>magnésio</td><td>Sigma</td><td>M2670-Cloreto</td> <td>de</td></tr> <tr><td>cálcio</td><td>Sigma</td><td>C1016-Triton</td><td></td></tr> <tr><td>x100</td><td>Sigma</td><td>X100-4-nitrofenil</td><td></td></tr> <tr><td>N-acetil-&beta;-D-glucosaminada</td><td>Sigma</td><td>N9376</td><td>Solução de estoque chamada substrato &beta;-hexosaminidase foi 50mM preparada em DMSO</td></tr><tr><td>Dimetil Sulfóxido Sigma</td><td></td><td>D2650-Ácido</td><td></td></tr> <tr><td>Cítrico</td><td>Sigma</td><td></td> <td>251275-Acetato de</td></tr> <tr><td>Sódio</td><td>Sigma</td><td>S7670-Tris</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>-</td></tr></tbody></table>

desenvolvimento de um in vitro sistema modelo para estudar a interacção de equus caballus ige ao seu receptor de elevada afinidade fceri

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor Fc&#949;RI

A interação da IgE com seu receptor Fc de alta afinidade (FcεRI) seguida por um desafio antigênico é a principal via nas reações alérgicas mediadas por IgE. Como consequência da ligação de alta afinidade entre IgE e FcεRI, juntamente com a produção contínua de IgE pelas células B, as alergias geralmente persistem ao longo da vida, atualmente sem cura permanente disponível. Os cavalos, especialmente os cavalos de corrida, que são comumente consanguíneos, são uma espécie de mamífero muito propensa ao desenvolvimento de respostas de hipersensibilidade, o que pode afetar seriamente seu desempenho. As respostas fisiológicas à sensibilização alérgica em cavalos refletem as observadas em humanos e cães. Neste artigo, descrevemos o desenvolvimento de um sistema de ensaio in situ para a avaliação quantitativa da liberação de mediadores da resposta alérgica pertencente ao sistema equino. Para este fim, o gene que codifica o FcεRIα equino foi transfectado e expresso na superfície das células parentais de leucemia basófila de ratos (RBL-2H3.1). O produto gênico da cadeia α equina transfectada formou um complexo receptor funcional com as cadeias endógenas de β e γ de ratos 1. O sistema de ensaio resultante facilitou a avaliação da quantidade de mediador secretado de células RBL-2H3.1 transfectadas com FcεRIα equino após sensibilização com IgE equina e desafio antigênico usando liberação de β-hexosaminidase como leitura 2, 3. A liberação do mediador atingiu o pico de 36,68% ± 4,88% a 100 ng ml-1 de antígeno. Este ensaio foi modificado a partir de ensaios anteriores usados para estudar respostas alérgicas humanas e caninas 4, 5. Também mostramos que esse tipo de sistema de ensaio tem múltiplas aplicações para o desenvolvimento de ferramentas diagnósticas e a avaliação de segurança de possíveis estratégias de intervenção terapêutica em doenças alérgicas 6, 2, 3.

As células RBL-2H3.1 parentais e as transfectadas com o gene do receptor de FceRIa equino foram sensibilizados primeiro com IgE de murganho anti DNP-HSA e desafiados com o antigénio DNP-HSA. Rato IgE se liga ao receptor endógeno de rato em ambas as linhas de células e, assim, actua como um controlo para testar a viabilidade de libertação de ambas as linhas celulares para libertar mediadores (Figura 1 A). Esta é uma verificação importante e deve ser levada a cabo rotineiramente desde cima prolongadas (&g...

O presente estudo descreve o desenvolvimento e as aplicações de um sistema de ensaio geneticamente modificado baseado na transfecção de células de leucemia basofílica de rato com o gene FcεRIα equino. As células transfectadas expressam um receptor funcional onde a liberação de mediadores da resposta alérgica pode ser ativada por IgE e antígeno.

Desenvolvimento de um In vitro Sistema modelo para estudar a interacção de Equus Caballus IgE ao seu receptor de elevada afinidade FceRI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated ...

