Desenvolvimento de um In vitro Sistema modelo para estudar a interacção de Equus Caballus IgE ao seu receptor de elevada afinidade FceRI

O objetivo geral do experimento a seguir é medir a quantidade de liberação de mediadores dependentes de IgE das células de leucemia RAD Basophil. Os sintomas de alergia são causados pela liberação de mediadores como a histamina. Agora, a histamina não é o único mediador liberado pelos basófilos são os mastócitos.

O total de todos os mediadores liberados por essas células resulta nos sinais e sintomas de hipersensibilidade imediata e tardia. Agora, os humanos não são os únicos organismos que sofrem de alergia cães e cavalos também sofrem. Para desenvolver ainda mais a pesquisa e encontrar tratamentos contra alergia, como vacinas, é necessário um ensaio de liberação para quantificar a quantidade de mediadores liberados, se houver, do tratamento de pesquisa.

Esta é a razão para este ensaio de liberação. O ensaio liberado pelo mediador RBL para o sistema humano foi desenvolvido e publicado pela primeira vez por Ian e Hook em 1986. Mais tarde, foi desenvolvido para o sistema DOC e agora para o sistema de cavalos.

As modificações são tão simples quanto mudar as proteínas de interesse. A notícia da linha celular foi a leucemia de Rato Baso ou RBL duas linhagens celulares H 3.1 expressando a cadeia alfa de receptores equinos FNT ffc Serin R one para uma densidade celular de 500.000 células por mililitro. Adicionar o anticorpo IgE de interesse a uma concentração final de um nanograma por mililitro.

Adicione 100 microlitros da mistura em uma placa de solo 96 e incube por 16 horas a 37 graus. Isso permite que as células adiram à superfície do poço e o anticorpo se liga à lavagem do receptor. Duas vezes o meio contendo o anticorpo não ligado restante e células mortas com 100 microlitros de tampão quente de 37 graus libera.

Descarte o tampão da última lavagem e substitua por 100 microlitros do antígeno de interesse na concentração de interesse. Após 20 minutos de incubação a 37 graus, transfira 50 microlitros do SUP natin contendo os mediadores de liberação para um novo poço e substitua o sobrenadante restante por 50 microlitros de tampão Triton X para colocar as células e liberar os mediadores restantes dentro das células. A 50 microlitros de 2 milhões de molares beta hx.

Muitos dias de substrato dissolvido em tampão citrato. Após uma incubação de duas horas a 37 graus, adicione 150 microlitros de tampão tris a cada poço, tornando o poço amarelo. Meça a absorbância de cor em 405 nanômetros após 16 horas.

Aqueça o tampão de ensaio de liberação, também conhecido como Ian Buffer a 37 graus. Preparar também o gradiente de concentração do antigénio no tampão de libertação nas concentrações. Zero 0,1 1 10, 100, 1000 e 10, 000 nanogramas por mililitro.

Em seguida, aqueça a 37 graus. Lave os poços sacudindo rapidamente o prato para remover a mídia e adicione suavemente 100 microlitros de tampão de liberação quente em direção às paredes dos poços. Isso é para reduzir o estresse celular da diferença de temperatura, o que faz com que eles liberem mediadores prematuramente.

O prato deve ser lavado duas vezes. Descarte o tampão de liberação final, lave e adicione 100 microlitros de antígeno, começando com concentração zero de antígeno na linha A para o controle negativo, e descendo o gradiente de concentração das linhas B para G e, finalmente, para as fatias Triton X, tampão na linha H. Isso é para o controle positivo. Incube a placa por 20 minutos a 37 graus.

Este é o ponto em que as células liberam mediadores após o período de incubação. Transfira 50 microlitros do líquido em cada poço para seu respectivo poço. Na coluna sete a 12, retire completamente o peppe e descarte o líquido restante nas posições de um a seis e substitua por 50 microlitros de tampão de lise Triton X.

Adicione 50 microlitros do substrato preparado a todos os 96 poços do prato. Incubar a 37 graus por duas horas. O beta H, muitos dias conversa substrato em quatro nitrofenol.

Após o período de incubação, interrompa a reação adicionando 150 microlitros de tampão tris, transformando os quatro nitrofenol em uma cor amarela. Leia a placa usando um espectrofotômetro de placas a 405 nanômetros. Depois de medir os dados de absorbância, calcule a quantidade total de mediadores dentro das células na posição A do poço multiplicando.

Seu poço correspondente na posição sete por dois e adicionando o resultado ao valor em um. Isso ocorre porque, durante o experimento, temos o supinato contendo a oposição A dos mediadores de liberação à medida que o transferimos para uma nova oposição de poço. Um sete.

Repita os cálculos para o resto dos poços. Calcule a porcentagem de mediadores de liberação na oposição do poço, A sete a partir do total calculado de mediadores dentro das células, multiplicando o valor da posição A sete por dois. Novamente, porque durante o experimento, temos o supernat contendo os mediadores de Reese.

À medida que o transferimos para um novo, então multiplique esse produto por 100 e divida esse produto pelo valor total correspondente de mediadores dentro das células para essa posição. Isso dá a porcentagem de mediadores de liberação para o swell. Repita os cálculos para o resto dos poços, pois os seis inchaços em cada linha são desafiados pela mesma concentração de média de antígeno.

Esses valores e calcular o desvio padrão plotam esses valores em um gráfico da seguinte maneira. O gráfico mostra que, à medida que a concentração de antígenos aumenta, mais mediadores são liberados até atingir o pico de 100 nanogramas por mililitro, após o qual a liberação de mediadores diminui com o aumento da concentração de antígenos. O resultado experimental final deve ser semelhante a estes gráficos, como pode ser visto no gráfico B. O ensaio de liberação de controle em azul claro não contém anticorpos IgE e, portanto, não mostra nenhuma alteração na liberação do mediador com o aumento da concentração de antígeno.

Compare isso com o resultado experimental em azul escuro, que pode conter anticorpos IgE. Este é um exemplo de uma vacina anti-IgE sendo testada quanto à segurança. Fica claro neste gráfico em vermelho que o soro anti-IgE liga os receptores na superfície celular, fazendo com que as células RBL se desgranulem, assim como visto no controle positivo em roxo em comparação com o controle negativo em cinza, tornando esta vacina insegura.

Este ensaio é muito útil, pois pode medir a liberação do mediador, ou defasagem ao testar potenciais medicamentos antialérgicos ou vacinas, também pode ser adaptado para os sistemas canino ou equino humano, conforme mostrado, o ensaio pode determinar o bloqueio bem-sucedido ou malsucedido da liberação do mediador ao testar anticorpos antialérgicos.