O objetivo geral do experimento a seguir é medir a quantidade de liberação de mediadores dependentes de IgE das células de leucemia RAD Basophil. Os sintomas de alergia são causados pela liberação de mediadores como a histamina. Agora, a histamina não é o único mediador liberado pelos basófilos são os mastócitos.O total de todos os mediadores liberados por essas células resulta nos sinais e sintomas de hipersensibilidade imediata e tardia. Agora, os humanos não são os únicos organismos que sofrem de alergia cães e cavalos também sofrem. Para desenvolver ainda mais a pesquisa e encontrar tratamentos contra alergia, como vacinas, é necessário um ensaio de liberação para quantificar a quantidade de mediadores liberados, se houver, do tratamento de pesquisa.Esta é a razão para este ensaio de liberação. O ensaio liberado pelo mediador RBL para o sistema humano foi desenvolvido e publicado pela primeira vez por Ian e Hook em 1986. Mais tarde, foi desenvolvido para o sistema DOC e agora para o sistema de cavalos.As modificações são tão simples quanto mudar as proteínas de interesse. A notícia da linha celular foi a leucemia de Rato Baso ou RBL duas linhagens celulares H 3.1 expressando a cadeia alfa de receptores equinos FNT ffc Serin R one para uma densidade celular de 500.000 células por mililitro. Adicionar o anticorpo IgE de interesse a uma concentração final de um nanograma por mililitro.Adicione 100 microlitros da mistura em uma placa de solo 96 e incube por 16 horas a 37 graus. Isso permite que as células adiram à superfície do poço e o anticorpo se liga à lavagem do receptor. Duas vezes o meio contendo o anticorpo não ligado restante e células mortas com 100 microlitros de tampão quente de 37 graus libera.Descarte o tampão da última lavagem e substitua por 100 microlitros do antígeno de interesse na concentração de interesse. Após 20 minutos de incubação a 37 graus, transfira 50 microlitros do SUP natin contendo os mediadores de liberação para um novo poço e substitua o sobrenadante restante por 50 microlitros de tampão Triton X para colocar as células e liberar os mediadores restantes dentro das células. A 50 microlitros de 2 milhões de molares beta hx.Muitos dias de substrato dissolvido em tampão citrato. Após uma incubação de duas horas a 37 graus, adicione 150 microlitros de tampão tris a cada poço, tornando o poço amarelo. Meça a absorbância de cor em 405 nanômetros após 16 horas.Aqueça o tampão de ensaio de liberação, também conhecido como Ian Buffer a 37 graus. Preparar também o gradiente de concentração do antigénio no tampão de libertação nas concentrações. Zero 0,1 1 10, 100, 1000 e 10, 000 nanogramas por mililitro.Em seguida, aqueça a 37 graus. Lave os poços sacudindo rapidamente o prato para remover a mídia e adicione suavemente 100 microlitros de tampão de liberação quente em direção às paredes dos poços. Isso é para reduzir o estresse celular da diferença de temperatura, o que faz com que eles liberem mediadores prematuramente.O prato deve ser lavado duas vezes. Descarte o tampão de liberação final, lave e adicione 100 microlitros de antígeno, começando com concentração zero de antígeno na linha A para o controle negativo, e descendo o gradiente de concentração das linhas B para G e, finalmente, para as fatias Triton X, tampão na linha H. Isso é para o controle positivo. Incube a placa por 20 minutos a 37 graus.Este é o ponto em que as células liberam mediadores após o período de incubação. Transfira 50 microlitros do líquido em cada poço para seu respectivo poço. Na coluna sete a 12, retire completamente o peppe e descarte o líquido restante nas posições de um a seis e substitua por 50 microlitros de tampão de lise Triton X.Adicione 50 microlitros do substrato preparado a todos os 96 poços do prato. Incubar a 37 graus por duas horas. O beta H, muitos dias conversa substrato em quatro nitrofenol.Após o período de incubação, interrompa a reação adicionando 150 microlitros de tampão tris, transformando os quatro nitrofenol em uma cor amarela. Leia a placa usando um espectrofotômetro de placas a 405 nanômetros. Depois de medir os dados de absorbância, calcule a quantidade total de mediadores dentro das células na posição A do poço multiplicando.Seu poço correspondente na posição sete por dois e adicionando o resultado ao valor em um. Isso ocorre porque, durante o experimento, temos o supinato contendo a oposição A dos mediadores de liberação à medida que o transferimos para uma nova oposição de poço. Um sete.Repita os cálculos para o resto dos poços. Calcule a porcentagem de mediadores de liberação na oposição do poço, A sete a partir do total calculado de mediadores dentro das células, multiplicando o valor da posição A sete por dois. Novamente, porque durante o experimento, temos o supernat contendo os mediadores de Reese.À medida que o transferimos para um novo, então multiplique esse produto por 100 e divida esse produto pelo valor total correspondente de mediadores dentro das células para essa posição. Isso dá a porcentagem de mediadores de liberação para o swell. Repita os cálculos para o resto dos poços, pois os seis inchaços em cada linha são desafiados pela mesma concentração de média de antígeno.Esses valores e calcular o desvio padrão plotam esses valores em um gráfico da seguinte maneira. O gráfico mostra que, à medida que a concentração de antígenos aumenta, mais mediadores são liberados até atingir o pico de 100 nanogramas por mililitro, após o qual a liberação de mediadores diminui com o aumento da concentração de antígenos. O resultado experimental final deve ser semelhante a estes gráficos, como pode ser visto no gráfico B. O ensaio de liberação de controle em azul claro não contém anticorpos IgE e, portanto, não mostra nenhuma alteração na liberação do mediador com o aumento da concentração de antígeno.Compare isso com o resultado experimental em azul escuro, que pode conter anticorpos IgE. Este é um exemplo de uma vacina anti-IgE sendo testada quanto à segurança. Fica claro neste gráfico em vermelho que o soro anti-IgE liga os receptores na superfície celular, fazendo com que as células RBL se desgranulem, assim como visto no controle positivo em roxo em comparação com o controle negativo em cinza, tornando esta vacina insegura.Este ensaio é muito útil, pois pode medir a liberação do mediador, ou defasagem ao testar potenciais medicamentos antialérgicos ou vacinas, também pode ser adaptado para os sistemas canino ou equino humano, conforme mostrado, o ensaio pode determinar o bloqueio bem-sucedido ou malsucedido da liberação do mediador ao testar anticorpos antialérgicos.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra eventos impulsionados por FcγRIIIa iniciados por anticorpos terapêuticos em células assassinas naturais humanas. A plataforma de estimulação artificial facilita a exploração das funções efetoras a jusante, abrangendo rearranjo do citoesqueleto, degranulação, produção de quimiocina/citocina e vias de sinalização mediadas pelas porções FcγRIIIa e Fc dos anticorpos envolvidos na ligação.

Um ensaio de ativação artificial in vitro para estudar a ativação do receptor Fc por anticorpos

Encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo animal estabelecido de esclerose múltipla. C57BL / 6 são imunizados com mielina de oligodendrócitos glicoproteína (MOG) peptídeo 35-55 (MOG 35-55), o que resulta em uma paralisia flácida ascendente causada por células imunes autorreactivas no sistema nervoso central. Protocolos para indução e monitoramento de doenças serão discutidos.

Mielina Oligodendrocyte glicoproteína (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Induzida Encefalomielite Auto-imune Experimental (EAE) em murganhos C57BL / 6

Aqui, apresentamos um protocolo para o desenvolvimento e validação de um método de PCR quantitativo utilizado para a detecção e quantificação do DNA do EHV-2 em fluidos respiratórios equinos. O protocolo de validação EHV-2 qRT-PCR envolve um procedimento de três partes: desenvolvimento, caracterização do ensaio qRT-PCR sozinho e caracterização de todo o método analítico.

Desenvolvimento e validação de um método PCR quantitativa para equídeo herpesvírus 2 Diagnostics em fluidos respiratórios

A cultura primária de células endoteliais da córnea de bovino foi utilizada para investigar o mecanismo de transição endotelial-mesenquimais da córnea. Além disso, um modelo criolesão endotélio corneano de rato foi utilizado para demonstrar transição endotelial-mesenquimais da córnea in vivo.

In vitro e in vivo em modelos para o Estudo de Transição da córnea endotelial-mesenquimal

Neste relato apresentamos um protocolo que permite ao investigador gerar um modelo de uveíte intraocular em camundongo. Mais comumente referido como uveíte autoimune experimental (EAU), este modelo estabelecido captura muitos aspectos da doença humana. Aqui, descreveremos como induzir e monitorar a progressão da doença usando várias leituras.

Uveíte Autoimune Experimental: Um Modelo de Rato Inflamatório Intraocular

Para induzir encefalomielite autoimune experimental, um modelo animal de esclerose múltipla, os ratos são imunizados com uma emulsão de água em óleo contendo um autoantígeno e adjuvante completo de Freund. Embora existam vários protocolos para a preparação dessas emulsões, um protocolo de homogeneização rápido, simples e padronizado para a preparação de emulsões é apresentado aqui.

Um método de homogeneização rápido, simples e padronizado para preparar emulsões de antígenos/adjuvantes para induzir encefalomielite autoimune experimental

Os enteróides estão emergindo como um novo modelo para o estudo da fisiologia e fisiopatologia tecidual, desenvolvimento de drogas e medicina regenerativa. Aqui, descrevemos um sistema de cultura 2D derivado de enteróides de células primárias bovinas que permite o co-cultivo com tipos de células teciduais relevantes. Este modelo oferece uma vantagem translacional para a modelagem de pesquisa gastrointestinal.

Geração de um Sistema de Cultura Bidimensional Monocamada Derivada de Enteróides Bovinos Primários para Aplicações em Pesquisa Biomédica Translacional

Este protocolo descreve as etapas detalhadas da microscopia imunoeletrônica pré-incorporada, com foco na exploração de circuitos sinápticos e localização de proteínas na retina.

Investigando circuitos retinianos e localização molecular por microscopia imunoeletrônica pré-incorporada

A glia entérica está se tornando cada vez mais reconhecida por seus papéis na homeostase intestinal e nos processos de doenças, incluindo complicações pós-operatórias. Pacientes equinos em recuperação de laparotomia exploratória de emergência sofrem de alto risco de condições inflamatórias pós-operatórias, destacando a importância de estabelecer cultura de células gliais primárias gliais entéricas equinas repetíveis para estudo.

Cultura glial entérica equina e aplicação ao estudo de um mecanismo inflamatório neural em cólica equina

O estudo demonstra o papel da pele na modulação das respostas imunes em camundongos por meio da imunização epicutânea (EC). A imunização contra CE com um antígeno proteico pode suprimir as respostas imunes na hipersensibilidade de contato ou reverter a supressão induzida pela pele quando combinada com padrões moleculares associados a patógenos. A imunização contra a CE mostra-se promissora como uma abordagem eficaz e sem agulha para a imunoterapia.

Modelo Murino de Imunomodulação Induzida por Epicutâneo

Aprenda a desenvolver um ensaio in vitro para medir a libertação de mediadores dependente de IgE em células de leucemia basofílica de rato transfectadas com o gene FcεRIα equino. Este método permite estudar reações alérgicas em Equus caballus.

Desenvolvimento de um In vitro Sistema modelo para estudar a interacção de Equus Caballus IgE ao seu receptor de elevada afinidade FceRI (Vídeo) | JoVE Journal

Desenvolvimento de um In vitro Sistema modelo para estudar a interacção de Equus Caballus IgE ao seu receptor de elevada afinidade FceRI

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